35 resultados para Transfection transitoire
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Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle whrend der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivitt und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend fr das berleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellulren Prozesse die aktivittsabhngige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkanlen und membranstndigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdrckung neuronaler Aktivitt durch den Natriumionenkanalblocker TTX fhrte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein hnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosefrdernde Wirkung erst nach lngerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellulrer Kaliumkonzentrationen ermglicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abhngig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch fr die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die berlebensfhigkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.
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Die Stimulation der APP-prozessierenden -Sekretase ADAM10 erffnet eine vielversprechende Mglichkeit zur medizinischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit wurden drei unterschiedliche Strategien zur therapeutischen Aktivierung von ADAM10 verfolgt: Die Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP, die Gentherapie mit ADAM10-cDNA und die ADAM10-Promotorstimulation durch Retinoid-Rezeptor-Aktivierung. PACAP-38 stimuliert die -Sekretase-vermittelte APPs-Sekretion in humanen Neuroblastomzellen. Durch Aktivierung des PAC-1-Rezeptors via intranasal verabreichtem PACAP-38, konnte eine erhhte -sekretorische APP-Prozessierung bzw. verminderte Ablagerung von amyloiden Plaques in Musen gezeigt werden. Weiterhin sollte durch Immunoliposomen-basierte Transfektion die humane ADAM10-cDNA in den Neuronen der Maus berexprimiert werden. Hiefr wurde die DNA in Liposomen eingeschlossen, welche an ihrer Oberflche mit anti-Transferrin-Antikrpern zur berwindung der Blut-Hirn-Schranke gekoppelt waren. Fr die Herstellung des DNA-Transportsystems wurden die Einzelschritte wie DNA-Einschluss mit einem Reportergen-Vektor, Konjugation mit verschiedenen Antikrpern und Gre der Liposomen erprobt und optimiert. Es konnte allerdings weder in vitro noch in vivo eine Immunoliposomen-vermittelte Transfektion nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde zudem die Retinoid-basierte Expressionssteigerung von ADAM10 untersucht. Dafr wurden die beiden potentiellen Retinoid-Rezeptor-Bindestellen auf dem ADAM10-Promotor durch Verwendung selektiver nuklerer Rezeptor-Agonisten charakterisiert. Hierbei konnte erstmals gezeigt werden, dass der ADAM10-Promotor durch ein Dimer der nukleren Rezeptoren RAR und RXR aktiviert wird, wodurch eine erhhte -sekretorischen APP-Prozessierung in Neuroblastoma-Zellen resultiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die RAR/RXR-Heterodimeraktivierung sowohl auf dem humanen wie auf dem murinen ADAM10-Promotor identisch ist, so dass am Mausmodell entwickelte Retinoid-basierte Therapien auf den Menschen bertragbar sind. Fr das Modell einer solchen Therapie wurde Acitretin verwendet, welches fr die medizinische Behandlung humaner Hautkrankheiten seit Jahrzehnten eingesetzt wird. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Acitretin in humanen und murinen Neuroblastoma-Zellen die Menge an ADAM10 erhht, wodurch die -sekretorische APP-Prozessierung gesteigert wird. Zudem wurden Muse mit Acitretin oral, subcutan und intranasal behandelt, wobei jedoch weder eine Vernderung in der APP-Prozessierung noch der Blut-Hirn-Transport von Acitretin eindeutig belegt werden konnten. Dennoch erschliet die -Sekretase-erhhende Eigenschaft von Acitretin einen neuen Therapieansatz, zur Behandlung von Demenzformen vom Typ des Morbus Alzheimer.
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Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Fr die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht fr die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer grere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfr verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilitt in ihrer intrinsischen Radiosensitivitt sowie in ihrer Sensitivitt gegenber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhhung der alpha-Komponente, der berlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstrkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund fr den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizitt war fr die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhngig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprgt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es fr die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als fr den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schdigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Lsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschlieen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikrper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschrnkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung ber den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfr ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstrkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstrkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor fr den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fhigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung ber den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulsen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, ber eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade berwunden werden kann.
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Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften verndern. In dieser Doktorarbeit sollten zunchst mediatorinduzierte tolerogene Schlsselmolekle identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenprsentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Phnotyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Molekle. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Molekle fr eine berexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 berexprimierten, einen protolerogenen Phnotyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazellulre Proteine oder Oberflchenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften berexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazitt gekennzeichnet und vernderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.
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Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine whrend der Entwicklung des Sugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem Ftalstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach hherer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung besttigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Frhembryonalstadien noch whrend der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zellulre und intrazellulre Lokalisation beider Globine anhand einer primren Zellkultur aus dem Hippocampus prnataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das Frbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Primrkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellulren Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP-Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-Frbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nuklere Lokalisation, die insbesondere fr Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn primren Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf hnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Vernderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine nderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erfhrt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn
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Die kumulative Habil.Schrift grndet sich auf 6 Originalpublikationen, die beschreiben: [Sass, H. (1982), Cell 28: 269278]. RNA polymerase B in polytene chromosomes: Immunofluorescent and autoradiographic analysis during stimulated and repressed RNA synthesis. Elektronenmikroskopie charakterisierte das C. tentans Balbianiring BR2Gen von Speicheldrsenchromosomen als hoch aktives 56 m langes singlecopy Gen, das 33/m RNAPolymerasen B (Pol II) transkribieren (Diss., Sass, H., 1978, Univ. Tbingen). Diese Immunfluoreszenzstudie ortet Pol II in allen Interbanden von Region IV3B103B5 des nichtinduzierten BR2. Prominente Fluoreszenz im BR2Genort 3B9/10 zeigt, das BR2Gen ist praktiv, wie erwartet. 3HAutoradiogramme beweisen, in allen fluoreszierenden BR2, BR1, BR3, Puffs, aufgelockerten Banden, Interbanden und Loci ohne Puffing, synthetisiert Pol II RNA. Die genomweite stndige Pol IIPrsenz zeigt, dass, wie beim nichtinduzierten BR2Gen, bereits schon gebundene Pol II wohl auch andere Gene praktiviert. So erfolgt die Regulation der Transkription mehr ber die transkriptionelle Elongation. Auch durch Amanitin, oder Actinomycin D, oder Hitzeschock in vivo kollabierte BR2, BR1, BR3 besitzen Pol II. [Sass, H. (1984), Chromosoma 90: 2025]. Gene identification in polytene chromosomes: some Balbiani ring 2 gene sequences are located in an interbandlike region of Chironomus tentans. Immunfluoreszenz und 3HAutoradiographie zeigen, dass Injektionen von DRB in Larven die Balbianiringe (BR) sowie andere Puffs und deren Pol IIKonzentration dramatisch reduzieren. Trotzdem zeigen 3HUridin markierte Speicheldrsenchromosomen, dass RNASynthese doch in nichtinduzierten BR2, BR1, BR3 erfolgt, aber nur auf reduziertem Level. Das widerspricht der von Egyhzi E. (1975, PNAS 73:947950) propagierten Inhibition of Balbiani ring RNA synthesis at the initiation level durch DRB. Vielmehr sieht es so aus, DRB wirkt bei der transkriptionellen Elongation inhibierend. Durch in situHybridisierung von Sequenzen klonierter BR2DNA wurde in Speicheldrsenchromosom IV das BR2Gen in Region 3B9/10 direkt identifiziert. [Sass, H. and Pederson, T. (1984), J. Mol. Biol. 180: 911926]. Transcriptiondependent localization of U1 and U2 small nuclear ribonucleoproteins at major sites of gene activity in polytene chromosomes. Immunolokalisation von Sm, U1 und U2snRNPspezifischen Antigenen in Speicheldrsenchromosomen von C. tentans hat zur Entdeckung der beim Spleien von prmRNA beteiligten U1/U2snRNPs in Balbianiringen BR2, BR1, BR3 sowie anderen Puffs und aufgelockerten Banden gefhrt. Die berraschenden BRDaten zeigen erstmals: (i) Der SpleiApparat ist in Genloci mit intensiver RNASynthese schon vorhanden. (ii) Immunfluoreszenz reflektiert den ExonIntronBau dieser BRGene. (iii) Transkription und spleiosomales Ausschneiden von Introns sind koordiniert. [Sass, H. (1989), Nucleic Acids Research 17: 10508]. Hsp82neo transposition vectors to study insertional mutagenesis in Drosophila melanogaster and tissue culture cells; [Sass, H. (1990), Gene 89: 179186]. Ptransposable vectors expressing a constitutive and thermoinducible hsp82neo fusion gene for Drosophila germline transformation and tissueculture transfection. Beschrieben sind Design, Konstruktion und Expression der Genfusion hsp82neo als ein in vivo selektierbares Reporter/Markergen, die Transposons P{hsp82neo/Adh} sowie P{hsp82neo} und TransformationsVektoren pHS22, pHS24, pHS85, pHS103 und pHS104. Sie stellen das von der Fliege gebildete Enzym bakteriellen Ursprungs, NeomycinPhosphotransferase II, fr die G418Selektion bereit, um die Position, Struktur, Expression und Funktion von Genen mittels hsp82neoMutagenese zu erforschen. [Sass, H. and Meselson, M. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 67956799]. Dosage compensation of the Drosophila pseudoobscura Hsp82 gene and the D. melanogaster Adh gene at ectopic sites in D. melanogaster. Quantitative Unterschiede in der Dosiskompensation des Xchromosomalen hsp82Gens von D. pseudoobscura und autosomalen AdhGens von D. melanogaster wurden als Erhhung der RNAMenge in D. melanogaster gemessen. Beide Transgene sind dosiskompensiert, sprang P{hsp82 neo/Adh} in euchromatische Regionen des D. melanogaster XChromosoms. Beide Transgene sind nicht dosiskompensiert, insertierte P{hsp82neo/Adh} ins Heterochromatin in Region 20 an der Basis des X. Keine der zehn autosomalen Insertionen ist dosiskompensiert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Xchromosomale regulatorische Sequenzen, die fr die Verstrkung der Genaktivitt um Faktor 2 in Mnnchen verantwortlich sind, gehuft im X vorkommen, jedoch im Heterochromatin und den Autosomen fehlen. Das Kompensationsverhalten der transponierten Gene wird durch das neue chromosomale Milieu des Insertionsortes bestimmt.
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Polykationen bilden mit DNA spontan Komplexe. Triebkraft ist der Entropiegewinn durch Freisetzung der Gegenionen auf den Polyelektrolyten. Solche Komplexe knnen in der Gentechnik verwendet werden, um fremde DNA in eine Zelle einzuschleusen. Dies bezeichnet man als Gentransfektion. In dieser Arbeit werden erstmals brstenfrmige Polykationen mit wurmfrmiger Topologie zur Gentransfektion verwendet. Dazu wurde die Komplexierung von DNA mit Brstenpolymeren mit Poly-L-Lysin- und Polyvinylpyridinium-Seitenketten und linearen Polykationen untersucht. Die Komplexbildung verluft in allen Fllen kinetisch kontrolliert, alle Polykationen bilden sphrische Komplexe, die Topologie hat keinen Einfluss auf die Komplexgre. Komplexe aus Brstenpolymeren transfizieren mehr als 25% der gesamten Zellpopulation bei Schweinehirnendothelzellen. Gegenber dem kommerziellen Transfektionsmittel Lipofektamin konnte eine deutliche Steigerung um bis zu 400% erreicht werden. Komplexe, die mit linearen Analoga gebildet wurden, zeigten bei gleicher Komplexgre Transfektionsraten unter 5%. Freisetzungsversuche zeigen, dass die Komplexe, die gut transfizieren, recht labil sind, also die DNA unter Kompetitoreinfluss freisetzen knnen. Stabile Komplexe haben geringe Transfektionseffizienzen. Ebenso wichtig ist der Schutz der DNA vor Abbau durch DNase. Die PVP-Brste bietet als einziges der untersuchten Polykationen diesen Schutz und zeigt auch die besten Transfektionsraten. Zustzlich zu der medizinischen Anwendung wurde die Kinetik der Komplexbildung untersucht. Dazu wurde ein spezieller Aufbau entwickelt, der es ermglicht die Streuintensitt der Komplexlsung bei kleinen Streuwinkeln zeitaufgelst im Millisekundenbereich zu detektieren. Die Komplexbildung verluft diffusionskontrolliert, im Bereich von Ladungsverhltnissen (positive zu negativen Ladungen) von 1.8 bis 4.0 schliet sich ein fraktales Wachstum an.
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Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Krper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivitt fr ein natrlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Grnden auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivitt fr s4U gegenber Uridin, besitzt PBC ein zustzliches terminales Alkin fr Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zustzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zustzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenber allen mglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelsten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFr verlssliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zustzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptschlich von Methyltransferasen, angewandt. rn
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Derzeit stellt die allergenspezifische Immuntherapie die einzige nicht allein antisymptomatische Behandlungsform zur langfristigen Therapie von Typ I-Allergien dar, welche grundlegende nderungen im immunologischen Geschehen induziert. Sie ist jedoch verbesserungswrdig in Bezug auf Behandlungsdauer, Erfolgschancen und Nebenwirkungen. Daher wurde in dieser Arbeit eine Strategie zur Therapie von Typ I-Allergien entwickelt und evaluiert, welche auf der Inhibition allergenspezifischer T-Zellen durch Dendritische Zellen (DC), die selektiv nach DNA-Immunisierung sowohl das relevante Allergen als auch Indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) konstitutiv produzieren, basiert. IDO ist ein Enzym aus dem Tryptophan-Stoffwechsel, dessen Produktion durch DC einen lokalen immunsuppressiven Mechanismus induziert und in verschiedenen Situationen mit der Induktion peripherer Toleranz assoziiert ist. Zunchst wurden Plasmide hergestellt, die entweder IDO alleine oder IDO zusammen mit dem Antigen unter der Kontrolle des ubiquitr aktiven CMV- bzw. des DC-spezifischen Fascin-Promotors kodieren. Die berprfung der IDO-Expression durch die monocistronischen Plasmide anhand von Transfektionsexperimenten in vitro ergab, dass die IDO-Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors sehr viel strker ausfiel als unter der Kontrolle des Fascin-Promotors. Nach Transfektion mit den bicistronischen Vektoren, in denen die Transgene fr das Antigen und IDO durch eine IRES-Sequenz verbunden waren, war die IDO-Expression jedoch insgesamt sehr schwach. Im Rahmen der berprfung der Funktionalitt der IDO-Expressionplasmide in vivo unter Verwendung der Genpistole wurden daher lediglich Plasmide getestet, die alleine IDO unter der Kontrolle des CMV-Promotors bzw. des Fascin-Promotors kodieren. Auch in vivo wurde eine strkere IDO-Expression nach biolistischer Transfektion mit solchen Vektoren beobachtet, in denen der CMV-Promotor zur Expressionskontrolle verwendet wurde. Die Analyse des Einflusses einer Koexpression von IDO auf die durch biolistische Immunisierung mit einem antigenkodierenden Vektor induzierte systemische Immunantwort offenbarte einen inhibitorischer Effekt fr den Fall, dass die Antigenproduktion mittels des Fascin-Promotors auf DC fokussiert war und die Expression des koapplizierten IDO-Transgens unter der Kontrolle des CMV-Promotors stand. In diesem Fall wurde eine Reduktion der antigenspezifischen IgG1- und IgG2a-Produktion, eine verringerte Sekretion von IFN-y durch restimulierte Milz- und Lymphknotenzellen sowie eine Reduktion der Zahl antigenspezifischer CD8+ Effektor-T-Zellen nachgewiesen. Im Mausmodell der IgE-vermittelten Typ I-Allergie wurde weiterhin gezeigt, dass nach prophylaktischer biolistischer Vakzinierung unter Verwendung dieser Vektorkombination eine Inhibition der durch die Vakzinierung bedingten antigenspezifischen Th1-Immunantwort ausgelst wurde. Die Suppression der Th2-Antwort, welche durch Transfektion mit dem Antigenkodierenden Vektor unter Kontrolle des Fascin-Promotors bewirkt wurde, wurde durch Kotransfektion mit den IDO-kodierenden Vektoren aufrecht erhalten.
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Die Forschung im Bereich der Drug Delivery-Systeme konzentriert sich auf biokompatible und wenig immunogene Trgermolekle. Eine Klasse vielversprechender Trgersysteme stellen Peptid basierte Polymere dar, die neben einer hohen Biokompatibilitt auch eine Sensitivitt gegenber externen Einflssen aufweisen. Der zwitterionische Charakter von Aminosuren und Peptiden verhindert die Adsorption von Serumproteinen und ein antifouling Verhalten kann festgestellt werden, sodass diese Molekle fr den Einsatz als Wirkstofftrgersystem sehr geeignet scheinen. In Kombination mit einer brstenartigen Struktur entstehen Systeme mit einer einzigartigen Peptidarchitektur, die sich durch eine hohe Dichte funktioneller Gruppen fr Konjugationsreaktionen auszeichnen und deren formabhngige Zellaufnahme sie besonders attraktiv fr die Anwendung als Nanocarrier macht.rnrnDas zwitterionische Poly-(-N-Methacryloyl-L-Lysin) (Mw = 721,000 gmol 1) wurde durch freie radikalische Polymerisation dargestellt und seine Konformation in Abhngigkeit von Ionenstrke und pH-Wert untersucht. Die Biokompatibilitt des Systems konnte durch Toxizittstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum nachgewiesen werden. Zusammen mit der vernachlssigbaren unspezifischen Aufnahme in dendritische Zellen aus Knochenmark erfllt das System damit alle Bedingungen, die an ein polymeres Wirkstofftrgersystem gestellt werden. Darber hinaus knnen Komplexe des Polymers mit DNA in Gegenwart von divalenten Metallionen fr die Gentransfektion verwendet werden.rnrnDurch Kopplung von -N-Methacryloyl-L-Lysin mit der Elastin-hnlichen Polypeptid Pentasequenz Valin-Prolin-Glycin-Glycin-Glycin konnte ein Hexapeptid-Makromonomer dargestellt werden, welches anschlieend mittels grafting through Polymerisation zur Polymerbrste umgesetzt wurde. Die wurmartige Struktur der Polymerbrsten wurde in AFM-Aufnahmen gezeigt und eine hohe Kettensteifigkeit der Polymerbrsten ber dynamische und statische Lichtstreuung nachgewiesen. Zirkulardichroismus-Messungen lieferten Informationen ber struktur-, salz- und temperaturabhngige Vernderungen der Konformation. Toxizittstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum besttigten die erwartete Biokompatibilitt.rnrnBasierend auf zwei Elastin-hnlichen Polypeptiden mit hnlicher Peptidsequenz wurden insgesamt vier unterschiedliche Makromonomere mit jeweils 20 Pentapeptid-Wiederholungseinheiten dargestellt. ber anschlieende grafting through Polymerisation entstanden molekulare Brstenmolekle mit variierenden externen funktionellen Gruppen, die fr zuknftige Konjugationsreaktionen verwendet werden knnen. Der Einfluss von Ionenstrke und Temperatur auf die Konformation der Makromonomere und Polymere wurde mittels Zirkulardichroismus- und Trbungskurven-Messungen untersucht und ein starker Einfluss der hohen Seitenkettendichte auf das Verhalten der Polymerbrsten wurde festgestellt. ber dynamische Lichtstreuung konnte ein von den externen funktionellen Gruppen abhngiges Aggregationsverhalten in humanem Blutserum nachgewiesen werden.rnrnDie in dieser Arbeit synthetisierten Polymerbrsten mit peptidischen Seitenketten stellen damit biokompatible und vielversprechende Trgersysteme fr die Konjugation mit Biomoleklen dar, die zuknftig als Drug Delivery-Systeme ihren Einsatz finden knnen.rn
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The presence of damaged nucleobases in DNA can negatively influence transcription of genes. One of the mechanisms by which DNA damage interferes with reading of genetic information is a direct blockage of the elongating RNA polymerase complexes an effect well described for bulky adducts induced by several chemical substances and UV-irradiation. However, other mechanisms must exist as well because many of the endogenously occurring non-bulky DNA base modifications have transcription-inhibitory properties in cells, whilstrnnot constituting a roadblock for RNA polymerases under cell free conditions. The inhibition of transcription by non-blocking DNA damage was investigated in this work by employing the reporter gene-based assays. Comparison between various types of DNA damage (UV-induced pyrimidine photoproducts, oxidative purine modifications induced by photosensitisation, defined synthetic modified bases such as 8-oxoguanine and uracil, and sequence-specific single-strand breaks) showed that distinct mechanisms of inhibition of transcription can be engaged, and that DNA repair can influence transcription of the affectedrngenes in several different ways.rnQuantitative expression analyses of reporter genes damaged either by the exposure of cells to UV or delivered into cells by transient transfection supported the earlier evidence that transcription arrest at the damage sites is the major mechanism for the inhibition of transcription by this kind of DNA lesions and that recovery of transcription requires a functional nucleotide excision repair gene Csb (ERCC6) in mouse cells. In contrast, oxidisedrnpurines generated by photosensitisation do not cause transcriptional blockage by a direct mechanism, but rather lead to transcriptional repression of the damaged gene which is associated with altered histone acetylation in the promoter region. The whole chain of events leading to transcriptional silencing in response to DNA damage remains to be uncovered. Yet, the data presented here identify repair-induced single-strand breaks which arise from excision of damaged bases by the DNA repair glycosylases or endonucleases as arnputative initiatory factor in this process. Such an indirect mechanism was supported by requirement of the 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) for the inhibition of transcription by synthetic 8-oxodG incorporated into a reporter gene and by the delays observed for the inhibition of transcription caused by structurally unrelated base modifications (8-oxoguanine and uracil). It is thereby hypothesized that excision of the modified bases could be a generalrnmechanism for inhibition of transcription by DNA damage which is processed by the base excision repair (BER) pathway. Further gene expression analyses of plasmids containing single-strand breaks or abasic sites in the transcribed sequences revealed strong transcription inhibitory potentials of these lesions, in agreement with the presumption that BER intermediates are largely responsible for the observed effects. Experiments with synthetic base modifications positioned within the defined DNA sequences showed thatrninhibition of transcription did not require the localisation of the lesion in the transcribed DNA strand; therefore the damage sensing mechanism has to be different from the direct encounters of transcribing RNA polymerase complexes with DNA damage.rnAltogether, this work provides new evidence that processing of various DNA basernmodifications by BER can perturb transcription of damaged genes by triggering a gene silencing mechanism. As gene expression can be influenced even by a single DNA damage event, this mechanism could have relevance for the endogenous DNA damage induced in cells under normal physiological conditions, with a possible link to gene silencing in general.
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Chapter 1 of this thesis comprises a review of polyether polyamines, i.e., combinations of polyether scaffolds with polymers bearing multiple amino moieties. Focus is laid on controlled or living polymerization methods. Furthermore, fields in which the combination of cationic, complexing, and pH-sensitive properties of the polyamines and biocompatibility and water-solubility of polyethers promise enormous potential are presented. Applications include stimuli-responsive polymers with a lower critical solution temperature (LCST) and/or the ability to gel, preparation of shell cross-linked (SCL) micelles, gene transfection, and surface functionalization.rnIn Chapter 2, multiaminofunctional polyethers relying on the class of glycidyl amine comonomers for anionic ring-opening polymerization (AROP) are presented. In Chapter 2.1, N,N-diethyl glycidyl amine (DEGA) is introduced for copolymerization with ethylene oxide (EO). Copolymer microstructure is assessed using online 1H NMR kinetics, 13C NMR triad sequence analysis, and differential scanning calorimetry (DSC). The concurrent copolymerization of EO and DEGA is found to result in macromolecules with a gradient structure. The LCSTs of the resulting copolymers can be tailored by adjusting DEGA fraction or pH value of the environment. Quaternization of the amino moieties by methylation results in polyelectrolytes. Block copolymers are used for PEGylated gold nanoparticle formation. Chapter 2.2 deals with a glycidyl amine monomer with a removable protecting group at the amino moiety, for liberation of primary amines at the polyether backbone, which is N,N-diallyl glycidyl amine (DAGA). Its allyl groups are able to withstand the harsh basic conditions of AROP, but can be cleaved homogeneously after polymerization. Gradient as well as block copolymers poly(ethylene glycol)-PDAGA (PEG-PDAGA) are obtained. They are analyzed regarding their microstructure, LCST behavior, and cleavage of the protecting groups. rnChapter 3 describes applications of multi(amino)functional polyethers for functionalization of inorganic surfaces. In Chapter 3.1, they are combined with an acetal-protected catechol initiator, leading to well-defined PEG and heteromultifunctional PEG analogues. After deprotection, multifunctional PEG ligands capable of attaching to a variety of metal oxide surfaces are obtained. In a cooperative project with the Department of Inorganic and Analytical Chemistry, JGU Mainz, their potential is demonstrated on MnO nanoparticles, which are promising candidates as T1 contrast agents in magnetic resonance imaging. The MnO nanoparticles are solubilized in aqueous solution upon ligand exchange. In Chapter 3.2, a concept for passivation and functionalization of glass surfaces towards gold nanorods is developed. Quaternized mPEG-b-PqDEGA diblock copolymers are attached to negatively charged glass surfaces via the cationic PqDEGA blocks. The PEG blocks are able to suppress gold nanorod adsorption on the glass in the flow cell, analyzed by dark field microscopy.rnChapter 4 highlights a straightforward approach to poly(ethylene glycol) macrocycles. Starting from commercially available bishydroxy-PEG, cyclic polymers are available by perallylation and ring-closing metathesis in presence of Grubbs catalyst. Purification of cyclic PEG is carried out using -cyclodextrin. This cyclic sugar derivative forms inclusion complexes with remaining unreacted linear PEG in aqueous solution. Simple filtration leads to pure macrocycles, as evidenced by SEC and MALDI-ToF mass spectrometry. Cyclic polymers from biocompatible precursors are interesting materials regarding their increased blood circulation time compared to their linear counterparts.rnIn the Appendix, A.1, a study of the temperature-dependent water-solubility of polyether copolymers is presented. Macroscopic cloud points, determined by turbidimetry, are compared with microscopic aggregation phenomena, monitored by continuous wave electron paramagnetic resonance (CW EPR) spectroscopy in presence of the amphiphilic spin probe and model drug (2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl (TEMPO). These thermoresponsive polymers are promising candidates for molecular transport applications. The same techniques are applied in Chapter A.2 to explore the pH-dependence of the cloud points of PEG-PDEGA copolymers in further detail. It is shown that the introduction of amino moieties at the PEG backbone allows for precise manipulation of complex phase transition modes. In Chapter A.3, multi-hydroxyfunctional polysilanes are presented. They are obtained via copolymerization of the acetal-protected dichloro(isopropylidene glyceryl propyl ether)methylsilane monomer. The hydroxyl groups are liberated through acidic work-up, yielding versatile access to new multifunctional polysilanes.
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Zylindrische Polymerbrsten mit pept(o)idischen Seitenketten sind auf Grund ihrer elongierten Topologie, Biovertrglichkeit und hohen Dichte an funktionellen Gruppen vielversprechende Kandidaten fr Anwendungen im Bereich des kontrollierten Wirkstoff- bzw. Gentransportes.In dieser Arbeit wurden Polylysin und Polysarkosin als Bestandteile der Seitenketten verwendet. Polylysin dient als positiv geladener Polypeptidblock fr die Komplexierung von Polynukleotiden. Polysarkosin reduziert mit seinem Stealth-Effekt die Toxizitt des Trgersystems und vermindert Wechselwirkungen mit dem Immunsystem. ber den grafting from-Ansatz und mit Hilfe der ringffnenden NCA-Polymerisation konnten erstmals zylindrische Brsten mit reinen Polysarkosin-Seitenketten sowie mit amphiphilen Seitenketten aus einem Polylysinkern und einer Polysarkosinschale hergestellt werden. Die Brsten wurden mittels Lichtstreuung, GPC, CD-Spektroskopie und AFM charakterisiert. Die hohe Biokompatibilitt beider Brsten konnte durch Toxizittstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum nachgewiesen werden.Die Polysarkosin-Brsten konnten zustzlich an den Seitenkettenenden mit Azidgruppen funktionalisiert werden, welche eine effektive Biokonjugation ermglichen. Die zylindrischen Brsten zeigten nach ihrer Modifikation keine unspezifische Aufnahme in dendritische Zellen und knnten somit als Ausgangssubstanzen fr die Synthese polymerbasierter Antikrper-Antigen-Konjugate in der Krebsimmuntherapie verwendet werden.Die Kern-Schale-Brsten konnten erfolgreich mit siRNA komplexiert werden, ohne dass dabei eine Aggregation auftrat. In ersten Gen-Knockdown-Experimenten zeigten ihre Komplexe eine signifikante Verminderung der ApoB100-Proteinexpression in AML-12 Hepatozyten und knnten daher zuknftig als Transfektionsmittel in der Gentherapie ihren Einsatz finden.
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Der Fokus dieser Arbeit lag in der Synthese von funktionellen HPMA-Copolymeren, sowohl fr die Darstellung definierter Polymer-Antikrper Konjugate, als auch zum effizienten Transport von p-DNA in Polymer-DNA Komplexen (Polyplexe). Nach ausfhrlicher physikalischer und chemischer Charakterisierung wurden gezielt ihre Wechselwirkungen mit (Immun)-Zellen untersucht und so ihr Potential fr die Verwendung in der Tumor-Immuntherapie aufgezeigt.rnFr das gezielte Ansprechen von bestimmten Immunzellen mit Schlsselfunktionen besitzen monoklonale Antikrper ein groes Potential. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Darstellung definierter Polymer-Antikrper Konjugate ber das gezielte Einfhren von Thiol-Gruppen an Antikrper und die Synthese eng verteilter, Maleinimid funktionalisierter HPMA-Copolymere. Diese sehr gut definierten, funktionellen HPMA-Copolymere konnten ber die Kombination der RAFT-Polymerisation und Reaktivester Polymeren gewonnen werden. Unterschiedliche Polymerstrukturen ermglichten die Synthese verschiedener Arten von Polymer-Antikrper Konjugaten. Speziell die Untersuchung der verschiedenen Konjugate aus dem fr dendritische Zellen spezifischen aDEC-205 Antikrper an Immunzellen aus dem Knochenmark von Musen lieferten wertvolle Erkenntnisse ber Struktur-Wirkungsbeziehungen und zeigten die Mglichkeit der gezielten Adressierung von Immunzellen mit Schlsselfunktionen bei der Aktivierung einer (Tumor)-Immunabwehr am Beispiel von dendritischen Zellen. Gleichzeitig erlaubt der Syntheseweg sowohl die gleichzeitige und kontrollierte Einfhrung auch komplexerer Stimuli am Polymerrckgrat als auch die Verwendung verschiedener Antikrper.rnber die Kombination der RAFT-Polymerisation und polymeren Reaktivestern wurde ebenso die Synthese von neuartigen kationisch-hydrophilen Polylysin-b-poly(HPMA) Blockcopolymeren als effiziente Transporter fr den komplexen aber wirkungsvollen Wirkstoff p-DNA in Form von Polymer-DNA Komplexen (Polyplexe) realisiert. Da diese Polyplexe gleichzeitig eine Abschirmung der sensitiven p-DNA ber eine poly(HPMA)-Korona vermitteln, stellen sie allgemein ein geeignetes Transportmittel fr einen therapeutischen Transport von p-DNA dar. Diese Polyplexe sind in der Lage, humane Nierenkarzinomzellen (HEK-293T Zelllinie) zu transfizieren ohne signifikante Zytotoxizitt zu zeigen. Darber hinaus gelang eine groe Steigerung der Transfektionseffizienz, ohne eine gleichzeitige Erhhung der Zytotoxizitt, durch die gezielte Einfhrung von Redox-stimuliresponsiven Disulfid-Gruppen zwischen den einzelnen Blcken. Diese Polyplexe stellen einen polymeren Vektor zur transkriptionellen Regulierung von Zellen dar, zum Beispiel fr die transkriptionelle Aktivierung von dendritischen Zellen, durch die Verwendung speziell dafr modifizierter p-DNA-Konstrukte. rnDurch die Verknpfung einer ortsspezifischen enzymatischen Kopplung und kupferfreien Cyclooctin-Azid Kupplung gelang die kontrollierte und kovalente Modifizierung von polymeren Mizellen mit aDEC-205 Antikrpern an der hydrophilen poly(HPMA)-Korona. Diese Methode bietet die Mglichkeit der Anbindung der effektiven aber anspruchsvollen Erkennungsstruktur Antikrper an komplexere Polymerstrukturen und andere nano-partikulren Systeme, zum Beispiel an die zuvor genannten Polyplexe, um eine zellspezifische und verbesserte Aufnahme und Prozessierung zu erreichen.rnDiese Studien zeigen somit, sowohl die Mglichkeit der selektiven Addressierung von Immunzellen mit Schlsselfunktionen wie dendritischer Zellen, als auch die Mglichkeit der transkriptionellen Regulation von Zellen durch Polyplexe. Sie stellen somit einen ersten Schritt zur Herstellung funktioneller, nanopartikulrer Systeme zur Verwendung in der Tumor-Immuntherapie dar. rn
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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines nichtviralen, effizienten Transfektionsmittels mit einer Kern-Schale-Struktur in der Grenordnung bis 100 nm. Dafr werden magnetische, negativ geladene Eisenoxid-Nanopartikel mittels Thermolyse mit einem Durchmesser von 17 nm synthetisiert und in Wasser berfhrt. Diese Nanopartikel bilden den Kern des Erbgut-Trgers und werden mittels Layer-by-Layer Verfahren (LbL) mit geladenen Polymeren, den bioabbaubaren Makromoleklen Poly-L-Lysin und Heparin, beschichtet. Dafr wird zunchst eine geeignete Apparatur aufgebaut. Diese wird zur Herstellung von Kern-Schale-Strukturen mit fnf Polyelektrolytschichten verwendet und liefert Partikel mit einem hydrodynamischen Durchmesser von 58 nm, die bei Abwesenheit von niedermolekularem Salz aggregatfrei sind. Das System wird gegen Salz stabilisiert, indem die letzte Poly-L-Lysin-Schicht mit Polyethylenglycol modifiziert wird. Die so entstandenen Multischalenpartikel zeigen weder im PBS-Puffer noch in humanem Serum Aggregation. Mittels winkelabhngiger dynamischer Lichtstreuung wird die Aggregatbildung kontrolliert, whrend -Potential-Messungen die Kontrolle der Oberflchenladung erlauben.rnDa siRNA auf Grund ihres negativ geladenen Phosphat-Rckgrats ebenfalls ein Polyelektrolyt ist, wird sie aggregatfrei auf die positiv geladenen PLL-Nanopartikel aufgetragen. Die eingesetzte siRNA ist farbstoffmarkiert, um eine Detektion in vitro zu ermglichen. Jedoch sind die entstandenen Komplexe mittels Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie (FCS) nicht nachweisbar. Auch die Fluoreszenzmarkierung der PEGylierten Auenschale mittels kupferfreier Click-Chemie ist in der FCS nicht sichtbar, sodass eine Fluoreszenzauslschung der Farbstoffe in den Multischalenpartikeln vermutet wird.rn
