Untersuchung zur Temperaturabhängigkeit der O2-Bindungseigenschaft von Hämocyanin aus Arthropoden verschiedener Biotope

Die Evolution hat nur wenige O2-Transportproteine im Tierreich hervorgebracht. Sie alle nutzen entweder die Metallionen Fe2+ oder Cu2+ zur reversiblen Sauerstoffbindung in vier verschiedenen Typen von aktiven Zentren. Die Metallatome werden dabei über eine prosthetische Gruppe (Porphyrin-Ring) oder direkt (koordinativ) durch Histidine an die Proteinmatrix gebunden. Die Atmungsproteine sorgen für den Transport des Sauerstoffs von den respiratorischen Epithelien (Lunge, Kiemen), hin zu den O2 verbrauchenden Gewebszellen (oxidativer Stoffwechsel). Die Beladung mit Sauerstoff in den Lungen, bzw. den Kiemen sollte leicht und schnell, d.h. mit einer möglichst hohen O2-Affinität erfolgen. Die Arthropoden sind ein sehr artenreicher und erfolgreicher Tierstamm. Ihnen ist es im Laufe der Evolution gelungen, fast alle Lebensräume zu Wasser, auf dem Land und in der Luft zu besiedeln. Die Erschließung so unterschiedlicher Biotope setzt eine sehr gute physiologische Anpassungsfähigkeit voraus. Das physiologisch wichtigste Problem, welches für jeden Lebensraum während der Evolution gelöst werden mußte, ist eine optimale Sauerstoffversorgung der Körperzellen bei allen Umweltbedingungen zu gewährleisten. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, inwieweit verschiedene Arthropoden-Hämocyanine eine biotopabhängige (temperaturabhängige) Adaptation der O2-Versorgung (Proteinfunktion) auf Ebene des Hämocyaninmoleküls zeigen. Bei den hier untersuchten Hämocyaninen ließ sich eine signifikante Biotopabhängigkeit für den „Proteinfunktions-Parameter“ Kooperativität nachweisen.

Essentielle Thrombozythämie

Retrospektive Analyse von 189 Patienten mit einer ETH, Auswertung von Diagnostik, Therapie, Nebenwirkungen und Komplikationen.

Wertigkeit der Magnetresonanzangiographie der Fußgefäße unter Verwendung eines intravaskulären Kontrastmittels

In der vorliegenden Arbeit soll der Stellenwert der ce-MRA unter Verwendung von MS-325, einem neuen intravaskulären Kontrastmittel, bei der Untersuchung der Fußgefäße im Vergleich zur DSA bewertet, und das Übereinstimmen der Befunde zweier unterschiedlich erfahrener Untersucher untersucht werden. Im Rahmen einer klinischen Phase-III-Studie wurden 18 Patienten mit pAVK und / oder diabetischem Fußsyndrom rekrutiert. Die ce-MRA-Untersuchungen wurden in einem 1,5-Tesla-Magnetom durchgeführt. Dabei wurden dynamische Serien und eine hochaufgelöste Steady-state-Sequenz des zu untersuchenden Fußes akquiriert. Als Kontrastmittel wurde MS-325 in einer an das Körpergewicht adap-tierten Dosis appliziert. Die DSA-Untersuchung enthielt eine komplette Becken-Bein-Angiographie mit selektiver Darstellung der Fußgefäße. Vor der Befundung wurden die Bilddaten der MR-Angiographie nachbearbeitet und MIP-Projektionen erstellt. Zwei Untersucher befundeten unabhängig voneinander und in zufälliger Reinfolge die MRA, die DSA wurde in einem Konsensusverfahren beider Unter-sucher beurteilt. In eine qualitative Analyse gingen die Bewertung der Bildquali-tät, die Sichtbarkeit von sieben Gefäßsegmenten und deren hämodynamisch relevanter Stenosegrad ein. Quantitativ wurde das Signal-Rausch-Verhältnis und das Kontrast-Rausch-Verhältnis untersucht. Die Bildqualität beider Modalitäten wurde im Median mit gut bewertet. Hinsichtlich der Sichtbarkeit der Gefäßsegmente zeigte sich die ce-MRA der DSA überlegen. Von insgesamt 126 Gefäßsegmenten waren nur 80 in der DSA sichtbar, dagegen waren 106 Gefäßsegmente in der ce-MRA sichtbar (p-Wert <0,001, McNemar-Test). Die Übereinstimmung zwischen beiden Untersuchern der ce-MRA war sehr gut, beide erkannten 105 von 126 Gefäßsegmenten (Kappa-Maß κ=0,97). Beide Modalitäten werteten übereinstimmend 46 Gefäßsegmente als hämodynamisch relevant stenosiert. 16 Gefäßstenosen wurden durch die ce-MRA im Gegensatz zur DSA überbewertet. Zwischen Untersucher 1 und Untersucher 2 der ce-MRA fand sich erneut eine sehr gute Übereinstimmung (Kappa-Maß к = 0,89). Die Messungen des SNR und des CNR ergaben sowohl in den dynamischen Se-quenzen als auch in der später akquirierten hochaufgelösten Steady-state Unter-suchung hohe Werte. Die Bildqualität der hochaufgelösten Steady-state ce-MRA war hervorragend, jedoch beeinträchtigt venöse Überlagerung die Interpretation. In der Literatur wird die ce-MRA als ein geeignetes Verfahren zur Darstellung von Fußgefäßen beschrieben. Zahlreiche Studien zeigen, dass mit der ce-MRA mehr Gefäßsegmente dargestellt werden können. Dieses Ergebnis konnte in der vor-liegenden Arbeit bestätigt werden. Eine mit MS-325 verstärkte Magnetresonanz-angiographie der Fußgefäße ist der selektiven DSA überlegen. Die Tatsache, dass mit der ce-MRA mehr Gefäßsegmente dargestellt werden können, hat den Begriff des angiographisch „verborgenen“ Blutgefäßes initiiert. In vielen klini-schen Zentren hat die ce-MRA die DSA weitgehend verdrängt. Aus diesem Grund wird in der Literatur vorgeschlagen, dass die ce-MRA die DSA als einen „verbes-serten Goldstandard“ ersetzten könnte. Kann mit der DSA kein passendes An-schlussgefäß für eine Revaskularisationsmaßnahme mittels Bypass gefunden werden, so sollte auf jeden Fall eine ce-MRA der Fußgefäße durchgeführt wer-den, um eine Amputation zu verhindern. In der Literatur wird von der Änderung der Behandlungsstrategie nach der Durchführung der ce-MRA berichtet. Bei der Klassifikation von Gefäßstenosen wertet die ce-MRA öfter höher als die DSA, diese Überbewertung ist in der Literatur bekannt und konnte ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Diese Überschätzung resultiert aus „Spin-Dephasierung“ durch turbulente Blutströmung im Bereich einer Stenose oder besteht auf Grund von Partialvolumeneffekten. Die Verwendung eines intravaskulären Kontrastmittels, wie bsw. MS-325, zur MR-Angiographie bringt den Vorteil, dass sowohl dynamische als auch Steady-state Untersuchungen aller vaskulären Strukturen im menschlichen Körper durchge-führt werden können. Da eine hohe Signalintensität über einen langen Zeitraum besteht, können auch mehrere Körperregionen während einer einzigen Untersu-chung dargestellt werden. Nachteilig ist jedoch die Beeinträchtigung der Bildge-bung durch venöse Überlagerung. Mittels computergestützter Bildnachbearbeitung ist es jedoch möglich, Venen in Steady-state-Sequenzen zu unterdrücken und daraus ergibt sich die Möglichkeit, hochaufgelöste, überlage-rungsfreie Datensätze zu erhalten. Diese könnten dann der erste Schritt in Rich-tung einer Perfusionsbildgebung am Fuß sein, um bsw. den Erfolg von Revaskularisationsmaßnahmen auch auf Kapillarebene beurteilen zu können.

Der Einfluss von Hypothermie oder Dexmedetomidin auf den neuronalen Zelluntergang nach inkompletter zerebraler Hemisphärenischämie und Reperfusion bei der Ratte

Es ist bekannt, dass sowohl Hypothermie (HT) als auch Dexmedetomidin (DEX) das neurologische Endergebnis verbessern können. In dieser Studie wird der Einfluss von HT oder DEX auf den neuronalen Zelluntergang bei 104 Ratten nach inkompletter zerebraler Hemisphärenischämie durch unilaterale Karotis-Okklusion unter hämorrhagischer Hypotension und anschließender Reperfusion untersucht. In beiden Behandlungs-Gruppen zeigt sich gegenüber der Kontroll-Gruppe in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung eine tendentielle Reduktion des Ausmaßes der Schädigung und der Anzahl nekrotischer Zellen, in der immunhistologischen Färbung mit Antikörpern gegen aktivierte Caspase-3 eine tendentielle Verringerung apoptotischer Zellen. Diese Arbeit deutet darauf hin, dass sowohl HT als auch DEX den neuronalen Schaden nach zerebraler Ischämie tendentiell zu reduzieren vermögen.

Etablierung einer Ko-Kultur von Alveolarepithel und mikrovaskulärem Endothel als in-vitro-Modell einer humanen respiratorischen Einheit

Ziel der Promotionsarbeit war die Etablierung einer humanen respiratorischen Einheit in vitro zur Untersuchung von Wirkmechanismen einer akuten Lungenschädigung. Als Ko-Kulturmodell wurde eine Kultur humaner Alveoloarepithelzellen vom Typ II (A549, NCI H441, primäre hATII Zellen) mit mikrovaskulären Endothelzellen (ISO-HAS-1, primäre HPMEC) auf den beiden Seiten einer mikroporösen Filtermembran (Bilayer) gewählt. Ein differenzierter Monolayer von NCI H441 konnte in Bilayer-Ko-Kultur mit ISO-HAS-1 oder HPMEC durch die Zugabe von Dexamethason (1 µM) unter Verwendung eines serumhaltigen Mediums induziert werden. Dabei wurde eine von Tag 10 bis Tag 12 phänotypisch stabile Ko-Kultur mit TER-Werten um 500 Ohm x cm2 erhalten. Im Hinblick auf die Freisetzung von IL-8 und MCP-1 und die fehlende Freisetzung von RANTES nach Stimulation waren NCI H441 den hATII Zellen ähnlicher als die häufig als hATII-analog eingesetzte Zell-Linie A549, die RANTES freisetzte. Außerdem bildeten A549 trotz zahlreicher Variatione

Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.

Post-transkriptionelle Regulation der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase

Die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) wird sowohl über transkriptionelle als auch über post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. Dabei spielt die Modulation der iNOS-mRNA-Stabilität durch RNA-bindende Proteine eine bedeutende Rolle. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des p38-MAPK-Signaltransduktionsweges sowie der RNA-bindenden Proteine TTP, KSRP, HuR und PTB an der Regulation der iNOS-Expression dargestellt werden. Hemmung der p38-MAPK führte zu einer Reduktion der iNOS-mRNA-Expression, hatte aber keinen Effekt auf die iNOS-Promotoraktivität. Das RNA-bindende Protein Tristetraprolin (TTP) erhöhte die Stabilität der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation, ohne jedoch mit ihr zu interagieren. Die Proteinexpression von TTP war unter dem Einfluss von Zytokinen erhöht; Inhibition der p38-MAPK verursachte eine Verminderung der Zytokin-stimulierten TTP-Expression. Das „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) übte einen destabilisierenden Effekt auf die iNOS-mRNA aus. Der Abbau der mRNA wird dabei wahrscheinlich durch eine Zytokin-unabhängige Interaktion von KSRP mit dem Exosom vermittelt. Ebenso konnte zwischen KSRP und TTP eine Wechselwirkung beobachtet werden, die nach Induktion der iNOS-Expression mit Zytokinen verstärkt und durch p38-MAPK-Inhibitoren hemmbar war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA-3’-UTR für die Vermittlung des destabilisierenden Effekts essentiell ist. Eine genaue Lokalisierung der KSRP-Bindungsstelle ergab, dass KSRP ebenso wie HuR mit dem AU-reichen Element am 3’-Ende der 3’-UTR interagiert. KSRP und HuR sind in der Lage, um diese Bindungsstelle zu konkurrieren. Nach Zytokin-Stimulation war dementsprechend die endogene Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA vermindert, während die endogene Bindung von HuR an die iNOS-mRNA verstärkt war. Die Stabilisierung der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation ergibt sich demnach aus einer Verminderung der Bindung des KSRP-Exosom-Komplexes an die iNOS-mRNA als Folge der verstärkten Interaktion von TTP und KSRP. Dies ermöglicht parallel eine vermehrte Bindung von HuR an die iNOS-3’-UTR und führt damit zu einer Stabilisierung der iNOS-mRNA und so letztendlich auch zu einer Erhöhung der iNOS-Expression. Außerdem konnte eine Beteiligung des Polypyrimidin-Trakt-bindenden Proteins (PTB) an der Regulation der humanen iNOS-Expression gezeigt werden. PTB erhöhte die Expression der iNOS und interagierte Zytokin-unabhängig mit KSRP. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass ein Zusammenspiel verschiedener Proteine in einem komplexen Netzwerk für die fein abgestimmte Regulation der humanen iNOS-Expression auf post-transkriptioneller Ebene verantwortlich.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind für die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenströme über die Membran und dadurch Membranpotentialänderungen hervor. Diese noxisch induzierten Ströme sind in großem Ausmaß durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist für die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen geklärt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme führen. Hierfür wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin während der Präparation von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Ströme, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen für das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch Überspülen mit 45,3 bis 46,3°C heißer Extrazellularlösung applizierte einsekündige Hitzereize gemessen. Dabei ließen sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einwärtsströme von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone für zwei Sekunden mit Extrazellularlösung überspült, die Kontrolllösung, 0,5 μM Capsaicin, 10 μM Natriumnitroprussid oder 10 μM YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Strömen in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die für den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 μM löst Capsaicin für zwei Sekunden einen sehr kleinen Einwärtsstrom von etwa 33 pA aus und führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einwärtsströmen in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausmaß der Sensibilisierung ist proportional zur Größe des capsaicininduzierten Stromes (r=−0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellulären Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Ströme an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erhöhung der intrazellulären freien Calciumkonzentration abhängig. Funktionelle Änderungen der zellulären Funktion werden häufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen gehörende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 führt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazelluläres Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranständige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erklärbar. Durch Applikation zehnsekündiger Hitzereize lässt sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme auslösen, die ebenso ausgeprägt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 μM Capsaicin (p<0,005). Durch das immer größere Verständnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich ständig neue Ansätze für die Entwicklung neuer Analgetika. So könnte durch Modulation spezifischer intrazellulärer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK können der Forschung und später auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnen.

Vergleich intelligenter Nachbearbeitungsalgorithmen zur Quantifizierung des Lungenemphysems in Mehrschicht-CT-Datensätzen

Vergleich von Datensätzen,die mit Hilfe von den Programmen "Volume©","Pulmo©", "Yacta©" und PulmoFUNC(ILab) erstellt wurden. Dabei wurden jeweils die Lungen- und Emphysemvolumina verglichen, die mit den 4 Programmen ermittelt wurden. Außerdem wurde noch die mittlere Lungendichte als Mittelwert aller Lungenvoxel bestimmt. Zusätzlich wurde noch der Emphysemindex als Quotient aus Emphysem- und Lungenvolumina errechnet. Die Programme waren unterschiedlich benutzerfreundlich in der Bearbeitung: Die weitestgehend manuell zu bearbeitenden Programme Volume© und Pulmo© benötigten zur Bearbeitung deutlich mehr Zeit als die überwiegend automatisch arbeitenden Programme Yacta und PulmoFUNC(ILab).

Sahaja Yoga im Vergleich mit der Progressiven Muskelrelaxation nach Jacobson

Fragestellung: In der vorliegenden Arbeit wird erstmals das Sahaja Yoga (SY) bezüglich seiner Effektivität in der komplementären Behandlung von Patienten mit Mamma- oder Prostatakarzinom untersucht und mit der Progressiven Muskelrelaxation nach Jacobson (PMR) verglichen. Methoden: Zu diesem Zweck wurden 16 Patienten mit Prostatakarzinom und 21 Patientinnen mit Mammakarzinom im Rahmen einer stationären Anschlußheilbehandlung (AHB) rekrutiert und jeweils mittels Zufallstabelle entweder einer SY-Gruppe oder einer PMR-Gruppe zugeteilt. Die Patienten übten während des dreiwöchigen Aufenthalts zusätzlich zu den jeweiligen physikalischen und physiotherapeutischen Therapien die entsprechenden Entspannungsverfahren (SY oder PMR) insgesamt acht mal und wurden dazu angehalten, die Verfahren auch in Eigenregie fortzuführen. Die Patienten füllten zu Beginn ihres Aufenthaltes (t1), nach 3 Wochen (Ende der AHB, t2) sowie 2 Monate nach dem Beenden der AHB (t3) folgende Fragebögen aus: den SF-36 von Bullinger et al. (1995) zur Erfassung von gesundheitsbezogener Lebensqualität, die HADS von Hermann et al. (1995) zur Erfassung von Angst und Depressivität und zwei vom Autor selbstkonzipierte Fragebögen, mit denen die Anzahl und Dauer der durchgeführten Übungen registriert wurden. Den MDBF von Steyer et al. (1997) (für aktuelle Befindlichkeit) füllten die Patienten jeweils direkt vor und nach der ersten (t1v und t1n) und letzten (t2v und t2n) Entspannungsübung und zum Zeitpunkt t3 aus. Ergebnisse: Fast alle Testwerte des Gesundheitsfragebogens SF-36 steigen (teils statistisch signifikant) bei beiden Gruppen von dem Zeitpunkt t1 über t2 zu t3 an. Es scheinen zwar die Verbesserungen der SY-Gruppe gegenüber der PMR-Gruppe etwas zu überwiegen, statistisch konnte dies jedoch nicht belegt werden. Bei den Subskalen der HADS (Angst und Depression) fallen die Werte bei beiden Gruppen von Zeitpunkt t1 über t2 zu t3 ab, statistisch signifikant ist der Abfall jedoch nur von t1 zu t2 bei den Werten der HADS-D (Depression) bei der SY-Gruppe. Die Testwerte sinken bei der SY-Gruppe im Verlauf etwas steiler ab als die Testwerte der PMR-Gruppe, signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen lassen sich jedoch nicht finden. Die Testwerte des MDBF (Kurzform A) steigen von dem Zeitpunkt t1v über t2v zu t3 bei beiden Gruppen (bei der SY-Gruppe etwas steiler, jedoch ohne signifikanten Unterschied zur PMR-Gruppe) nur zum Teil signifikant an. Die Werte vor und nach den jeweiligen Anwendungen (Zeitpunkt t1v zu t1n und t2v zu t2n) unterscheiden sich signifikant bei beiden Gruppen. Bezüglich der Dauer und Anzahl der durchgeführten Anwendungen zeigen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Schlußfolgerungen: Die Patienten konnten beide Verfahren gleich gut annehmen. Bezüglich der gesundheitsbezogenen Lebensqualität, Angst und Depressivität sowie der aktuellen Befindlichkeit scheint sowohl das SY als auch die PMR (in dieser Studie) relevante Effekte zu haben. Diese Effekte scheinen sich auch nach 2 Monaten weiter positiv auszuwirken. Statistisch ließen sich zwischen beiden Verfahren keine Unterschiede hinsichtlich ihrer Wirkung belegen. Die Ergebnisse müssen allerdings durch weitere Untersuchungen mit größerer Probandenzahl genauer geprüft werden.

Neue palliative Therapieoptionen des kolorektalen Karzinoms

6. Zusammenfassung In der palliativen Therapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms gibt es durch die Verbesserung der klassischen Therapien und die Entwicklung neuer Strategien inzwischen eine Vielzahl von Behandlungsoptionen. Die zwei Studien dieser Arbeit untersuchen das „älteste“ eingesetzte Zytostatikum in der Therapie des Kolonkarzinom, 5-Flurouracil, einmal in der Zweitlinientherapie als Hochdosisinfusionstherapie mit und Biomodulation mit Folinsäüre und einmal als Erstlinientherapie in Kombination mit Irinotecan im FOLFIRI-Protokoll. In der Zweitlinienbehandlung ergab sich hierbei ein geringer Vorteil in den Krankheitskontrollraten (57% vs. 44%) bei vergleichbaren Ansprechraten für die längere 5-FU-Infusion ohne Biomodulation. Bezüglich des Gesamtüberleben ab Beginn der Zweitlinientherapie und des Progressionsfreien Überleben zeigte die nicht biomodulierte Gruppe bessere, statistisch jedoch nicht signifikante Ergebnisse (16 vs. 9 bzw. 7,5 vs. 6 Monate). In der Erstlinientherapie erreichten wir eine Tumorkontrollrate von 74%, 4 komplette Remissionen (11%) und bei 3 Patienten die Möglichkeit einer Nachresektion der Lebermetastasen mit kurativem Ansatz. Der neoadjuvante Einsatz dieser Therapie sollte aufgrund dieser Ergebnisse weiter untersucht werden. Das Gesamtüberleben lag bei 17 Monaten (i.r. 9-25 Monate), die progressionsfreie Zeit mit 7 Monaten lag im Bereich unserer Zweitlinienstudie. Für beide Therapien befand sich die Toxizität im Rahmen der Erwartungen, die Symptome waren reversibel und im Allgemeinen akzeptabel. Ein Vergleich der Lebensqualität vor und während der Erstlinientherapie ergab für unsere Patienten keine deutlichen Veränderungen. Die Ergebnisse unserer untersuchten Studien zeigen, dass beide Therapien wirksame und gut verträgliche Optionen in der palliativen Behandlung des kolorektalen Karzinoms darstellen. Für jeden Patienten sollte aus der Vielzahl der bestehenden Möglichkeiten die für ihn bestmögliche individuelle Therapie ermittelt werden.

Functionalized surfaces and surface functionalization of nanomaterials

Nature leads, we follow. But nanotechnologists are in hot pursuit, in designing controllable structures that can mimic naturally occurring and artificially synthesized materials on a common platform. The supramolecular chemistry concerns the investigation of nature principles to produce fascinating complexed and functional molecular assemblies, as well as the utilization of these principles to generate novel devices and materials, potentially useful for sensing, catalysis, transport and other applications in medical or engineering science. The work presented in this thesis is a compilation of different synthetic methods to achieve inorganic-organic hybrid nanomaterials. Silicatein, a protein enzyme, which acts both as a catalyst and template for the formation of silica needles in marine sponges, has been used for the biosynthesis of semiconductor metal oxides on surfaces. Silicatein was immobilized on gold (111) surfaces using alkane thiol, as well as on a novel self-assembly of NTA on top of a “cushion” of reactive ester polymer has been successfully employed to make functionalised surfaces. The immobilization of silicatein on surfaces was monitored by surface plasmon spectroscopy, atomic force microscopy and confocal laser scanning microscopy. Surface bound silicatein retains its biocatalytic activity, which was demonstrated by monitoring its hydrocatalytic activity to catalyse the synthesis of biosilica, biotitania, and biozirconia. The synthesis of semiconductor metal oxides was characterized using scanning electron microscopy. This hydrolytic biocatalyst is used to synthesize the gold nanoparticles. The gold nanoparticles are formed by reduction of tetrachloroaurate, AuCl4-, by the action of sulfhydryl groups hidden below the surface groups of the protein. The resulting gold nanoparticles which are stabilized by surface bound silicatein further aggregate to form Au nanocrystals. The shape of the nanocrystals obtained by using recombinant silicatein is controlled through chiral induction by the protein during the nucleation of the nanocrystals. As an extension of this work, TiO2 nanowires were functionalized using polymeric ligand which incorporates the nitrilotriacetic acid (NTA) linker in the back bone to immobilize His-tagged silicatein onto the TiO2 nanowires. The surface bound protein not only retains its original hydrolytic properties, but also acts as a reductant for AuCl4- in the synthesis of hybrid TiO2/silicatein/Au nanocomposites. Functionalized, monocrystalline rutile TiO2 nanorods were prepared from TiCl4 in aqueous solution in the presence of dopamine. The surface bound organic ligand controls the morphology as well as the crystallinity and the phase selection of TiO2. The surface amine groups can be tailored further with functional molecules such as dyes. As an example, this surface functionality is used for the covalent binding of a fluorescent dye,4-chloro-7- nitrobenzylurazene (NBD) to the TiO2 nanorods. The polymeric ligands have been used successfully for the in-situ and post-functionalization of TiO2 nanoparticles. Besides to chelating dopamine anchor group the multifunctional ligand system presented here incorporates a modifier molecule which allows the binding of functional molecules (here the dyes pyrene, NBD, and Texas Red) as well as additional entities which allow tailoring the solubility of inorganic nanocrystals in different solvents. A novel method for the surface functionalization of fullerene-type MoS2 nanoparticles and subsequently binding these nanoparticles onto TiO2 nanowires has been reported using polymeric ligands. The procedure involves the complexation of IF-MoS2 with a combination of Ni2+ via an umbrella-type nitrilotriacetic acid (NTA) and anchoring them to the sidewalls of TiO2 nanowires utilizing the hydroxyl groups of dopamine present in the main contents of polymeric ligand. A convenient method for the synthesis of Au/CdS nanocomposites has been presented, which were achieved through the novel method of thiol functionalization of gold colloids. The thermodynamically most stable phase of ZrO2 (cubic) has been obtained at much lower temperature (180°C). These nanoparticles are highly blue fluorescent, with a high surface area.

Sprühgetrocknete Polylaktid, Poly(laktid-co-glykolid) Mikropartikel zur Steuerung der Freisetzung aus pulmonalen Arzneiformen

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, pharmazeutisch-technologische Möglichkeiten der Retardierung bei ausgewählten Antiasthmatika zur pulmonalen Applikation anzuwenden. Dafür sollten Mikropartikel hergestellt und pharmazeutisch sowie biopharmazeutisch charakterisiert werden. Als Modellsubstanzen werden das Glukokortikoid Budesonid und das β2-Sympathomimetikum Salbutamol in Form seiner Base und seines Salzes verwendet. Die Auswahl erfolgt nach physikochemischen (Lipophilie, Molekulargewicht) und therapeutischen (Halbwertszeit der Wirkung, Applikationsfrequenz) Gesichtspunkten. Mikropartikel auf Polymerbasis ermöglichen eine kontrollierte Freigabe der Arzneistoffe über einen vorausbestimmten Zeitraum. Es erfolgt die Auswahl physiologisch unbedenklicher Hilfsstoffe (Polylaktide R 202H/ Poly(laktid-co-glykolide) RG 502H, RG 752-S) mit unterschiedlichen Anteilen an Coglykolid sowie unterschiedlichen Molekulargewichten, die sich prinzipiell zur Verzögerung der Freisetzung eignen und sich bei der parenteralen Applikation bereits bewährt haben. Die Sprühtrocknung wird als geeignetes pharmazeutisch-technologisches Verfahren zur Präparation von Mikropartikeln im Teilchengrößenbereich von 1- 10 Mikrometern beschrieben, welche den Wirkstoff mit möglichst hoher Beladung verkapselt. Die sprühgetrockneten Pulver sollen pharmazeutisch physikochemisch mittels Rasterelektronenmikroskopie (Morphologie), Laserdiffraktometrie (Teilchengrößenverteilung), DSC und Röntgenpulverdiffraktometrie (thermisches Verhalten) und mittels Stickstoff-Tief-Temperatur Adsorptionsverfahren (spezifische Oberfläche) charakterisiert werden. Zusätzlich wird die Wirkstoffbeladung der sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikel mittels HPLC ermittelt. Die biopharmazeutische Charakterisierung der sprühgetrockneten Pulver erfolgt über die in-vitro Freigabekinetik und die Stabilität der Mikropartikel. Zusätzlich werden Versuche an Zellkulturen und in-vivo Versuche an Mäusen durchgeführt, um die Effekte der sprühgetrockneten Mikropartikel und des Hilfsstoffs hinsichtlich der Freisetzungsretardierung zu testen. Bei den in-vivo Versuchen werden der Atemwegswiderstand und die Verlängerung der exspiratorischen Phase (penh) als Parameter für einen antiasthmatischen Effekt gewählt. Die Lungenlavage Flüssigkeit wird zusätzlich überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung möglich ist, Polymer-Mikropartikel herzustellen, die aufgrund ihrer Partikelgröße von d50 ≤ 5,8 µm fähig sind, die unteren Abschnitte der Lunge zu erreichen. Die Morphologie der Mikropartikel ist abhängig vom zu versprühenden Produkt. Thermodynamisch und röntgenpulverdiffraktometrisch betrachtet handelt es sich um amorphe Produkte, die aber über lange Zeit in diesem Zustand stabil sind. Die Wiederfindung der eingesetzten Arzneistoffmenge in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln und die Freigabeversuche zur Charakterisierung der Retardierungseigenschaften der verwendeten Polymere ergeben, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung von Budesonid und Salbutamol mit den Polymeren möglich ist, retardierende Mikropartikel herzustellen. Die Wiederfindung von Budesonid und Salbutamol in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln entspricht nahezu der eingesetzten Menge. Bei Salbutamolsulfat ist dies nicht der Fall. In Zellkulturversuchen der murinen Zellinie RAW 264.7 ergaben sich Hinweise darauf, dass bei Konzentrationen von 10-6 M und 10-8 M, die Downregulation der IL-6 Konzentration durch die Sprüheinbettung von 9,1 % Budesonid mit PLGA in stärkerem Ausmaß erfolgte, als bei unverkapseltem Budesonid. Zusätzlich wurden in-vivo Versuche mit intranasaler und intraperitonealer Gabe durchgeführt. Die Budesonid-Polymer Sprüheinbettung wurde mit unverkapseltem Budesonid vergleichen. Nach intraperitonealer Gabe hatte die Sprüheinbettung mit Budesonid die besten Effekte hinsichtlich der Unterdrückung des penh und des Atemwegswiderstands auch bei steigenden Metacholinkonzentrationen. Die Auswertung der Lungenlavage Flüssigkeit zeigt sehr deutlich die Downregulation der IL-6 Konzentration in der Lunge durch die Sprüheinbettung mit Budesonid. Zur Zeit werden Vorbereitungen getroffen, ein Gerät zu testen, das in der Lage ist, ein Mikrospray zu generieren, so dass eine intratracheale Verabreichung möglich wäre.

Knock down von Desmoglein 2 durch induzierbare Cre-spezifische Rekombination in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen, die benachbarte Zellen durch Verankerung mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts miteinander verknüpfen und so Zellen und Geweben Stabilität verleihen. Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen Cadherine. Diese transmembranen Glykoproteine gehen im Interzellulärraum Verbindungen mit den desmosomalen Cadherinen der Nachbarzelle ein und sind im zytoplasmatischen Bereich Anheftungspunkte für weitere an der Desmosomenbildung beteiligte Proteine. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Desmoglein 2 (Dsg 2), einem in allen Epithelien exprimierten desmosomalen Cadherin. Da der konstitutive knock out von Dsg 2 embryonal letal ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine transgene Maus generiert, in der die Reduktion von Dsg 2 temporär regulierbar war (konditionaler knock down). Dazu wurde der Mechanismus der RNA Interferenz genutzt, wodurch Sequenz-spezifische, post-transkriptionelle Regulation von Genen möglich ist. Unter Verwendung eines über Cre/lox-induzierbaren Vektors wurden transgene Mäuse generiert, welche nach Induktion Dsg 2 shRNA exprimieren, die in der Zelle in siRNA umgewandelt wird und zum Abbau der Dsg 2 mRNA führt. Durch Verpaarung der generierten Dsg 2 knock down Maus mit der über Tamoxifen induzierbaren Cre Deleter knock in Mauslinie Rosa26CreERT2 konnte deutliche Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge in Leber, Darm und Herz erreicht werden. In Immunfärbungen der Leber wurde zudem eine reduzierte Desmosomenbildung durch Expression der Dsg 2 shRNA detektiert. Die für diese Versuche generierte und getestete Rosa26CreERT2 Mauslinie ermöglichte jedoch nicht in allen Zellen eines Gewebes die komplette Aktivierung der Cre Rekombinase und damit die Expression der shRNA. Dadurch entstanden mosaikartige Wildtyp/knock down-Gewebe, in denen noch ausreichend Desmosomen gebildet wurden, um die Gewebestabilität und -struktur zu erhalten. Für eine funktionale Untersuchung von Dsg 2 in Zusammenhang mit der chronisch entzündlichen Darmerkrankung Colitis ulcerosa wurden die Dsg 2 knock down Mäuse mit Darm-spezifischen, induzierbaren Cre Deleter Mäusen (VillinCreERT2) verpaart. Nach Aktivierung der Cre Rekombinase mittels Tamoxifen wurde in bitransgenen Tieren über Gabe von Azoxymethan (AOM) und Dextransodiumsulfat (DSS) Colitis ulcerosa induziert. Diese entzündliche Erkrankung des Darms ist mit der Induktion von Darmtumoren assoziiert. Bereits nach einmaliger Induktion mit AOM/DSS wurde in der ersten endoskopischen Untersuchung eine starke Entzündung des Darmgewebes und die Ausbildung von flächig wachsenden Tumoren in den Dsg 2 knock down Tieren hervorgerufen. Es ist anzunehmen, dass durch knock down von Dsg 2, und die damit verbundene verminderte Desmosomenbildung und Zelladhäsion, Infiltration von Bakterien durch die epitheliale Barriere des Darms möglich war, und so die Entzündungsreaktion in der Darmmukosa verstärkte. In Zusammenhang mit Verlust der epithelialen Festigkeit durch verringerte Zellkontakte kam es zur Hyperproliferation der Darmmukosa, die sich in Ausbildung von flächigen Tumoren äußerte. In weiteren Experimenten müssen nun die Tumore und das entzündete Gewebe der Colitis-induzierten Mäuse mittels Immunfluoreszenz untersucht werden, um Veränderungen in der Desmosomenformation in situ detektieren zu können. Des Weiteren sind Verpaarungen der Dsg 2 knock down Maus mit anderen Cre Rekombinase exprimierenden Mauslinien möglich, um den Einfluss von Dsg 2 auch in anderen Geweben, beispielsweise im Herzen, zu untersuchen. Die hier vorgelegte Arbeit zeigt also erstmalig den ursächlichen Zusammenhang zwischen Dsg 2 und dem Auftreten von Colitis-assoziierten Tumoren in einem konditionalen RNAi-vermittelten knock down Tiermodell. Die Etablierung dieser Maus ist somit das erste konditionale Mausmodell, welches die bei vielen Krebspatienten gefundenen flachzellig wachsenden Tumore in vivo rekapituliert. Vorausschauend kann man sagen, dass mit Hilfe des im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten Tiermodells wichtige Erkenntnisses über die Pathologie von Darmtumoren erbracht werden können, die unser Verständnis der Colitis-induzierten Tumorentstehung verbessern.