Magnetische Multischalenpartikel für den Transport von siRNA

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines nichtviralen, effizienten Transfektionsmittels mit einer Kern-Schale-Struktur in der Größenordnung bis 100 nm. Dafür werden magnetische, negativ geladene Eisenoxid-Nanopartikel mittels Thermolyse mit einem Durchmesser von 17 nm synthetisiert und in Wasser überführt. Diese Nanopartikel bilden den Kern des Erbgut-Trägers und werden mittels Layer-by-Layer –Verfahren (LbL) mit geladenen Polymeren, den bioabbaubaren Makromolekülen Poly-L-Lysin und Heparin, beschichtet. Dafür wird zunächst eine geeignete Apparatur aufgebaut. Diese wird zur Herstellung von Kern-Schale-Strukturen mit fünf Polyelektrolytschichten verwendet und liefert Partikel mit einem hydrodynamischen Durchmesser von 58 nm, die bei Abwesenheit von niedermolekularem Salz aggregatfrei sind. Das System wird gegen Salz stabilisiert, indem die letzte Poly-L-Lysin-Schicht mit Polyethylenglycol modifiziert wird. Die so entstandenen Multischalenpartikel zeigen weder im PBS-Puffer noch in humanem Serum Aggregation. Mittels winkelabhängiger dynamischer Lichtstreuung wird die Aggregatbildung kontrolliert, während ζ-Potential-Messungen die Kontrolle der Oberflächenladung erlauben.rnDa siRNA auf Grund ihres negativ geladenen Phosphat-Rückgrats ebenfalls ein Polyelektrolyt ist, wird sie aggregatfrei auf die positiv geladenen PLL-Nanopartikel aufgetragen. Die eingesetzte siRNA ist farbstoffmarkiert, um eine Detektion in vitro zu ermöglichen. Jedoch sind die entstandenen Komplexe mittels Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie (FCS) nicht nachweisbar. Auch die Fluoreszenzmarkierung der PEGylierten Außenschale mittels kupferfreier Click-Chemie ist in der FCS nicht sichtbar, sodass eine Fluoreszenzauslöschung der Farbstoffe in den Multischalenpartikeln vermutet wird.rn

The present work deals with the development of a non-viral, efficient transfection agent with a core-shell structure and a size below 100 nm. Magnetic, negatively charged iron oxide nanoparticles (d = 17 nm) are synthesized via thermal decomposition and transferred into water. They form the core of the gene carrier system and are coated with charged and biodegradable polymers like poly-L-lysine and heparin. First, a device is designed for this layer-by-layer assembly. This device is then used to synthesize core-shell structures with five polyelectrolyte layers, which have a hydrodynamic diameter around 58 nm and are aggregation-free in the absence of low-molecular salt. To stabilize the system, the last poly-L-lysine layer is modified wit polyethylene glycol. The developed multilayer particles show no aggregation in PBS-buffer or human serum. Possible aggregation is monitored by angle-dependent dynamic light scattering, whereas the surface charge is controlled via ζ-potential measurement. rnBecause of the negatively charged phosphate backbone, siRNA is also a polyelectrolyte. Therefore it is coated onto positive charged PLL-nanoparticles without the occurrence of aggregation. For detection in vitro the siRNA is fluorochrome labeled. However, the resulting complexes cannot be detected via fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Next, the PEGylated outer layer of the synthesized particles is fluorescent labeled by copper-free click chemistry. The corresponding multilayer particles are also not detectable with FCS, therefore possible quenching effects can be assumed. rnrn