Vibrational spectroscopic and electrochemical investigations of multi-centered heme proteins in biomimetic membrane architectures

Membrane proteins play a major role in every living cell. They are the key factors in the cell’s metabolism and in other functions, for example in cell-cell interaction, signal transduction, and transport of ions and nutrients. Cytochrome c oxidase (CcO), as one of the membrane proteins of the respiratory chain, plays a significant role in the energy transformation of higher organisms. CcO is a multi centered heme protein, utilizing redox energy to actively transport protons across the mitochondrial membrane. One aim of this dissertation is to investigate single steps in the mechanism of the ion transfer process coupled to electron transfer, which are not fully understood. The protein-tethered bilayer lipid membrane is a general approach to immobilize membrane proteins in an oriented fashion on a planar electrode embedded in a biomimetic membrane. This system enables the combination of electrochemical techniques with surface enhanced resonance Raman (SERRS), surface enhanced reflection absorption infrared (SEIRAS), and surface plasmon spectroscopy to study protein mediated electron and ion transport processes. The orientation of the enzymes within the surface confined architecture can be controlled by specific site-mutations, i.e. the insertion of a poly-histidine tag to different subunits of the enzyme. CcO can, thus, be oriented uniformly with its natural electron pathway entry pointing either towards or away from the electrode surface. The first orientation allows an ultra-fast direct electron transfer(ET) into the protein, not provided by conventional systems, which can be leveraged to study intrinsic charge transfer processes. The second orientation permits to study the interaction with its natural electron donor cytochrome c. Electrochemical and SERR measurements show conclusively that the redox site structure and the activity of the surface confined enzyme are preserved. Therefore, this biomimetic system offers a unique platform to study the kinetics of the ET processes in order to clarify mechanistic properties of the enzyme. Highly sensitive and ultra fast electrochemical techniques allow the separation of ET steps between all four redox centres including the determination of ET rates. Furthermore, proton transfer coupled to ET could be directly measured and discriminated from other ion transfer processes, revealing novel mechanistic information of the proton transfer mechanism of cytochrome c oxidase. In order to study the kinetics of the ET inside the protein, including the catalytic center, time resolved SEIRAS and SERRS measurements were performed to gain more insight into the structural and coordination changes of the heme environment. The electrical behaviour of tethered membrane systems and membrane intrinsic proteins as well as related charge transfer processes were simulated by solving the respective sets of differential equations, utilizing a software package called SPICE. This helps to understand charge transfer processes across membranes and to develop models that can help to elucidate mechanisms of complex enzymatic processes.

Membranproteine spielen eine zentrale Rolle in jeder lebenden Zelle. Sie haben eine Schlüsselfunktion in vielen Prozessen, wie beispielsweise im Metabolismus von Zellen, der Zell-Zell Interaktion, der Signal Übermittlung und dem Transport von Ionen und Nährstoffen. Cytochrome c Oxidase ist eines der Membranproteine in der Atmungskette und spielt eine wichtige Rolle bei der Energie-Transformation in höher entwickelten Organismen. Es ist ein Häm-Protein mit mehrere Redox Zentren, das die Energie der Redox Prozesse zum aktiven Transport von Protonen über die Mitochondrienmembrane nutzt. Ein Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des Mechanismus einzelner Schritte des Protonentransfers, die an Eletronentransferprozesse innerhalb des Proteins gekoppelt sind. Die sogenannte ’Protein-tethered Bilayer Lipid Membrane’ ist ein universeller Ansatz zur Immobilisierung von Membranproteinen auf Oberflächen, eingebettet in einer vorgegebenen Orientierung und in ein biomimetisches Membransystem. Dieses System erlaubt die kombinierte Anwendung von elektrochemischen Techniken mit oberflächen-verstärkter resonanter Raman (SERRS), oberflächen-verstärkter Reflektions-Absorptions Infrarot (SEIRAS) und Oberflächenplasmonen Spektroskopie, um Elektronen- und Ionentransferprozesse von Proteinen zu untersuchen. Die homogen orientierte Immobilisierung der Proteine in dieser Oberflächen-gebundenen Architektur kann durch spezifische Mutationen, d.h. die Insertion eines Poly-Histidine Ankers an jeweils verschiedenen Untereinheiten des Enzyms, kontrolliert werden. Damit kann die Cytochrome c Oxidase entweder mit ihrer natürlichen Elektronenakzeptorseite zur Elektrode hin oder von ihr weg orientiert werden. Die erstgenannte Orientierung ermöglicht einen sehr schnellen Elektronentransfer (ET) zum Protein, der mit herkömmlichen Systemen so nicht möglich ist. Somit ist es möglich, intrinsische Prozesse des Proteins zu untersuchen. Die zweite Orientierung hingegen erm¨oglicht die Interaktion des Enzyms mit dem natürlichen Elektronenüberträger, Cytochrome c, zu untersuchen. Elektrochemische und SERR Messungen zeigen eindrucksvoll, dass die Strukturen der redox-aktiven Zentren wie auch die Aktivität des Systems auf der Oberfläche nach dem Immobilisieren erhalten bleiben. Damit stellt dieses biomimetische System eine einzigartige Plattform da, mit deren Hilfe man die Kinetik von ET -Prozessen und die Mechanistischen Eigenschaften von Enzymen untersuchen kann. Elektrochemische Techniken erlauben die einzelnen ET -Schritte zwischen den vier Redox-Zentren der Oxidase aufzulösen und deren Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen. Des Weiteren konnte der Protonentransfer, der mit dem Elektronentransfer gekoppelt ist, direkt unabhängig gemessen werden. Damit war es möglich neue Informationen über den Mechanismus der Protonentranslokation der Cytochrome c Oxidase zu erlangen. Um die Kinetik des ET innerhalb des Proteins bis zum des katalytischen Zentrum zu untersuchen, wurden zeitaufgelöste SEIRAS und SERRS Messungen durchgeführt, um einen tieferen Einblick in die zeitabhängigen Veränderungen von Struktur und Koordination der Hämumgebung zu erhalten. Das elektrische Verhalten von Oberflächenverankerten Membransystemen und der eingelagerten Membranproteine, wie auch die damit zusammenhängenden Ladungstransferprozesse, konnten simuliert werden. Dies war möglich durch eine numerische Lösung der Differentialgleichungen der genannten Prozesse mittels des Software-Paketes SPICE. Dies ist insbesondere für das bessere Verständnis dieser Prozesse hilfreich und auch um Modelle zu entwickeln, die dabei helfen können die Mechanismen von komplexen enzymatischen Prozessen aufzuklären.