Beiträge zur Chemie der schwersten Elemente in den Bereichen Elektrochemie und Chromatographie

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Experimente auf verschiedenen Gebieten der chemischen Charakterisierung der schwersten Elemente durchgeführt. So wurden Vorarbeiten zur Elektrochemie der superschweren Elemente geleistet. Hier konnte gezeigt werden, dass sich Po aus verdünnten Säuren auf Metallelektroden spontan abscheiden lässt. Als wichtigste Reaktionsparameter wurden Temperatur, Konvektion und Viskosität des Elektrolyten identifiziert. Für die Elektrodeposition ist es von Bedeutung, reproduzierbar saubere Elektroden einzusetzen. Auch hierzu konnten Erkenntnisse gewonnen werden. Auf dem Gebiet der Charakterisierung von Nukliden wurde der Elektroneneinfang in Db-263 untersucht. Aus diesem Zerfall geht Rf-263 hervor, welches mit einer Halbwertszeit von 15min überwiegend durch Spontanspaltung zerfällt. Im Experiment wurde Rf-263 mittels Ionenaustauschchromatographie und nachfolgender Flüssig-Flüssig-Extraktion von Db und Aktiniden getrennt. Das erhaltene Präparat wurde auf Alpha-Zerfall und Spontanspaltung untersucht. Die Zahl der Rf-263 Zerfälle lässt auf einen Zerfallszweig durch Elektroneneinfang in Db-263 von 3% schließen. Ein Großteil der Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung des Kd-Wertes von Sg am Anionenaustauscher Aminex A27 in 0.1M HNO3/5E-3M HF. Beim mit dem ALOHA-System durchgeführten Experiment wurde die Mehrsäulentechnik (MCT) erstmals für die wässrige Chemie von Sg genutzt. Aufgrund zahlreicher Probleme konnte letztlich kein Kd-Wert bestimmt werden. Stattdessen wurde das Experiment einer Fehleranalyse unterzogen. Hier zeigte sich eine Anfälligkeit der MCT auf natürliche Radionuklide. Weiterhin konnten Probleme bei ALOHA aufgedeckt werden, die eine Wiederholung des Experiments ausschlossen. In der Folge wurde ein alternativer Anionenaustauscher charakterisiert, sowie die Elektrolysebedingungen, als wichtiger Schritt der chemischen Aufarbeitung bei der MCT, genauer spezifiziert.

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Der Einsatz elektrochemischer Methoden für die Untersuchung superschwerer Elemente

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Experimentaufbaus für die elektrochemische Abscheidung von Transactiniden mit anschließender Detektion. Zu diesem Zweck wurden Experimente mit den Homologen dieser Elemente durchgeführt. Die Elektrodeposition von Tracermengen an Fremdelektroden führt zu einer Elektrodenbedeckung von weniger als einer Monolage. Die erforderlichen Abscheidepotentiale sind häufig positiver, als nach der Nernst’schen Gleichung zu erwarten ist. Dieses Phänomen nennt man Unterpotentialabscheidung. In zahlreichen Versuchen mit Radiotracern wurde die Abscheideausbeute als Funktion des Elektrodenpotentials bestimmt, wobei abzuscheidendes Ion, Elektrodenmaterial und Elektrolyt variiert wurden. Es wurden kritische Potentiale, bei denen eine nennenswerte Abscheidung gerade begann, ermittelt sowie Potentiale für die Abscheidung von 50 % der in der Lösung befindlichen Atome. Diese Werte wurden mit theoretisch vorhergesagten Potentialen und Werten aus der Literatur verglichen. Die Abscheidung von Pb als Homologem von Element 114 funktionierte sehr gut an Elektroden aus Palladium oder palladinierten Nickelelektroden unter Verwendung von 0,1 M HCl als Elektrolyt. Zur Charakterisierung der Unterpotentialabscheidung wurde neben der Radiotracer-Methode auch die Cyclovoltammetrie eingesetzt. Hier findet die Abscheidung der ersten Monolage auf der Elektrode ebenfalls häufig bei positiveren Potentialen statt, als die der Hauptmenge. Die mit beiden Methoden ermittelten Werte wurden einander gegenübergestellt. Die Elektrodeposition von kurzlebigen Isotopen muss sehr schnell erfolgen. Es konnte gezeigt werden, dass eine hohe Temperatur und damit verbunden eine niedrige Viskosität des Elektrolyten die Abscheidung beschleunigt. Ebenfalls wichtig ist ein gutes Rühren der Lösung, um eine kleine Nernst’sche Diffusionsschichtdicke zu erzielen. Das Verhältnis von Elektrodenfläche zu Elektrolytvolumen muss möglichst groß sein. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde eine für schnelle Elektrolysen optimierte Elektrolysezelle entwickelt. Unter Einsatz dieser Zelle wurden die Abscheidegeschwindigkeiten für verschiedene Ionen- und Elektrodenkombinationen gemessen. Es wurden Experimente zur Kopplung von Gasjet und Elektrolysezelle durchgeführt, dabei wurde sowohl mit am Reaktor erzeugten Spaltprodukten, mit Pb-Isotopen aus einer emanierenden Quelle und mit am Beschleuniger erzeugten Isotopen gearbeitet. Mit den dort gewonnenen Erkenntnissen wurde ein Experimentaufbau für die kontinuierliche Abscheidung und Detektion von kurzlebigen Isotopen realisiert. Am Beschleuniger wurden u. a. kurzlebige Hg- und Pb-Isotope erzeugt und mit einem Gasjet aus der Targetkammer zum ALOHA-System transportiert. Dort wurden sie in einem quasi-kontinuierlichen Prozess in die wässrige Phase überführt und zu einer Elektrolyszelle transportiert. In dieser erfolgte die Elektrodeposition auf eine bandförmige Elektrode aus Nickel oder palladiniertem Nickel. Nach der Abscheidung wurde das Band zu einer Detektorphalanx gezogen, wo der -Zerfall der neutronenarmen Isotope registriert wurde. Es wurden charakteristische Größen wie die Abscheidegeschwindigkeit und die Gesamtausbeute der Elektrolyse ermittelt. Das System wurde im Dauerbetrieb getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der gewählte Aufbau prinzipiell für die Abscheidung von kurzlebigen, am Beschleuniger erzeugten Isotopen geeignet ist. Damit ist eine wichtige Voraussetzung für den zukünftigen Einsatz der Methode zum Studium der chemischen Eigenschaften der superschweren Elemente geschaffen.

Sprühgetrocknete Polylaktid, Poly(laktid-co-glykolid) Mikropartikel zur Steuerung der Freisetzung aus pulmonalen Arzneiformen

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, pharmazeutisch-technologische Möglichkeiten der Retardierung bei ausgewählten Antiasthmatika zur pulmonalen Applikation anzuwenden. Dafür sollten Mikropartikel hergestellt und pharmazeutisch sowie biopharmazeutisch charakterisiert werden. Als Modellsubstanzen werden das Glukokortikoid Budesonid und das β2-Sympathomimetikum Salbutamol in Form seiner Base und seines Salzes verwendet. Die Auswahl erfolgt nach physikochemischen (Lipophilie, Molekulargewicht) und therapeutischen (Halbwertszeit der Wirkung, Applikationsfrequenz) Gesichtspunkten. Mikropartikel auf Polymerbasis ermöglichen eine kontrollierte Freigabe der Arzneistoffe über einen vorausbestimmten Zeitraum. Es erfolgt die Auswahl physiologisch unbedenklicher Hilfsstoffe (Polylaktide R 202H/ Poly(laktid-co-glykolide) RG 502H, RG 752-S) mit unterschiedlichen Anteilen an Coglykolid sowie unterschiedlichen Molekulargewichten, die sich prinzipiell zur Verzögerung der Freisetzung eignen und sich bei der parenteralen Applikation bereits bewährt haben. Die Sprühtrocknung wird als geeignetes pharmazeutisch-technologisches Verfahren zur Präparation von Mikropartikeln im Teilchengrößenbereich von 1- 10 Mikrometern beschrieben, welche den Wirkstoff mit möglichst hoher Beladung verkapselt. Die sprühgetrockneten Pulver sollen pharmazeutisch physikochemisch mittels Rasterelektronenmikroskopie (Morphologie), Laserdiffraktometrie (Teilchengrößenverteilung), DSC und Röntgenpulverdiffraktometrie (thermisches Verhalten) und mittels Stickstoff-Tief-Temperatur Adsorptionsverfahren (spezifische Oberfläche) charakterisiert werden. Zusätzlich wird die Wirkstoffbeladung der sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikel mittels HPLC ermittelt. Die biopharmazeutische Charakterisierung der sprühgetrockneten Pulver erfolgt über die in-vitro Freigabekinetik und die Stabilität der Mikropartikel. Zusätzlich werden Versuche an Zellkulturen und in-vivo Versuche an Mäusen durchgeführt, um die Effekte der sprühgetrockneten Mikropartikel und des Hilfsstoffs hinsichtlich der Freisetzungsretardierung zu testen. Bei den in-vivo Versuchen werden der Atemwegswiderstand und die Verlängerung der exspiratorischen Phase (penh) als Parameter für einen antiasthmatischen Effekt gewählt. Die Lungenlavage Flüssigkeit wird zusätzlich überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung möglich ist, Polymer-Mikropartikel herzustellen, die aufgrund ihrer Partikelgröße von d50 ≤ 5,8 µm fähig sind, die unteren Abschnitte der Lunge zu erreichen. Die Morphologie der Mikropartikel ist abhängig vom zu versprühenden Produkt. Thermodynamisch und röntgenpulverdiffraktometrisch betrachtet handelt es sich um amorphe Produkte, die aber über lange Zeit in diesem Zustand stabil sind. Die Wiederfindung der eingesetzten Arzneistoffmenge in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln und die Freigabeversuche zur Charakterisierung der Retardierungseigenschaften der verwendeten Polymere ergeben, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung von Budesonid und Salbutamol mit den Polymeren möglich ist, retardierende Mikropartikel herzustellen. Die Wiederfindung von Budesonid und Salbutamol in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln entspricht nahezu der eingesetzten Menge. Bei Salbutamolsulfat ist dies nicht der Fall. In Zellkulturversuchen der murinen Zellinie RAW 264.7 ergaben sich Hinweise darauf, dass bei Konzentrationen von 10-6 M und 10-8 M, die Downregulation der IL-6 Konzentration durch die Sprüheinbettung von 9,1 % Budesonid mit PLGA in stärkerem Ausmaß erfolgte, als bei unverkapseltem Budesonid. Zusätzlich wurden in-vivo Versuche mit intranasaler und intraperitonealer Gabe durchgeführt. Die Budesonid-Polymer Sprüheinbettung wurde mit unverkapseltem Budesonid vergleichen. Nach intraperitonealer Gabe hatte die Sprüheinbettung mit Budesonid die besten Effekte hinsichtlich der Unterdrückung des penh und des Atemwegswiderstands auch bei steigenden Metacholinkonzentrationen. Die Auswertung der Lungenlavage Flüssigkeit zeigt sehr deutlich die Downregulation der IL-6 Konzentration in der Lunge durch die Sprüheinbettung mit Budesonid. Zur Zeit werden Vorbereitungen getroffen, ein Gerät zu testen, das in der Lage ist, ein Mikrospray zu generieren, so dass eine intratracheale Verabreichung möglich wäre.

Identifizierung und interindividuelle Expressionsvariabilität der hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen

Die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen befassen sich mit der Identifizierung des haupt-metabolisierenden Enzyms für die Reaktion von dem Zytostatikum Doxorubizin zu dem Alkohol-Metaboliten Doxorubizinol in humanem Leberzytosol. Der Metabolismus dieser Reaktion wurde in einer humanen Leberbank analysiert, welcher eine große interindividuelle Variabilität zeigte. Da die maximale Umsatzrate häufig proportional zu der Expression des umsetzenden Enzyms in Leber ist, wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster der Kandidatenenzyme, verschiedene Carbonyl reduzierende Enzyme (AKRs und CBRs), ermittelt und des Weiteren der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol in verschiedenen humanen Organen gemessen. Die metabolische Clearance der Reaktion als auch die Affinität zu Doxorubizin war am höchsten in Dünndarm, Leber und Niere, während die anderen Organe wesentlich geringere Werte zeigten. Dies steht im Einklang mit der prominenten Rolle dieser Organe in der Detoxifizierung von Fremdstoffen. Auch der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol wurde von den verschiedenen Enzymen in sehr unterschiedlichem Maß katalysiert. AKR1C3 und CBR1 zeigten einen ausgeprägten Metabolismus von Doxorubizin während AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10 und AKR1C4 nur geringen Maximalumsatz zeigten. Auch die Affinität von CBR1 und AKR1C3 zu Doxorubizin war wesentlich höher als die der anderen Enzyme. Inhibitoruntersuchungen zeigten weiterhin, dass ein spezifischer CBR1-Inhibitor die untersuchte Reaktion durch CBR1 als auch durch humanes Leberzytosol in gleichem Maße hemmte. Dieses Ergebnis deutet auf CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase hin. Dies wurde in anfangs erwähnter humaner Leberbank weiter untersucht. Der Gehalt von CBR1-Protein wurde bestimmt und mit der gemessenen spezifischen Aktivität korreliert. Der Proteingehalt korrelierte mit der gemessenen spezifischen Aktivität in sechs von neun Western Blots. Dieses Ergebnis unterstützt die Vermutung, dass CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase in humaner Leber betrachtet werden kann. Die Analyse des CBR1-Gens zeigte zwei Haplotypen, die einen signifikant verschiedenen Km-Wert zeigten als die übrigen Haplotypen. Diese Haplotypen konnten jedoch nur einen geringen Teil der Variabilität des Doxorubizin-Metabolismus erklären. Da aber ein starker interindividueller Doxorubizin-Metabolismus in humaner Leber beobachtet wird, deutet dies auf eine starke epigenetische Regulation des CBR1-Gens hin. Analysen der Promoterregion zeigten viele Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren; eine Aktivierung durch xenobiotische Substanzen kann vermutet werden. Der Metabolismus von Doxorubizin kann zu einer Deaktivierung des Medikaments und damit zu einer verminderten chemotherapeutischen Wirkung führen. Durch die Charakterisierung der humanen Doxorubizin-Reduktase in Leber ist die gezielte Suche nach Hemmstoffen für dieses Enzym möglich. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Bildung von Doxorubizin zu Doxorubizinol zu verringern und die Inaktivierung der antineoplastischen Wirkung zu vermeiden. Eine Dosisverminderung und bessere Verträglichkeit des Medikaments kann erreicht, die schweren Nebenwirkungen reduziert werden. Die Identifizierung der verantwortlichen hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen kann somit einen wichtigen Beitrag leisten, die Krebstherapie in Zukunft verträglicher und nebenwirkungsfreier zu gestalten und Resistenzbildungen vorzubeugen.

Entwicklung und Charakterisierung eines Laserablationsmassenspektrometers zur Echtzeit-Analyse von atmosphärischen Aerosolpartikeln

Das Aerosolmassenspektrometer SPLAT (Single Particle Laser Ablation Time-of-Flight Mass Spectrometer) ist in der Lage, die Größe einzelner Aerosolpartikel in einem Größenbereich von 0,3 µm bis 3 µm zu bestimmen und gleichzeitig chemisch zu analysieren. Die Größenbestimmung erfolgt durch Streulichtmessung und Bestimmung der Flugzeit der Partikel zwischen zwei kontinuierlichen Laserstrahlen. Durch Kalibrationsmessungen kann auf den aerodynamischen Durchmesser der Partikel geschlossen werden. Kurzzeitig nach der Streulichtdetektion werden die Partikel durch einen hochenergetischen gepulsten UV-Laser verdampft und ionisiert. Die Flugzeit der Partikel zwischen den kontinuierlichen Laserstrahlen wird dazu benutzt, die Ankunftszeit der Partikel in der Ionenquelle zu berechnen und den UV-Laserpuls zu zünden. Die entstandenen Ionen werden in einem bipolaren Flugzeitmassen¬spektrometer nachgewiesen. Durch die Laserablation/Ionisation ist das SPLAT in der Lage, auch schwer verdampfbare Komponenten des atmosphärischen Aerosols - wie etwa Minerale oder Metalle - nachzuweisen. Das SPLAT wurde während dieser Arbeit vollständig neu entwickelt und aufgebaut. Dazu gehörten das Vakuum- und Einlasssystem, die Partikeldetektion, die Ionenquelle und das Massen-spektrometer. Beim Design des SPLAT wurde vor allem auf den späteren Feldeinsatz Wert gelegt, was besondere Anforderungen an Mechanik und Elektronik stellte. Die Charakterisierung der einzelnen Komponenten sowie des gesamten Instruments wurde unter Laborbedingungen durchgeführt. Dabei wurde u.a. Detektionseffizienzen des Instruments ermittelt, die abhängig von der Größe der Partikel sind. Bei sphärischen Partikeln mit einem Durchmesser von 600 nm wurden ca. 2 % der Partikel die in das Instrument gelangten, detektiert und chemisch analysiert. Die Fähigkeit zum Feldeinsatz hat das SPLAT im Februar/März 2006 während einer internationalen Messkampagne auf dem Jungfraujoch in der Schweiz bewiesen. Auf dieser hochalpinen Forschungsstation in einer Höhe von ca. 3580 m fand das SPLAT mineralische und metallische Komponenten in den Aerosolpartikeln. Das SPLAT ist ein vielfältig einsetzbares Instrument und erlaubt vor allem in Kombination mit Aerosolmassenspektrometern, die mit thermischer Verdampfung und Elektronenstoßionisation arbeiten, einen Erkenntnisgewinn in der Analytik atmosphärischer Aerosolpartikel.

Morphologischer und biochemischer Aufbau von Silikatnadeln der Hexactinelliden am Beispiel von Monorhaphis chuni

Schon 1904 beschrieb Schulze den Aufbau von Silikatnadeln des Schwammes Monorhaphis chuni, eines Mitglieds der zweiten Familie von biosilifizierenden Schwämmen, den Hexactinelliden (Glasschwämmen). Weitergehende morphologische Untersuchungen und biochemische Analysen insbesondere mit modernen Methoden wurden an Hexactinelliden bisher kaum durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb darin, Untersuchungen zur Morphologie, der chemischen Zusammensetzung, der Verteilung und Charakterisierung der beteiligten anorganischen und organischen Komponenten sowie einen molekularbiologischer Nachweis der Existenz von Silicatein in Hexactinelliden durchzuführen. Für diese Untersuchungen wurden zwei Spezies verwendet: Monorhaphis chuni und Crateromorpha meyeri. Mittels Elektronen-Mikrosonden-Technik wurde an Querschnitten der Pfahlnadel von M. chuni die Verteilung der Elemente innerhalb der Nadel untersucht. Am äußeren Rand der Nadel (150 µm) traten im Vergleich zur Nadelmitte prägnante Unterschiede in der Konzentration von Kaliumoxid und Natriumoxid auf. Diese Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein eines ähnlichen Transportsystems zur Anreicherung von Silizium/Silikat bei der Nadelbildung hin, wie es bereits in S. domuncula bekannt ist. Mit elektronen- und lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die organischen Substanzen der Silikatnadel nachgewiesen und deren Verteilung innerhalb dieser Nadeln analysiert. In der lamellaren Zone befindet sich, eine säurelabile organische Netzstruktur, sowie eine, die Silikatschichten durchspannende, säulenähnliche Struktur. Im Axialzylinder zeigt das organische Material eine leicht verzweigte fibrilläre Anordnung. Mit biochemischen Verfahren wurden die organischen Komponenten der Nadeln detaillierter untersucht. Mehrere Proteine mit Molekulargewichten von 17, 24, 27 ,30, 36 und 70 kDa wurden durch gelelektrophoretische Analysen von Material der Pfahlnadel identifiziert. Die Analyse isolierter Anteile der lamellaren Zone zeigte ausschließlich ein 27 kDa Protein. Die restlichen Proteinbanden konnten hier nicht nachgewiesen werden. Das 27 kDa Protein reagierte im Westernblot mit Antikörpern gegen Silicatein aus S. domuncula. Ein weiteres Protein wurde näher charakterisert. Ein positiver Agglutinationsassay wies ein lectinähnliches Molekül innerhalb der Nadeln nach, wie es aus S. domuncula bekannt ist. Nach einer Deglycolysierung der Proteine reduzierte sich das scheinbare Molekulargewicht der 36 kDa Bande auf 30 kDa. Durch molekularbiologische Untersuchungen wurde erstmals in Hexactinelliden die Existenz von Silicatein nachgewiesen. Nach Isolierung der Gesamt-RNA von Crateromorpha meyeri, RT-PCR und Amplifizierung mit silicateinspezifischen Primern wurde eine 549 kBp Nukleotidsequenz gefunden, die auf Aminosäureebene starke Homologien (76% identische Aminosäuren) zu bekannten Silicateinen der Demospongia aufweist. Die Aminosäuren der katalytische Triade des Silicateins, essenziell für die enzymatische Katalyse des Enzyms, sind an den selben Positionen wie bei bekannten Silicateinen vorhanden.

Räumliche und jahreszeitliche Verteilung von OH- und HO 2-Radikalen in der Troposphäre über Europa

Durch geologische Prozesse freigesetzte sowie biogen und anthropogen emittierte Gase werden hauptsächlich von der untersten Atmosphärenschicht, der Troposphäre, aufgenommen und abgebaut. Durch in die Troposphä¬re einfallende solare Strahlung wird ein Abbau des Großteils der emittierten Spurengase durch reaktive Radikale initiiert. Der wichtigste Vertreter dieser reaktiven Radikale in der Troposphäre ist das Hydroxylradikal (OH-Radikal), welches im schnellen Gleichgewicht mit Hydroperoxyradikalen (HO2-Radikal) vorliegt, sodass die Summe aus OH- und HO2-Radikalen oft als HOx zusammengefasst wird. HOx-Radikale bilden tagsüber den Hauptteil der Oxidationskapazität der Troposphäre und sind somit verantwortlich für den oxidativen Abbau vieler, auch chemisch und photolytisch stabiler, Spurengase. Daher wird die Oxidationskapazität als Selbstreinigungskraft der Troposphäre verstanden. rnIm Rahmen meiner Arbeit wurde die wissenschaftliche Fragestellung auf die Oxidationskapazität der Troposphäre über Europa fokussiert. Die Höhen- und Breitenverteilung der OH- und HO2-Mischungsverhältnisse und ihre jahreszeitliche Variation wurde während der flugzeuggestützten HOOVER-Kampagnen (HOOVER 1 & 2) charakterisiert, wobei ein Fokus auf der oberen Troposphäre lag. Es wird gezeigt, welchen Einfluss die einfallende Strahlung, die Variation von HOx-Vorläufersubstanzen (wie z. B. Ozon) und die Variation von Substanzen, die das HOx-Gleichgewicht beeinflussen (z. B. Stickstoffmonoxid), auf das HOx-Budget haben. rnEs wird beispielhaft für den Höhenbereich zwischen 8 und 9.5 km gezeigt, dass die Oxidationskapazität in der oberen Troposphäre des Sommers im Ver¬gleich zu der des Herbstes aufgrund von einer verstärkten HO2-Zyklierung im Mittel deutlich erhöht ist (500 %). rnDurch konvektiven Transport werden im Sommer im Gegensatz zum Herbst regelmäßig Luftmassen aus der planetaren Grenzschicht in die obere Troposphäre eingemischt. Daher wurden der konvektive Luftmassentransport und der Einfluss der eingemischten Spurengase auf die Oxidationskapazität der oberen Troposphäre anhand eines konvektiven Elements über Südostdeutschland untersucht. Wie in dieser Arbeit berichtet wird, wurden in den Luftmassen der Ausströmregion mit bis zu 3.5 pmol/mol (Maximum 10 s-Mittelwert) sehr hohe OH-Mischungsverhältnisse gefunden, die aus der HO2-Konversion mit NO gebildet wurden. Das modellierte HOx-Budget zeigt, dass die HOx-Chemie - unter den beobachteten Bedingungen in der Ausströmregion - durch HOx-Zyklierungsreaktionen beherrscht wird. rnDie gemessenen OH-Mischungsverhältnisse in der Ausströmregion liegen etwa um einen Faktor fünf höher, als die während dieses Fluges in der konvektiv unbeeinflussten oberen Troposphäre gemessenen OH-Mischungsverhältnisse. Am Beispiel der NO2- und CH4-Lebensdauer wird ein schnellerer Abbau von Spurengasen aufgrund der erhöhten Oxidationskapazität nachgewiesen. Aus der NO2-Lebensdauer wird abgeschätzt, wie lange die Oxidationskapazität aufgrund des konvektiven Transports von NOx in den Luftmassen des Ausströmgebietes erhöht ist.rnDie während den Kampagnen durchgeführten Messungen wurden genutzt, um Modellberechnungen des vertikalen HOx-Budgets (über Südschweden) und des meridionalen HOx-Budgets zwischen Nordeuropa und Korsika durchzuführen. Es wurde gezeigt, dass das Modell die OH- und HO2-Mischungsverhältnisse im Allgemeinen gut reproduziert (Modell/Messung: OH im Sommer 94 %, HO2 im Sommer 93 % im Herbst 95 %), wohingegen die vergleichsweise kleinen OH-Mischungsverhältnisse im Herbst aufgrund von einer überschätzten H2O2 abhängigen OH-Produktion stark überschätzt wurden (Modell/Messung: 147 %). rnZur Charakterisierung der Oxidationskapazität innerhalb der planetaren Grenzschicht wurden die DOMINO-Kampagnen durchgeführt. Dabei wurde die Zusammensetzung unterschiedlicher Luftmassen untersucht, die aus verschiedenen Herkunftsorten zum Messort transportiert wurden und aufgrund ihres Ursprungs kaum prozessierte bis prozessierte anthropogen emittierte Spurengase enthielten. Zusätzlich enthielt ein Teil der Luftmassen biogen emittierte Spurengase. Komplementäre Messungen ermöglichen die Berechnung der totalen OH-Produktion und den Vergleich mit den bekannten OH-Quellen. Der Vergleich zeigt, dass offenbar wichtige OH-Produktionskanäle durch die gemessenen Spurengase oder die durchgeführten Berechnungen nicht abgebildet werden. Es wird gezeigt, dass die Stärke der unbekannten OH-Quellen, vor allem unter niedrigen NO-Bedingungen, groß ist und mit den Isopren-, RO2- und HO2-Mischungsverhältnissen korreliert.rn

Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn

Funktionelle Analyse der Meprin-Metalloproteasen alpha und beta hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation und biologischen Bedeutung

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, ein besseres Verständnis der beiden Metalloproteasen Meprin α und β in ihrem proteolytischen Netzwerk hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation durch endogene Inhibitoren, wie auch der biologischen Funktion von Meprin α für den Prozess der Angiogenese, zu erlangen. rnMit der Analyse des ersten identifizierten endogenen Meprin-Inhibitors Fetuin-A gelang die Bestimmung der Ki-Werte für Meprin α mit 4,2 x 10-5 M und 1,1 x 10-6 M für Meprin β. Des Weiteren konnte für Meprin β eine Schnittstelle im Fetuin-A validiert werden. Mit der Identifizierung von Cystatin C, einem Cystein-Protease-Inhibitor als endogener Inhibitor der Metalloprotease Meprin α, mit einem Ki-Wert von 8,5 x 10-6 M, wurden erstmals Proteasefamilie-übergreifende Inhibitionsmechanismen für Metalloproteasen offenbart.rnDie Analyse von drei potentiellen Meprin-Inhibitoren, identifiziert als Substrate in einem neuen Proteomics-Analyse-Verfahren terminal amine isotopic labeling of substrates (TAILS), ermöglichte die Charakterisierung von Elafin als spezifischen Meprin α-Inhibitor. Für Elafin ist es außerdem gelungen, die durch TAILS ermittelte Schnittstelle für Meprin α mittels Edman Sequenzierung zu validieren. Der secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), ein Elafin-Homolog, konnte als weiteres Meprin α-Substrat bestätigt werden. Außerdem gelang es, die Meprin α-Schnittstelle im SLPI zu validieren.rnEin weiteres Ziel dieser Arbeit war, ein besseres Verständnis der biologischen Funktion der Metalloprotease Meprin α zu erlangen. Hier konnte in vivo eine stark pro-angiogene Wirkung von Meprin α gezeigt werden und erstmals die Expression von Meprin α, jedoch nicht von Meprin β, in Endothelzellen nachgewiesen werden. Zugleich konnte mit der Analyse der durch die TAILS-Methode identifizierten pro-angiogenen Substrate vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) und connective tissue growth factor (CTGF) der Regulationsmechanismus von Meprin α in der Angiogenese identifiziert werden. So ist Meprin α durch die Spaltung von CTGF in der Lage VEGF-A – gebunden und inhibiert im Komplex mit CTGF – durch proteolytische Spaltung von CTGF wieder freizusetzen. Somit wird die inhibierte VEGF-A-Aktivität wieder vollständig hergestellt. rnMit der Charakterisierung der ersten endogenen Meprin-Inhibitoren ist es gelungen, zu einem besseren Verständnis der endogenen Regulation der Meprine beizutragen und eine Proteasefamilie-übergreifende endogene Regulation aufzuzeigen. Mit der Entdeckung von Meprin α als pro-angiogene Protease und der Entschlüsselung des angiogenen Regulationsmechanismus konnte eine essentielle biologische Bedeutung dieser Protease beschrieben werden.rn

Funktionelle Analyse der Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout

Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polaritätsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bezüglich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarität sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. Gänzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polaritätsregulatoren für die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizitätsanalysen lieferten übereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich stärkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die Überexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien darüber hinaus mit einer verstärkten Resistenzbildung gegenüber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig für den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarität und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, über voneinander unabhängige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende Störung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und ließen eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polaritätsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladhäsion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilität offenbarte in Übereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 für die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnFür die Aufklärung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante phänotypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und ließen daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und möglicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schließen.rn

Charakterisierung antiker Keramik und ihrer Herstellungstechniken mit mineralogischen Methoden am Beispiel Mayener Gebrauchskeramik

Mehr als hundert Jahre archäologischer Forschung haben gezeigt, dass in Mayen in römischer und mittelalterlicher Zeit eines der wichtigsten europäischen Produktionszentren für die Herstellung qualitätsvoller Gebrauchskeramik bestand. Im Rahmen dieser Studie wurden vier Befundkomplexe aus Töpfereisiedlungen vom 4. bis in das 14. Jahrhundert untersucht. Genauer handelt es sich um Keramik aus zwei spätantiken Brennanlagen des 4. Jahrhunderts im Bereich der Flur „Auf der Eich“ an den Straßen „Am Sonnenhang“ und „Frankenstraße“. Weiterhin konnte Material aus zwei Töpferofenfüllungen des 5. bis 9. Jahrhunderts analysiert werden, das 1975 auf dem Grundstück 55 an der „Siegfriedstraße“ in Brennanlagen entdeckt wurde. Hinzu kam Brenngut aus elf Töpferöfen des späten 8. bis 14. Jahrhunderts, welches in den so genannten „Burggärten“ der Genovevaburg von Mayen in den Jahren 1986/87 durch die archäologische Denkmalpflege in Koblenz geborgen wurde. Die mineralogischen Untersuchungen zur Charakterisierung der „Mayener Keramik“ wurden systematisch an den Keramikmaterialien aus diesen Fundstellen durchgeführt. Mittelalterliche Keramik aus Bornheim-Walberberg, Brühl-Eckdorf, Höhr-Grenzhausen, Langerwehe, Frechen, Brühl-Pingsdorf, Paffrath, Raeren, Ratingen-Breitscheid, Siegburg-Seehofstraße, Siegburg-Scherbenhügel, Fredelsloh und Brühl-Badorf konnte für diese Arbeit als Referenzmaterialien ebenfalls untersucht werden. Provenienzanalysen wurden an Keramikproben aus 27 Fundorten, die makroskopisch nach Mayener Ware aussehen, mit mineralogischen Methoden durchgeführt, um sie der Fundregion Mayen eindeutig zuordnen zu können.rnPhasenanalyse, chemische Analyse und thermische Analyse wurden an Keramik sowie Ton durchgeführt. Die Phasenanalyse wurde zur Bestimmung der mineralischen Zusammensetzung von Grundmasse und Magerungsmittel (Röntgendiffraktometrie (XRD), Polarisationsmikroskop, Mikro-Raman-Spektroskopie) verwendet. Die chemische Zusammensetzung wurde durch Röntgenfluoreszenzanalyse (RFA) ermittelt. Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA) und Laser-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) wurden bei den Proben, bei denen weniger als 2g Material zur Verfügung standen, eingesetzt. Brennexperimente wurden am originalen Rohstoff der Keramik aus den „Burggärten“ der Genovevaburg durchgeführt. Gebrannter Ton wurde durch Röntgendiffraktometrie (XRD), Infrarotspektroskopie (IR) und Differential-Thermoanalyse (DTA) analysiert. rnAnhand der Messergebnisse lässt sich die Mayener Keramik aus den vier Fundplätzen in zwei Typen zusammenzufassen: der mit Feldspat-reichem Sand gemagerte römische Typ und der mit Quarz-reichem Sand gemagerte mittelalterliche Typ. Die Änderung des Magerungsmittels von Feldspat- zu Quarzsand weist eine technische Entwicklung zu höheren Brenntemperaturen von der Römerzeit bis in das Mittelalter nach. Nach der Untersuchung und dem Vergleich mit den Referenzkeramikgruppen ist festzustellen, dass durch multivariate Statistikanalysen der chemischen Komponenten die Charakterisierung der Keramik und eine Differenzierung zwischen den Keramikgruppen gelingt. Diese Erkenntnisse bildeten die Basis für Provenienzanalysen. 16 Fundorte können durch Provenienzanalyse sicher als Exportregionen der Mayener Ware festgestellt werden. Gemäß den Brennexperimenten lassen sich die chemischen Reaktionen während des Brandprozesses nachvollziehen. Zwei Methoden wurden mittels Röntgendiffraktometrie (XRD) und Differential-Thermoanalyse (DTA) zur Bestimmung der Brenntemperaturen der Keramik modelliert. Die Töpferöfen der „Burggärten“ können nach der Brenntemperatur in zwei Typen zusammengefasst werden: solche mit einer Brenntemperatur unter 1050°C und solche mit einer Brenntemperatur über 1050°C.rn

Zur Rolle der Antigendosis in IgE-vermittelten Immunantworten und der allergischen Atemwegsentzündung

Die Verabreichung von hohen Antigendosen im Rahmen der allergenspezifischen Immuntherapie (SIT) resultiert in der Induktion einer allergenspezifischen Toleranz in sensibilisierten Patienten. Vorangegangene Studien der Klinischen Forschergruppe Allergie identifizierten CD4-CD8- doppelt-negative T-Zellen (dnTZ), welche nach wiederholter intraperitonealer Injektion von hohen Dosen (HD) des an das Adjuvans Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens Keyhole Limpet Hemocyanin in Mäusen induziert wurden, als potente Suppressorzellen für die IgE-Produktion. Mäuse, die hingegen mit niedrigen Dosen (LD) desselben Antigens behandelt wurden, entwickelten eine starke, persistierende IgE-Immunantwort. rnIm Fokus meiner Doktorarbeit stand die phänotypische Charakterisierung der dnTZ aus HD-Mäusen sowie die Aufklärung möglicher inhibitorischer Wirkmechanismen. In Erweiterung der bisherigen Arbeiten und in Anlehnung an die klinische Praxis bei der Durchführung der SIT habe ich bei meinen Untersuchungen die subkutane Injektion ohne Adjuvans als alternative Applikationsroute verwendet. In meinen Studien konnte ich durch die zusätzliche Verwendung des klinisch relevanten Allergens Ovalbumin die Allgemeingültigkeit des Konzepts der antigendosisabhängigen Regulation der IgE- Produktion durch dnTZ verifizieren. Die Vakzinierung mit hohen Antigendosen verhinderte die Ausbildung einer IgE-Produktion in antigenspezifischer Weise. HD- Mäuse wiesen in vitro eine geringere Aktivierung von TH2-Zellen als LD-Mäuse auf. Im Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung wiesen HD-Mäuse eine reduzierte Atemwegsreaktivität sowie eine geringere pulmonale TH2-Zytokin- produktion auf. rnIch konnte zudem tendenziell eine leicht erhöhte Anzahl von dnTZ in HD-Mäusen messen. Die in HD-Mäusen induzierten dnTZ habe ich durchflusszytometrisch charakterisiert, konnte jedoch keinen eindeutigen Marker für suppressive dnTZ identifizieren. In einem adoptiven Transferexperiment war eine T-Zellpopulation von HD-Mäusen aus der γδ-T-Zell-Rezeptor-tragende T-Zellen depletiert worden waren, ähnlich wie die Ausgangs-T-Zellpopulation in der Lage die IgE-Produktion in den Rezipienten zu inhibieren, was darauf schließen lässt, dass die untersuchten regulatorischen dnTZ einen αβ-T-Zell-Rezeptor exprimieren. rn

Lysosomaler Transport kationischer Aminosäuren durch Mitglieder der SLC7-Familie

Lysosomaler Transport kationischer Aminosäuren (KAS) stellt einen Rettungsweg in der Cystinose-Therapie dar. Ein solches Transportsystem wurde in humanen Hautfibroblasten beschrieben und mit System c benannt. Des Weiteren stellt lysosomales Arginin eine Substratquelle für die endotheliale NO-Synthase (eNOS) dar. Das von der eNOS gebildete NO ist ein wichtiges vasoprotektiv wirkendes Signalmolekül. Ziel war es daher, herauszufinden, ob Mitglieder der SLC7-Unterfamilie hCAT möglicherweise System c repräsentieren.rnIn dieser Arbeit konnte ich die lysosomale Lokalisation verschiedener endogener, sowie als EGFP-Fusionsproteine überexprimierter CAT-Isoformen nachweisen. Mittels Fluoreszenz-mikroskopie wurde festgestellt, dass die in U373MG-Zellen überexprimierten Fusionsproteine hCAT-1.EGFP sowie SLC7A14.EGFP mit dem lysosomalen Fluoreszenz-Farbstoff LysoTracker co-lokalisieren. Eine Lokalisation in Mitochondrien oder dem endoplasmatischem Retikulum konnte mit entsprechenden Fluoreszenz-Farbstoffen ausgeschlossen werden. Zusätzlich reicherten sich die überexprimierten Proteine hCAT-1.EGFP, hCAT-2B.EGFP und SLC7A14.EGFP in der lysosomalen Fraktion C aus U373MG-Zellen zusammen mit den lysosomalen Markern LAMP-1 und Cathepsin D an. Gleiches galt für den endogenen hCAT-1 in der lysosomalen Fraktion C aus EA.hy926- und U373MG-Zellen sowie für den SLC7A14 in den humanen Hautfibroblasten FCys5. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit generierte Antikörper gegen natives SLC7A14 konnte erstmals die endogene Expression und Lokalisation von SLC7A14 in verschiedenen Zelltypen analysiert werden.rnObwohl eine Herunterregulation des hCAT-1 in EA.hy926-Endothelzellen nicht zu einer Reduktion der Versorgung der eNOS mit lysosomalem Arginin führte, ist eine Funktion von hCAT-1 im Lysosom wahrscheinlich. Sowohl die [3H]Arginin- als auch die [3H]Lysin-Aufnahme der Fraktion C aus U373MG-hCAT-1.EGFP war signifikant höher als in die Fraktion C aus EGFP-Kontrollzellen. Dies konnte ebenfalls für den hCAT-2B.EGFP gezeigt werden. Zusätzlich zeigten lysosomale Proben aus U373MG-hCAT-2B.EGFP-Zellen in der SSM-basierten Elektrophysiologie eine elektrogene Transportaktivität für Arginin. Das Protein SLC7A14.EGFP zeigte in keiner der beiden durchgeführten Transportstudien eine Aktivität. Dies war unerwartet, da die aus der Diplomarbeit stammende und im Rahmen dieser Dissertation erweiterte Charakterisierung der hCAT-2/A14_BK-Chimäre, die die „funktionelle Domäne“ des SLC7A14 im Rückgrat des hCAT-2 trug, zuvor den Verdacht erhärtet hatte, dass SLC7A14 ein lysosomal lokalisierter Transporter für KAS sein könnte. Diese Studien zeigten allerding erstmals, dass die „funktionelle Domäne“ der hCATs die pH-Abhängigkeit vermittelt und eine Rolle in der Substraterkennung spielt.rnZukünftig soll weiter versucht werden auch endogen eine Transportaktivität der hCATs für KAS im Lysosom nachzuweisen und das Substrat für das intrazellulär lokalisierte Waisen-Protein SLC7A14 zu finden. Eine mögliche Rolle könnte SLC7A14 als Transporter für Neurotransmitter spielen, da eine sehr prominente Expression im ZNS festgestellt wurde.rn

Chemische Zusammensetzung der Aerosole : Design und Datenauswertung eines Einzelpartikel-Laserablationsmassenspektrometers

Atmosphärische Aerosolpartikel wirken in vielerlei Hinsicht auf die Menschen und die Umwelt ein. Eine genaue Charakterisierung der Partikel hilft deren Wirken zu verstehen und dessen Folgen einzuschätzen. Partikel können hinsichtlich ihrer Größe, ihrer Form und ihrer chemischen Zusammensetzung charakterisiert werden. Mit der Laserablationsmassenspektrometrie ist es möglich die Größe und die chemische Zusammensetzung einzelner Aerosolpartikel zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das SPLAT (Single Particle Laser Ablation Time-of-flight mass spectrometer) zur besseren Analyse insbesondere von atmosphärischen Aerosolpartikeln weiterentwickelt. Der Aerosoleinlass wurde dahingehend optimiert, einen möglichst weiten Partikelgrößenbereich (80 nm - 3 µm) in das SPLAT zu transferieren und zu einem feinen Strahl zu bündeln. Eine neue Beschreibung für die Beziehung der Partikelgröße zu ihrer Geschwindigkeit im Vakuum wurde gefunden. Die Justage des Einlasses wurde mithilfe von Schrittmotoren automatisiert. Die optische Detektion der Partikel wurde so verbessert, dass Partikel mit einer Größe < 100 nm erfasst werden können. Aufbauend auf der optischen Detektion und der automatischen Verkippung des Einlasses wurde eine neue Methode zur Charakterisierung des Partikelstrahls entwickelt. Die Steuerelektronik des SPLAT wurde verbessert, so dass die maximale Analysefrequenz nur durch den Ablationslaser begrenzt wird, der höchsten mit etwa 10 Hz ablatieren kann. Durch eine Optimierung des Vakuumsystems wurde der Ionenverlust im Massenspektrometer um den Faktor 4 verringert.rnrnNeben den hardwareseitigen Weiterentwicklungen des SPLAT bestand ein Großteil dieser Arbeit in der Konzipierung und Implementierung einer Softwarelösung zur Analyse der mit dem SPLAT gewonnenen Rohdaten. CRISP (Concise Retrieval of Information from Single Particles) ist ein auf IGOR PRO (Wavemetrics, USA) aufbauendes Softwarepaket, das die effiziente Auswertung der Einzelpartikel Rohdaten erlaubt. CRISP enthält einen neu entwickelten Algorithmus zur automatischen Massenkalibration jedes einzelnen Massenspektrums, inklusive der Unterdrückung von Rauschen und von Problemen mit Signalen die ein intensives Tailing aufweisen. CRISP stellt Methoden zur automatischen Klassifizierung der Partikel zur Verfügung. Implementiert sind k-means, fuzzy-c-means und eine Form der hierarchischen Einteilung auf Basis eines minimal aufspannenden Baumes. CRISP bietet die Möglichkeit die Daten vorzubehandeln, damit die automatische Einteilung der Partikel schneller abläuft und die Ergebnisse eine höhere Qualität aufweisen. Daneben kann CRISP auf einfache Art und Weise Partikel anhand vorgebener Kriterien sortieren. Die CRISP zugrundeliegende Daten- und Infrastruktur wurde in Hinblick auf Wartung und Erweiterbarkeit erstellt. rnrnIm Rahmen der Arbeit wurde das SPLAT in mehreren Kampagnen erfolgreich eingesetzt und die Fähigkeiten von CRISP konnten anhand der gewonnen Datensätze gezeigt werden.rnrnDas SPLAT ist nun in der Lage effizient im Feldeinsatz zur Charakterisierung des atmosphärischen Aerosols betrieben zu werden, während CRISP eine schnelle und gezielte Auswertung der Daten ermöglicht.