COBAMOS: Endnutzerprogrammierung auf Basis nachrichtenbasierter Komponentenvernetzung

Die Aufgabenstellung, welche dieser Dissertation zugrunde liegt, l��sst sich kurz als die Untersuchung von komponentenbasierten Konzepten zum Einsatz in der Softwareentwicklung durch Endanwender beschreiben. In den letzten 20 bis 30 Jahren hat sich das technische Umfeld, in dem ein Gro��teil der Arbeitnehmer seine t��glichen Aufgaben verrichtet, grundlegend ver��ndert. Der Computer, fr��her in Form eines Gro��rechners ausschlie��lich die Dom��ne von Spezialisten, ist nun ein selbstverst��ndlicher Bestandteil der t��glichen Arbeit. Der Umgang mit Anwendungsprogrammen, die dem Nutzer erlauben in einem gewissen Rahmen neue, eigene Funktionalit��t zu definieren, ist in vielen Bereichen so selbstverst��ndlich, dass viele dieser T��tigkeiten nicht bewusst als Programmieren wahrgenommen werden. Da diese Nutzer nicht notwendigerweise in der Entwicklung von Software ausgebildet sind, ben��tigen sie entsprechende Unterst��tzung bei diesen T��tigkeiten. Dies macht deutlich, welche praktische Relevanz die Untersuchungen in diesem Bereich haben. Zur Erstellung eines Programmiersystems f��r Endanwender wird zun��chst ein flexibler Anwendungsrahmen entwickelt, welcher sich als Basis zur Erstellung solcher Systeme eignet. In Softwareprojekten sind sich ��ndernde Anforderungen und daraus resultierende Notwendigkeiten ein wichtiger Aspekt. Dies wird im Entwurf des Frameworks durch Konzepte zur Bereitstellung von wieder verwendbarer Funktionalit��t durch das Framework und M��glichkeiten zur Anpassung und Erweiterung der vorhandenen Funktionalit��t ber��cksichtigt. Hier ist zum einen der Einsatz einer serviceorientierten Architektur innerhalb der Anwendung und zum anderen eine komponentenorientierte Variante des Kommando-Musters zu nennen. Zum anderen wird ein Konzept zur Kapselung von Endnutzerprogrammiermodellen in Komponenten erarbeitet. Dieser Ansatz erm��glicht es, unterschiedliche Modelle als Grundlage der entworfenen Entwicklungsumgebung zu verwenden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wird ein Programmiermodell entworfen und unter Verwendung des zuvor genannten Frameworks implementiert. Damit dieses zur Nutzung durch Endanwender geeignet ist, ist eine Anhebung der zur Beschreibung eines Softwaresystems verwendeten Abstraktionsebene notwendig. Dies wird durch die Verwendung von Komponenten und einem nachrichtenbasierten Kompositionsmechanismus erreicht. Die vorgenommene Realisierung ist dabei noch nicht auf konkrete Anwendungsfamilien bezogen, diese Anpassungen erfolgen in einem weiteren Schritt f��r zwei unterschiedliche Anwendungsbereiche.

3D-Cryo-Elektronenmikroskopie des 4x6-H��mocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum unter Oxy- und Deoxybedingungen

Arthropodenh��mocyanine und Molluskenh��mocyanine, die extrazellul��ren Atmungsproteine der Arthropoden und Mollusken, unterscheiden sich grunds��tzlich im Aufbau, besitzen aber ��hnliche aktive Zentren, welche in ihrer oxydierten Form f��r die Blauf��rbung der H��mocyanine verantwortlich sind. Sauerstoff wird im Bindungszentrum zwischen zwei, von sechs Histidinen ligandierten, Kupfer(I)Ionen gebunden. Arthropodenh��mocyanine bauen sich artspezifisch aus 1, 2, 4, 6, oder 8 Hexameren mit D3-Symmetrie auf. Die Untereinheiten von je ca. 75 kDa falten sich in drei Dom��nen unterschiedlicher Funktionen. Der komplexe, hierarchische Zusammenbau der Arthropodenh��mocyanine h��ngt von der Heterogenit��t der Untereinheiten ab. Die 7 verschieden Sequenzen des 4x6-H��mocyanins von Eurypelma californicum (EcHc) sind biochemisch in der Quart��rstruktur lokalisiert. Bislang fehlte noch ein unabh��ngig erstelltes 3D-Modell der geometrischen Gesamtstruktur welche die hexamere und monomere Topographie eindeutig zeigt. Dessen Erstellung war Gegenstand dieser Arbeit, in Verbindung mit der Zielsetzung, die 3D-Rekonstruktion in den beiden extremen physiologischen Zust��nden, mit und ohne gebundenen Sauerstoff, zu erzeugen. Dazu wurden in einer eigens entwickelten Atmosph��ren-Pr��parationskammer die Proteine in L��sung schockgefrorenen und mittels Cryo-3D-Elektronenmikroskopie gemessen. Aus den daraus gewonnen Projektionsbildern lie��en sich mit der ���Single Particle Analyse��� die 3D-Informationen zur��ckberechnen. Die 3D-Rekonstruktionen wurden mit der publizierten R��ntgenkristallstruktur des hexameren Referenz-H��mocyanins der Languste Panulirus interruptus verifiziert. Die Rekonstruktionen erlaubten die eindeutige Messung diverser in der Literatur diskutierter Parameter der Architektur des 4x6-EcHc und dar��ber hinaus weiterer geometrischer Parameter, welche hier erstmals ver��ffentlicht werden. SAXS-Daten sagen extreme Translationen und Rotationen von Teilquart��rstrukturen zwischen oxy- und deoxy-EcHc voraus, was von den 3D-Rekonstruktionen der beiden Zust��nde nicht best��tigt werden konnte: Die 16 �� Rekonstruktion der Deoxyform weicht geometrisch nicht von der 21 �� Rekonstruktion der Oxyform ab. Die Einpassung der publizierten R��ntgenstruktur der Untereinheit II des H��mocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus in die Rekonstruktionen unterst��tzt eine auf der hexameren Hierarchieebene lokalisierte Dynamik der Oxygenierung. Mittels Einpassung modellierter molekularer Strukturen der EcHc-Sequenzen konnte eine erste Vermutung zur Lokalisation der beiden zentralen Linker-Untereinheiten b und c des 4x6-Molek��ls gemacht werden: Demnach w��rde Untereinheit b in den exponierten Hexameren des Molek��ls liegen. Aussagen ��ber die Quart��rstrukturbindungen auf molekularer Ebene aufgrund der Einpassung modellierter molekularer Daten in die Rekonstruktionen sind als spekulativ einzustufen: a) Die Aufl��sung der Rekonstruktion ist verbesserungsw��rdig. b) Es gibt keine ad��quate Vorlage f��r eine verl��ssliche Strukturvorhersage; die verschiedenen EcHc-Sequenzen liegen nur als Modellierung vor. c) Es w��re eine flexible Einpassung notwendig, um Ungenauigkeiten in den modellierten Strukturen durch Sekund��rstrukturanpassung zu minimieren.

Struktur-Dynamik-Beziehungen in amorphen festen L��sungen

Feste L��sungen homogen dispergierter Wirkstoffmolek��le in amorphen Polymermatrizen sind wichtige Materialien in vielen pharmazeutischen Anwendungen, bei denen eine kontrollierte Abgabe wasserunl��slicher Wirkstoffe in w��ssrige Systeme eine Rolle spielt. Die intermolekulare Bindungs-st��rke zwischen Polymer- und Wirkstoffmolek��lgruppen bestimmt die Stabilit��t der festen L��sung und steuert somit die biologische Aktivit��t der Wirkstoffmolek��le. In festen L��sungen, die aus acryl-s��urehaltigen Copolymeren (Protonendonoren) und basischen Wirkstoffmolek��len (Protonenakzepto-ren) hergestellt werden, sind intermolekulare Wasserstoffbr��cken zwischen den Systemkomponenten Triebkraft f��r die Bildung einer stabilen homogenen Dispersion und f��r die Entstehung struktureller Merkmale zwischen den Molek��lgruppen der Systemkomponenten. Zudem ist die Bindungsst��rke der Wasserstoffbr��cken im Hinblick auf die kontrollierte Abgabe der Wirkstoffe von Bedeutung. Da dynamische chemische Gleichgewichte bei der Bildung der Wasserstoffbr��cken eine wichtige Rolle spielen m��ssen neben strukturellen Parametern auch dynamische Faktoren beleuchtet werden. Ziel dieser Arbeit ist neben der Ermittlung von intermolekularen Bindungsst��rken vor allem die Identifika-tion struktureller Verh��ltnisse zwischen den Systemkomponenten auf molekularer Ebene. Die Be-stimmung der Abh��ngigkeit dieser Parameter von der Struktur der verwendeten Polymere und einer Vielzahl weiterer Einfl��sse wie z.B. Feuchtigkeit, Lagerdauer oder Wirkstoffkonzentration soll ein kontrolliertes Design fester L��sungen mit definierten anwendungsspezifischen Eigenschaften erm��gli-chen. Temperaturabh��ngige 1H-Festk��rper-MAS-NMR (Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance) Experimente an festen L��sungen mit unterschiedlichen Copolymer-Zusammensetzungen weisen die Existenz dynamischer chemischer Gleichgewichte in den komplexen Wasserstoffbr��cken-netzwerken nach. Ver��nderungen in der chemischen Verschiebung und in der Linienform der Reso-nanzlinien acider Protonen erlauben einen tiefen Einblick in die Architektur dieser Netzwerke und legen die Bindungsverh��ltnisse unter Ber��cksichtigung der Polymerchemie und der Mobilit��t der Systemkomponenten dar, wobei die Befunde mithilfe quantenchemischer Rechnungen untermauert werden k��nnen. Die Gegenwart acider Protonen erm��glicht einen einfachen 1H-2H-Austausch, wor-aufhin mithilfe rotorsynchronisierter temperaturabh��ngiger 2H-MAS-NMR Experimente die Wasser-stoffbr��ckenbindungsst��rke bestimmt werden kann. Mit 1H-1H-Korrelationsexperimenten (Doppelquantenspektroskopie) stehen Methoden f��r die Bestimmung homonuklearer dipolarer 1H-1H-Kopplungen zur Verf��gung, die strukturelle Aussagen aufgrund von bevorzugten r��umlichen Kontak-ten bestimmter Molek��lgruppen erm��glichen. Weiterhin k��nnen diese Experimente verwendet werden, um Wasserstoffbr��cken zwischen Polymergruppen von Polymer-Wirkstoff-Wasserstoffbr��cken zu unterscheiden, wodurch eine quantitative Beschreibung des Bindungsnetzwerks und der Konkurrenz-prozesse zwischen den einzelnen wasserstoffverbr��ckten Spezies erm��glicht wird. Eine Kristallisation der Wirkstoffmolek��le ist in vielen Anwendungen unerw��nscht, da sie die biologische Verf��gbarkeit des Wirkstoffs reduzieren. Mit 1H-Festk��rper-MAS-NMR Experimenten k��nnen kristalline von amorph dispergierten Wirkstoffmolek��len unterschieden werden, wodurch eine Quantifizierung der Destabilisierungsprozesse erm��glicht wird, die durch Exposition der festen L��sungen mit Wasserdampf ausgel��st werden k��nnen. Die Zeit- und Konzentrationsabh��ngigkeit der Wasseraufnahme kann mit NMR-Experimenten verfolgt werden, wobei unterschiedlich mobile Was-serspezies an unterschiedlichen Bindungsorten identifiziert werden k��nnen, was zum molekularen Verst��ndnis der Destabilisierungsprozesse beitr��gt. Zus��tzlich wird die Mobilit��t der Wirkstoffmole-k��le bestimmt, die sich ��� wie auch die Wirkstoffkonzentration - als wichtige Gr����e in der Beschrei-bung der Destabilisierung erweist. Aufbauend auf den Beobachtungen wird ein Zusammenhang zwischen der Copolymerzusammensetzung und einer kritischen Wirkstoffkonzentration hergestellt, der f��r die Anwendungen amorpher fester L��sungen in biologischen Systemen von gro��er Bedeutung ist.

Biomimese biologischer Membranen: Konzeptionierung, Synthese und biophysikalische Charakterisierung einer Hierarchie festk��rpergest��tzter Mimikry biologischer Membranen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Modelle zur funktionellen Mimiese biologischer Membranen im Bereich der Bionanotechnologie entwickelt. Um den Rahmen der notwendigen Faktoren und Komponenten f��r biomimetische Membranmodelle abzustecken, wurde das biologische Vorbild im Bezug auf Zusammensetzung, Organisation und Funktion analysiert. Die daraus abgeleiteten Erkenntnisse erlauben das Erreichen von biologisch relevanten Membranwiderst��nden im Bereich von mehreren MOhm cm2 und eine gute lokale Fluidit��t. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Hierachie unterschiedlich stark von der Festk��rperoberfl��che entkoppelter Membranen zur Vergr����erung des submembranen Raumes. Diese Ziele konnten realisiert werden. Das auf archaealen Etherlipiden basierende DPTL-System wurde analog dem biologischen Vorbild stereoselektiv synthetisiert und ist in der Lage die Membran bei maximaler Elongation des TEG-Spacers mit mehr als 2 nm von der Oberfl��che zu entkoppeln. Die erzielten Wiederst��nde liegen im hohen ein- bis zweistelligen MOhm-Bereich, die Kapazit��t entspricht mit 0,5 ��F cm-2 ebenfalls dem Wert biologischer Membranen. Die Membraneigenschaften wurden mit Hilfe von SPS, EIS, IR-Spektroskopie, QCM, AFM und Kontaktwinkelmessungen charakterisiert. Die Funktionalit��t und lokale Fluidit��t der DPTL-Membran konnte anhand des Valinomycin vermittelten K+-Transports ��ber die Membran gezeigt werden. Fluide Elektroden oder laterale Verd��nnung mit TEGL erlauben den Einbau gr����erer Ionenkan��le. Lipo-Glycopolymere (LGP) mit unterschiedlichen Kettenl��ngen wurden mit Hilfe der kontrollierten radikalischen Polymerisation mit einer PD < 1.2 synthetisiert. Es zeigte sich, da�� die Vororientierung der LGPs auf dem LB-Trog, gefolgt von einem LB-��bertrag auf einen funktionalisierten Tr��ger mit photoreaktivem SAM, nach Belichten des Systems zu einer verl��sslichen kovalenten Anbindung der supramolekularen LGP-Architektur f��hrt. Da die Lipo-Glycopolymerketten am Glycopolymerterminus nur mit oberfl��chennahen Repetiereinheiten an die photoaktivierte Oberfl��che binden, sind sie in der Lage Oberfl��chenrauhigkeiten des Festk��rpersubstrates auszugleichen. Die photochemische Immobilisierung von funktionell orientierten supramolekularen LGP-Architekturen auf Goldoberfl��chen resultiert in tBLMs mit gro��en vertikalen Enkopplungen der Membran von der Festk��rperoberfl��che (>8 nm). Der funktionelle Ionentransport von Kaliumionen durch Valinomycin zeigt eine ausreichende lokale Fluidit��t der Membran die mit einem guten Membranwiderstand (mehrere MOhm) kombiniert ist. Gro��e Membran-Oberfl��chenentkopplungen konnten mit Hilfe plasmapolymerisierter elektrophiler Polymere erreicht werden. Filmdicken von 50 nm sind mit homogener Oberfl��che und Rauhigkeiten im Bereich von Nanometern m��glich. Das System zeigt interessante fluide Eigenschaften mit guten Erholungsraten bei FRAP-Experimenten (Diffusionskonstanten von etwa 17 mikro m2 s-1). Die elektrischen Eigenschaften liegen mit Widerst��nden von wenigen kOhm unterhalb der f��r gute Membranmimikrie notwendigen Werte. Erstmalig konnte gezeigt werden, da�� mit Hilfe dieser Methode inerte Polymere/Plastiktr��ger (zum Beispiel Polypropylen und TOPAS) in effizienter Weise kovalent mit reaktiven Polymeroberfl��chen modifiziert werden k��nnen (Anwendung als DNA-Chip ist beschrieben).

Strukturelle, enzymkinetische und thermodynamische Untersuchungen am KLH, dem H��mocyanin der Schl��ssellochschnecke Megathura crenulata

H��mocyanine sind gro��e, kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine, die bei zahlreichen Schnecken extrazellul��r in der H��molymphe vorkommen. Das Keyhole Limpet-H��mocyanin (KLH) der Schl��ssellochschnecke Megathura crenulata dient aufgrund seiner immunstimu-latorischen Eigenschaften seit vielen Jahren als Modellprotein in der Immunologie. In der Klinik wird es als Hapten- und Vakzincarrier sowie als Medikament gegen oberfl��chliche Harnblasenkarnzinome eingesetzt. Die Quart��rstruktur des KLH besteht aus einem Hohl-zylinder mit einer Molek��lmasse von 8 MDa und einem Durchmesser von 35 nm. Dieses sogenannte Didekamer setzt sich aus 20 Untereinheiten mit jeweils 400 kDa zusammen. Jede Untereinheit l��sst sich weiter in acht funktionelle Einheiten a bis h (engl. Functional Units = FU) mit ~ 50 kDa unterteilen. Die FUs a bis f bilden die Wandregion des Molek��ls, w��hrend der Kragen aus den FUs g und h geformt wird. Die Struktur der Wandregion sowie der FU-g konnte bisher bereits durch R��ntgenstrukturanalysen aufgekl��rt werden. Bez��glich der Struktur der FU-h, die sich durch eine spezielle C-terminale Verl��ngerung von ~ 100 Amino-s��uren auszeichnet, sind allerdings noch keine Informationen verf��gbar. Um die Architektur des Kragens zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zun��chst Strategien entwickelt, diese spezielle FU in gro��er Menge und Reinheit zu isolieren. Anschlie��end konnten Bedingungen gefunden werden, die zur Ausbildung 0,2 mm gro��er, hexagonaler Kristalle f��hrten. Diese ergaben am Synchrotron eine Aufl��sung von 4 ��. Durch Auswertung der R��ntgenstrukturdaten konnte f��r die C-terminale Zusatzdom��ne der FU-h eine Cupredoxin-��hnliche Typ I-Kupferfaltung ermittelt werden. Der Nachweis eines zus��tzlichen Kupfer-atoms innerhalb dieser Dom��ne bedarf allerdings einer h��heren Aufl��sung der Kristall-struktur. H��mocyanine lassen sich aufgrund ihrer evolution��ren Verwandtschaft zu Phenol-oxidasen mit Hilfe verschiedener in vitro-Aktivatoren zur Catecholoxidase und teilweise auch zur Tyrosinase aktivieren. Beim KLH konnte in dieser Arbeit eine eindeutige Diphenolase- und sogar eine schwache Monophenolase-Aktivit��t der FUs-a und -f nach SDS-Aktivierung nachgewiesen werden. Zudem konnte eine geringf��gige intrinsische Diphenolase-Aktivit��t dieser FUs belegt werden. Die enzymatischen Reaktionen waren sowohl von der gew��hlten Puffersubstanz, als auch der Anwesenheit bivalenter Kationen abh��ngig. Tris wirkt vermutlich als allosterischer Effektor und steigerte den Substrat-Umsatz, w��hrend Mg2+-Ionen zu einer starken Inhibition der katalytischen Aktivit��t f��hrten. Die Kl��rung einer m��glichen physiologischen Funktion der Phenoloxidase-Aktivit��t des KLH sowie potenziellen in vivo-Aktivatoren steht noch aus. Studien zur thermischen Stabilit��t des KLH resultierten in einer irreversiblen Denaturierung des Proteins. Die Schmelzpunkte deuteten auf eine hohe Tempe-raturstabilit��t des KLH, vor allem in Anwesenheit bivalenter Kationen. Eine H��mocyanin-typische Abh��ngigkeit der Hitzeresistenz vom Oligomerisierungsgrad lie�� sich nicht feststellen, da sowohl bei der FU-h als auch den KLH-Didekameren eine vergleichbar hohe thermische Stabilit��t, bei einer nach wie vor vorhandenen Oxygenierung beobachtet wurde.

Optical resonances of sphere-on-plane geometries

The optical resonances of metallic nanoparticles placed at nanometer distances from a metal plane were investigated. At certain wavelengths, these ���sphere-on-plane��� systems become resonant with the incident electromagnetic field and huge enhancements of the field are predicted localized in the small gaps created between the nanoparticle and the plane. An experimental architecture to fabricate sphere-on-plane systems was successfully achieved in which in addition to the commonly used alkanethiols, polyphenylene dendrimers were used as molecular spacers to separate the metallic nanoparticles from the metal planes. They allow for a defined nanoparticle-plane separation and some often are functionalized with a chromophore core which is therefore positioned exactly in the gap. The metal planes used in the system architecture consisted of evaporated thin films of gold or silver. Evaporated gold or silver films have a smooth interface with their substrate and a rougher top surface. To investigate the influence of surface roughness on the optical response of such a film, two gold films were prepared with a smooth and a rough side which were as similar as possible. Surface plasmons were excited in Kretschmann configuration both on the rough and on the smooth side. Their reflectivity could be well modeled by a single gold film for each individual measurement. The film has to be modeled as two layers with significantly different optical constants. The smooth side, although polycrystalline, had an optical response that was very similar to a monocrystalline surface while for the rough side the standard response of evaporated gold is retrieved. For investigations on thin non-absorbing dielectric films though, this heterogeneity introduces only a negligible error. To determine the resonant wavelength of the sphere-on-plane systems a strategy was developed which is based on multi-wavelength surface plasmon spectroscopy experiments in Kretschmann-configuration. The resonant behavior of the system lead to characteristic changes in the surface plasmon dispersion. A quantitative analysis was performed by calculating the polarisability per unit area ���/A treating the sphere-on-plane systems as an effective layer. This approach completely avoids the ambiguity in the determination of thickness and optical response of thin films in surface plasmon spectroscopy. Equal area densities of polarisable units yielded identical response irrespective of the thickness of the layer they are distributed in. The parameter range where the evaluation of surface plasmon data in terms of ���/A is applicable was determined for a typical experimental situation. It was shown that this analysis yields reasonable quantitative agreement with a simple theoretical model of the sphere-on-plane resonators and reproduces the results from standard extinction experiments having a higher information content and significantly increased signal-to-noise ratio. With the objective to acquire a better quantitative understanding of the dependence of the resonance wavelength on the geometry of the sphere-on-plane systems, different systems were fabricated in which the gold nanoparticle size, type of spacer and ambient medium were varied and the resonance wavelength of the system was determined. The gold nanoparticle radius was varied in the range from 10 nm to 80 nm. It could be shown that the polyphenylene dendrimers can be used as molecular spacers to fabricate systems which support gap resonances. The resonance wavelength of the systems could be tuned in the optical region between 550 nm and 800 nm. Based on a simple analytical model, a quantitative analysis was developed to relate the systems��� geometry with the resonant wavelength and surprisingly good agreement of this simple model with the experiment without any adjustable parameters was found. The key feature ascribed to sphere-on-plane systems is a very large electromagnetic field localized in volumes in the nanometer range. Experiments towards a quantitative understanding of the field enhancements taking place in the gap of the sphere-on-plane systems were done by monitoring the increase in fluorescence of a metal-supported monolayer of a dye-loaded dendrimer upon decoration of the surface with nanoparticles. The metal used (gold and silver), the colloid mean size and the surface roughness were varied. Large silver crystallites on evaporated silver surfaces lead to the most pronounced fluorescence enhancements in the order of 104. They constitute a very promising sample architecture for the study of field enhancements.

Vibrational spectroscopic and electrochemical investigations of multi-centered heme proteins in biomimetic membrane architectures

Membrane proteins play a major role in every living cell. They are the key factors in the cell���s metabolism and in other functions, for example in cell-cell interaction, signal transduction, and transport of ions and nutrients. Cytochrome c oxidase (CcO), as one of the membrane proteins of the respiratory chain, plays a significant role in the energy transformation of higher organisms. CcO is a multi centered heme protein, utilizing redox energy to actively transport protons across the mitochondrial membrane. One aim of this dissertation is to investigate single steps in the mechanism of the ion transfer process coupled to electron transfer, which are not fully understood. The protein-tethered bilayer lipid membrane is a general approach to immobilize membrane proteins in an oriented fashion on a planar electrode embedded in a biomimetic membrane. This system enables the combination of electrochemical techniques with surface enhanced resonance Raman (SERRS), surface enhanced reflection absorption infrared (SEIRAS), and surface plasmon spectroscopy to study protein mediated electron and ion transport processes. The orientation of the enzymes within the surface confined architecture can be controlled by specific site-mutations, i.e. the insertion of a poly-histidine tag to different subunits of the enzyme. CcO can, thus, be oriented uniformly with its natural electron pathway entry pointing either towards or away from the electrode surface. The first orientation allows an ultra-fast direct electron transfer(ET) into the protein, not provided by conventional systems, which can be leveraged to study intrinsic charge transfer processes. The second orientation permits to study the interaction with its natural electron donor cytochrome c. Electrochemical and SERR measurements show conclusively that the redox site structure and the activity of the surface confined enzyme are preserved. Therefore, this biomimetic system offers a unique platform to study the kinetics of the ET processes in order to clarify mechanistic properties of the enzyme. Highly sensitive and ultra fast electrochemical techniques allow the separation of ET steps between all four redox centres including the determination of ET rates. Furthermore, proton transfer coupled to ET could be directly measured and discriminated from other ion transfer processes, revealing novel mechanistic information of the proton transfer mechanism of cytochrome c oxidase. In order to study the kinetics of the ET inside the protein, including the catalytic center, time resolved SEIRAS and SERRS measurements were performed to gain more insight into the structural and coordination changes of the heme environment. The electrical behaviour of tethered membrane systems and membrane intrinsic proteins as well as related charge transfer processes were simulated by solving the respective sets of differential equations, utilizing a software package called SPICE. This helps to understand charge transfer processes across membranes and to develop models that can help to elucidate mechanisms of complex enzymatic processes.

Realisierung der IceCube MonteCarlo-Produktion im WLCG und Untersuchung von Auswirkungen meteorologischer Parameter auf die Erzeugung atmosph��rischer Myonen

Das am S��dpol gelegene Neutrinoteleskop IceCube detektiert hochenergetische Neutrinos ��ber die schwache Wechselwirkung geladener und neutraler Str��me. Die Analyse basiert auf einem Vergleich mit Monte-Carlo-Simulationen, deren Produktion global koordiniert wird. In Mainz ist es erstmalig gelungen, Simulationen innerhalb der Architektur des Worldwide LHC Computing Grid (WLCG) zu realisieren, was die M��glichkeit er��ffnet, Monte-Carlo-Berechnungen auch auf andere deutsche Rechnerfarmen (CEs) mit IceCube-Berechtigung zu verteilen. Atmosph��rische Myonen werden mit einer Rate von ��ber 1000 Ereignissen pro Sekunde aufgezeichnet. Eine korrekte Interpretation dieses dominanten Signals, welches um einen Faktor von 10^6 reduziert werden muss um das eigentliche Neutrinosignal zu extrahieren, ist deswegen von gro��er Bedeutung. Eigene Simulationen mit der Software-Umgebung CORSIKA wurden durchgef��hrt um die von Energie und Einfallswinkel abh��ngige Entstehungsh��he atmosph��rischer Myonen zu bestimmen. IceCube Myonraten wurden mit Wetterdaten des European Centre for Medium-Range Weather Forcasts (ECMWF) verglichen und Korrelationen zwischen jahreszeitlichen sowie kurzzeitigen Schwankungen der Atmosph��rentemperatur und Myonraten konnten nachgewiesen werden. Zudem wurde eine Suche nach periodischen Effekten in der Atmosph��re, verursacht durch z.B. meteorologische Schwerewellen, mit Hilfe einer Fourieranalyse anhand der IceCube-Daten durchgef��hrt. Bislang konnte kein signifikanter Nachweis zur Existenz von Schwerewellen am S��dpol erbracht werden.

In-vitro synthesis and reconstitution of cytochrome bo 3 ubiquinol oxidase in artificial membranes

Forschung ��ber Membranenproteine stellt strenge Hindernisse, seit ruhigem gerade wenige Beispiele der Membranenproteinsorten sind gekennzeichnet worden in den verwendbaren experimentellen Plattformen gegen��ber. Die Hauptherausforderung ist, ihre ausgezeichnete entworfene strukturelle Vollst��ndigkeit zu konservieren, w��hrend die Ausdruck-, Lokalisierungs- und Wiederherstellungprozesse auftreten. In-vitro ��bersetzungssysteme k��nnen Vorteile ��ber auf Zellenbasisgenausdruck zum Beispiel haben, wenn das ��ber-ausgedr��ckte Produkt zur Wirtszelle giftig ist oder wenn fehlende Pfosten-��bersetzungs��nderung in den bakteriellen Ausdrucksystemen die Funktionalit��t der S��ugetier- Proteine oder Mangel an vorhandenem Membranenraum verdirbt, Funktionsausdruck verbieten.rn Der Nachahmer von biologische Membranen wie feste gest��tzte Lipidmembranen sind als Plattform am meisten benutzt, Proteinmembraneninteraktionen nachzuforschen. Wir sind in der Lage, Membranenproteinsorte, da wir eine Plattform f��r Membranenproteinsynthese vorstellen, n��mlich die in-vitrosynthese der Membranenproteine in ein Peptid gest��tztes Membranensystem zu adressieren. Die Wiederherstellung der Membranenproteine in den Lipid bilayers resultiert im Allgemeinen mit verschiedenen Proteinanpassungen. Als Alternative erforschen wir dieses System zum ersten Mal, um genaueres Modell zu den zellularen Membranen zu verursachen und ihre Funktion, wie Proteineinf��gung, Proteinfunktion und Ligandinteraktionen nachzuahmen.rn In dieser Arbeit ist unser Ziel, komplizierte Transmembraneproteine, wie des Cytochrome bo3-ubiquinol Oxydase (Cyt-bo3) direkt innerhalb der biomimetic vorbildlichen Membrane zu synthetisieren. In unserem System wird festes gest��tztes tBLM wie, P19/DMPE/PC als Plattform benutzt. Dieses k��nstliche Membranensystem mimiks die amphiphile Architektur eines Zelle-abgeleiteten Membranensystems.rn

3D-Strukturanalyse von Molluskenh��mocyaninen aus elektronenmikroskopischen Bildern

Diese Arbeit pr��sentiert die bislang h��chst aufgel��sten KryoEM-Strukturen f��r ein Cephalopoden h��mocyanin Dekamer (Nautilus pompilus H��mocyanin, NpH) und ein Gastropoden H��mocyanin Didekamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1). Durch die Methoden des ���molecular modelling��� und ���rigid-body-fiting��� wurde auch eine detaillierte Beschreibung beider Strukturen auf atomarem Niveau erstmalig m��glich. H��mocyanine sind kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine die frei gel��st in Blut zahlreicher Arthropoden und Mollusken vorkommen. Allgemein sind Molluskenh��mocyanine als Dekamere (Hohlzylinder aus 5 Untereinheiten-dimere) oder Didecamere (Zusammenlagerung von zwei Dekameren) zu finden. Durch Anlagerung weiterer Dekamere bilden sich teilweise tubul��re Multidekamere. H��mocyanine der Cephalopoden bestehen ausschlie��lich aus solit��ren Decameren. In Octopus und Nautilus bestehen die 10 Untereinheiten aus 7 funktionellen Einheiten(FU-a bis FU-g), wobei jede FU ein Sauerstoffmolek��l binden kann. FUs a-f bilden die Wand des ringf��rmigen Molek��ls und 10 Kopien der FU-g bilden einen sogenannten ���inneren Kragenkomplex���. Das im Rahmen dieser Arbeit erstelltes molekulares Modell von NpH kl��rt die Struktur des Dekamers vollst��ndig auf. Wir waren zum ersten Mal in der Lage das Untereinheiten-dimer, den Verlauf der Polypeptidkette und 15 unterschiedliche Kontaktstellen zwischen FUs zu identifizieren. Viele der inter-FU-Kontakte weisen Aminos��urenkonstellationen auf, die die Basis f��r die ��bertragung allosterischer Wechselwirkungen zwischen FUs darstellen k��nnten und Hinweise f��r den Aufbau der allosterische Einheit geben. Potentielle Bindungsstellen f��r N-glykosidische Zucker und bivalente Kationen wurden auch identifiziert. Im Gegensatz zu NpH, kommen Gastropoden H��mocyanine (inkl. KLH) haupts��chlich als Didekamere vor und der Kragenkomplex wird in diesem Fall aus 2 FUs gebildet (Fu-g und FU-h). Die zus��tzliche C'-terminale FU-h zeichnet sich durch eine spezielle Verl��ngerung von ~ 100 Aminos��uren aus. KLH stammt aus der kalifornische Schnecke Megathura crenulata und kommt seit mehreren Jahrzehnten als Immunostimulator in der immunologischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendung zum Einsatz. KLH weist zwei Isoformen auf, KLH1 und KLH2. Das vorliegende Modell von KLH1 erlaubt die komplexe Architektur dieses riesigen Proteins in allen Details zu verstehen, sowie einen Vergleich zum dem NpH Dekamer auf atomare Ebene. Es wurde gefunden, dass das Untereinheitensegment a-b-c-d-e-f-g, sowie die equivalenten Kontaktstellen zwichen FUs stark konserviert sind. Dies deutet darauf hin, dass in Bezug auf die ��bertragung allosterische Signale zwischen benachbarten FUs, grundlegende Mechanismen in beiden Molek��len beibehalten wurden. Weiterhin, konnten die Verbindungen zwischen den zwei Dekameren ertsmalig identifiziert werden. Schlie��lich, wurde die Topologie der N-glycosidischen Zucker, welche f��r die immunologische Eigenschaften von KLH1 von gro��er Bedeutung sind, auch aufgekl��rt. Somit leistet die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Schritt zum Verst��ndnis der Quart��rstruktur und Funktion der Molluskenh��mocyanine.rn

Solid-state NMR on columnar supramolecular structures

The present work deals with the characterisation of three columnar self-assembled systems, that is, benzene-1,3,5-tricarboxamides, a peripherally thioalkyl-substituted phthalocyanine, and several oligo-(p-phenylenevinylene)s. In order to probe the supramolecular organisation solid-state NMR has been used as the main technique, supported by X-ray measurements, theoretical methods, and thermal analysis. rnrnBenzene-1,3,5-tricarboxamides (BTAs) turned out to be well suited model compounds to study various fundamental supramolecular interactions, such as ��-��-interactions, hydrogen bonding, as well as dynamic and steric effects of attached side chains. Six BTAs have been investigated in total, five with a CO-centred amide group bearing different side chains and one with an inverted N-centred amide group. The physical properties of these BTAs have been investigated as a function of temperature. The results indicated that in case of the CO-centred BTAs the stability of the columnar mesophase depends strongly on the nature of the side chains. Further experiments revealed a coplanar orientation of adjacent BTA molecules in the columnar assembly of CO-centred BTAs, whereas the N-centred BTA, showed a deviating not fully coplanar arrangement. These differences were ascribed to distinct hydrogen bonding schemes, involving a parallel alignment of hydrogen bonds in case of CO-centred BTAs and an antiparallel alignment in case of the N-centred counterpart.rnrn The fundamental insights of the supramolecular organisation of BTAs could be partially adapted to an octa-substituted phthalocyanine with thiododecyl moieties. Solid-state NMR in combination with chemical shift calculations determined a tilted herringbone arrangement of phthalocyanine rings in the crystalline phase as well as in the mesophase. Moreover, 1H NMR measurements in the mesophase of this compound suggested an axial rotation of molecules, which is inhibited in the crystalline phase.rnrnAs a third task, the supramolecular assembly of oligo-(p-phenylenevinylene)s of varying length and with different polar head groups have been investigated by a combined X-ray and solid-state NMR study. The results revealed a columnar structure formation of these compounds, being promoted by phase separation of alkyl side chains and aromatic rigid rods. In this system solid-state NMR yielded meaningful insight into the isotropisation process of butoxy and 2-S-methylbutoxy substituted oligo-(p-phenylenevinylene) rods.rn

Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen geben eine gute ��bersicht dar��ber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten und Myriapoden jedoch wurden ��hnliche Analysen bisher kaum durchgef��hrt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten, zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierf��r sind Kenntnisse ��ber die Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein f��r Arthropoden typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne Neurone daran beteiligt sind, die prim��ren axonalen Trakte zu etablieren. Im Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.rnrnIn einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug auf ihre m��gliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die L��cke zwischen beiden Keimstreifh��lften w��hrend des gesamten Prozesses der Inversion ��berspannt, um eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur vor��bergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es, anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen f��r die korrekte Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten. Zus��tzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten k��nnte sim an der Musterbildung dieser Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle als Organisator f��r auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit anderen Invertebraten und Vertebraten.rnrnDie Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des Wegfindungsmolek��ls w��hrend der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen umh��llen, wichtig zu sein, um neurale Vorl��uferzellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz f��hrt zu einer verfr��hten Segregation neuraler Vorl��uferzellen aus dem epithelialen Verband der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den fr��hen Differenzierungsmarker islet exprimieren.

Structure and properties of nanostructures from polyelectrolytes and porphyrins: Self-Assembly in aqueous solution

In this work self-assembling model systems in aqueous solution were studied. The systems contained charged polymers, polyelectrolytes, that were combined with oppositely charged counterions to build up supramolecular structures. With imaging, scattering and spectroscopic techniques it was investigated how the structure of building units influences the structure of their assemblies. Polyelectrolytes with different chemical structure, molecular weight and morphology were investigated. In addition to linear polyelectrolytes, semi-flexible cylindrical bottle-brush polymers that possess a defined cross-section and a relatively high persistence along the backbone were studied. The polyelectrolytes were combined with structural organic counterions having charge numbers one to four. Especially the self-assembly of polyelectrolytes with different tetravalent water-soluble porphyrins was studied. Porphyrins have a rigid aromatic structure that has a structural effect on their self-assembly behavior and through which porphyrins are capable of self-aggregation via ��-�� interaction. The main focus of the thesis is the self-assembly of cylindrical bottle-brush polyelectrolytes with tetravalent porphyrins. It was shown that the addition of porphyrins to oppositely charged brush molecules induces a hierarchical formation of stable nanoscale brush-porphyrin networks. The networks can be disconnected by addition of salt and single porphyrin-decoratedrncylindrical brush polymers are obtained. These two new morphologies, brush-porphyrin networks and porphyrin-decorated brush polymers, may have potential as functional materials with interesting mechanical and optical properties.

Multifunctional magnetically loaded polyorganosiloxane nanocomposites for biomedical applications

For the last few decades, the interest in functional nanomaterials is steadily increasing. Especially, in biomedicine the range of possible applications of multifunctional nanoparticles including dye-labeled makers and drug loaded carrier systems is extraordinary large. The incorporation of magnetic nanoparticles allows for an additional magnetic detection and manipulation. One promising system on the way to multifunctional nanomaterials is the polyorganosiloxane system. Via polycondensation of silan monomers in aqueous dispersion polyorganosiloxane nanoparticles with particle diameter between 10 and 150 nm can be synthesized. The versatile silane chemistry allows for the design of multifunctional network structures. In this work, hydrophilic iron oxide nanoparticles could be encapsulated into the polymeric particles in a highly efficient process whereat the superparamagnetic nature of the inorganic particles was restrained. The influence of different sized particles as well as the amount of the incorporated material was investigated. Using a core-shell architecture, controlled core and surface modifications could be achieved. An effective fluorescent labeling was performed via incorporation of dye-labeled monomers. Additionally, a hydrophilic surface modification was carried out via a grafting onto process of poly(ethylene glycol). Individual core and surface functionalization was achieved and the influence of the modification on the efficiency of the magnetic loading was tested. The applicability of the multifunctional particles in biological systems was proved via cellular uptake and toxicity testings. Furthermore, biofunctionalized particles were synthesized by EDC coupling using biotin and insulin.rnrn

Differentiation and extracellular matrix interactions of chondrocytes in response to signaling molecules and biomaterials for cartilage repair = Differenzierung und Interaktionen von Chondrozyten mit der extrazellul��ren Matrix als Reaktion auf Signalmolek��le und Biomaterialien f��r die Wiederinstandsetzung von Knorpel

Chondrocytes live isolated in the voluminous extracellular matrix of cartilage, which they secrete and is neither vascularized nor innervated. Nutrient and waste exchanges occur through diffusion leading to low oxygen tension around the cells. Consequently even normal cartilage under normal physiological conditions suffers from a poor reparative potential that predisposes to degenerative conditions, such as osteoarthritis of the joints, with significant clinical effects.rnOne of the key challenges in medicine is the structural and functional replacement of lost or damaged tissues. Current therapeutical approaches are to transplant cells, implant bioartificial tissues, and chemically induce regeneration at the site of the injury. None of them reproduces well the biological and biomechanical properties of hyaline cartilage.rnThis thesis investigates the re-differentiation of chondrocytes and the repair of cartilage mediated by signaling molecules, biomaterials, and factors provided in mixed cellular cultures (co-culture systems). As signaling molecules we have applied prostaglandin E2 (PGE2) and bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) and we have transfected chondrocytes with BMP-1 expressing vectors. Our biomaterials have been hydrogels of type-I collagen and gelatin-based scaffolds designed to mimic the architecture and biochemistry of native cartilage and provide a suitable three-dimensional environment for the cells. We have brought chondrocytes to interact with osteosarcoma Cal 72 cells or with murine preosteoblastic KS483 cells, either in a cell-to-cell or in a paracrine manner.rnExogenous stimulation with PGE2 or BMP-1 did not improve the differentiation or the proliferation of human articular chondrocytes. BMP-1 induced chondrocytic de-differentiation in a dose-dependent manner. Prostaglandin stimulation from gelatin-based scaffolds (three-dimensional culture) showed a certain degree of chondrocyte re-differentiaton. Murine preosteoblastic KS483 cells had no beneficial effect on human articular chondrocytes jointly cultivated with them in hydrogels of type I collagen. Although the hydrogels provided the chondrocytes with a proper matrix in which the cells adopted their native morphology; additionally, the expression of chondrocytic proteoglycan increased in the co-cultures after two weeks. The co-culture of chondrocytes with osteoblast-like cells (in transwell systems) resulted in suppression of the regular de-differentiation program that passaged chondrocytes undergo when cultured in monolayers. Under these conditions, the extracellular matrix of the chondrocytes, rich in type-II collagen and aggrecan, was not transformed into the extracellular matrix characteristic of de-differentiated human articular chondrocytes, which is rich in type-I collagen and versican.rnThis thesis suggests novel strategies of tissue engineering for clinical attempts to improve cartilage repair. Since implants are prepared in vitro (ex-vivo) by expanding human articular chondrocytes (autologous or allogeneic), we conclude that it will be convenient to provide a proper three-dimensional support to the chondrocytes in culture, to supplement the culture medium with PGE2, and to stimulate chondrocytes with osteoblastic factors by cultivating them with osteoblasts.rn