Untersuchungen zum Ectodomain shedding des Receptor for advanced glycation endproducts

Zu den Liganden des Zelloberflächenrezeptors RAGE gehören AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und Aβ. RAGE wird daher eine Rolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie Diabetes, Arteriosklerose und Krebs zugesprochen. Des Weiteren geht eine Verringerung der Menge an sRAGE häufig mit diesen Krankheiten einher. Aus diesen Gründen stellt die pharmakologische Stimulierung der Proteolyse von RAGE eine vielversprechende Therapieform dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der sRAGE-Bildung über PAC1-, V2- und OT-Rezeptoren möglich ist. Die Untersuchung der PAC1-Signalwege zeigte, dass PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen, PI3-Kinase und der MAP-Kinase-Weg wichtig für die Stimulierung sind und dass der PKA-Weg nicht beteiligt ist. Die dreimonatige Behandlung von Mäusen mit PACAP-38 weist darauf hin, dass eine Stimulierung des Ectodomain Sheddings von RAGE auch in vivo erfolgen kann. Die Untersuchung der Signalwege, ausgehend von den V2- und OT-Rezeptoren, zeigte, dass ebenfalls PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen zur Aktivierung der Proteasen führen, dagegen konnte weder ein Einfluss des PKA- noch des MAP-Kinase-Weges festgestellt werden. Außerdem wurden sowohl MMP-9 als auch ADAM-10 als RAGE-spaltende Proteasen identifiziert. Die nähere Untersuchung der RAGE-Spaltstelle erbrachte, dass keine spezifische Sequenz, sondern vielmehr die Sekundärstruktur eine Rolle bei der Erkennung durch die Proteasen spielt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin ein anti-RAGE Antikörper anhand einer neu entwickelten Methode zunächst gereinigt und dann erfolgreich an ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiertes Polymer gekoppelt. Die Stimulierung der Proteolyse von Meprin β wurde auch untersucht und es konnte ebenfalls eine Beteiligung von ADAM-10 an der Spaltung nachgewiesen werden.

The ligands of the cell surface receptor RAGE are AGEs, S100 proteins, HMGB1 and Aβ. Therefore RAGE is linked with different neurological diseases as well as diabetes, arteriosclerosis and cancer. Furthermore, a decrease of the sRAGE amount is being accom-panied by these diseases. Thus, the pharmacological stimulation of proteolysis of RAGE is a promising therapy strategy. Within this doctoral thesis it was possible to stimulate shedding of RAGE by activating PAC1, V2 and OT receptors. The study of PAC1-associated signaling pathways demonstrated that PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+ signaling, PI3 kinase and MAP kinases are important for this stimulation; whereas PKA had no influence. The treatment of mice with PACAP-38 for three months resulted in an enhanced RAGE shedding in vivo. The analysis of V2 and OT receptor-associated signaling indicated that PKCα/PKCβI, CaMKII and Ca2+ signaling is also responsible for enhancing the protease activity; whereas PKA and MAP kinase had no effect. In addition, MMP-9 and ADAM-10 were identified to be the proteinases responsible for RAGE cleavage. Further investigation of the RAGE cleavage site revealed an important role for the secondary structure, which is recognized by proteinases. Within this thesis an anti-RAGE antibody was purified applying a new method and then coupled with a Rhodamin-conjugated polymer. In addition, stimulation of Meprin β shedding was analyzed and the involvement of ADAM-10 was demonstrated.