Polykation-DNA-Komplexe : Eigenschaften und Anwendung in der Gentransfektion

Polykationen bilden mit DNA spontan Komplexe. Triebkraft ist der Entropiegewinn durch Freisetzung der Gegenionen auf den Polyelektrolyten. Solche Komplexe können in der Gentechnik verwendet werden, um fremde DNA in eine Zelle einzuschleusen. Dies bezeichnet man als Gentransfektion. In dieser Arbeit werden erstmals bürstenförmige Polykationen mit wurmförmiger Topologie zur Gentransfektion verwendet. Dazu wurde die Komplexierung von DNA mit Bürstenpolymeren mit Poly-L-Lysin- und Polyvinylpyridinium-Seitenketten und linearen Polykationen untersucht. Die Komplexbildung verläuft in allen Fällen kinetisch kontrolliert, alle Polykationen bilden sphärische Komplexe, die Topologie hat keinen Einfluss auf die Komplexgröße. Komplexe aus Bürstenpolymeren transfizieren mehr als 25% der gesamten Zellpopulation bei Schweinehirnendothelzellen. Gegenüber dem kommerziellen Transfektionsmittel Lipofektamin konnte eine deutliche Steigerung um bis zu 400% erreicht werden. Komplexe, die mit linearen Analoga gebildet wurden, zeigten bei gleicher Komplexgröße Transfektionsraten unter 5%. Freisetzungsversuche zeigen, dass die Komplexe, die gut transfizieren, recht labil sind, also die DNA unter Kompetitoreinfluss freisetzen können. Stabile Komplexe haben geringe Transfektionseffizienzen. Ebenso wichtig ist der Schutz der DNA vor Abbau durch DNase. Die PVP-Bürste bietet als einziges der untersuchten Polykationen diesen Schutz und zeigt auch die besten Transfektionsraten. Zusätzlich zu der medizinischen Anwendung wurde die Kinetik der Komplexbildung untersucht. Dazu wurde ein spezieller Aufbau entwickelt, der es ermöglicht die Streuintensität der Komplexlösung bei kleinen Streuwinkeln zeitaufgelöst im Millisekundenbereich zu detektieren. Die Komplexbildung verläuft diffusionskontrolliert, im Bereich von Ladungsverhältnissen (positive zu negativen Ladungen) von 1.8 bis 4.0 schließt sich ein fraktales Wachstum an.

Polycations spontaneously form complexes with DNA. The driving force is the gain of entropy by release of the counterions from the polyelectrolytes. Those complexes may be used in gene technology to introduce foreign DNA into a cell. Such a process is called gene transfection. In this thesis, brush like polycations with a stiff, worm like topology are used for the first time in gene transfection. The complexation between DNA and brush like polycations with poly-L-lysine and quaternized poly(vinylpyridine) sidechains and linear analogues was investigated. In all cases, the complex formation is kinetically controlled. All polycations form spherical complexes, topology does not influence the complex size. Complexes formed by brush like polymers show a transfection rate of more than 25% on borcine brain microvessel endothelial cells. Compared to the commercial standard Lipofectamine an increase of 400% is reached. Complexes formed with the linear analogues only transfect less than 5% of the total cell population. Release experiments show that complexes that are able to release DNA under influence of competitors are also good transfection agents. In contrast, very stable complexes have poor transfection efficiencies. As important is the ability of the complex to protect the DNA against degradation by DNase. Only the quaternized poly(vinylpyridine) is performing well in this test and accordingly also shows high efficiency in transfection experiments. In addition to the medical application, the kinetics of the complex formation was investigated. A new setup was designed allowing the time resolved detection of scattered light at small scattering angles in the millisecond-regime. The complex formation is diffusion controlled, which is followed by a fractal growth for charge ratios (positive to negative charges) between 1.8 and 4.0.