Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung f��r die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschlie��end ph��notypisch mittels Durchflu��zytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antik��rper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivit��tstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, da�� aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden k��nnen, welche Reaktivit��t gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und ��ber verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquit��re (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der nat��rlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antik��rpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach S��ureeluation und Filtration abgespalten und ��ber eine ���reverse phase���-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die ��berpr��fung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivit��t erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizit��tstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 ausl��sen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Fl��ssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexit��t aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivit��t dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung nat��rlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht m��glich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt m��glicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begr��ndet. In Folgearbeiten soll nun mit erh��hter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, er��ffnet neue therapeutische M��glichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabsto��ungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizit��t gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivit��t in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus prim��rem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der F��lle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen ��ber wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verf��gbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn m��glich wurden aus den so gewonnenen ���Responder���-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalit��t in IFN-��-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizit��tstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Molek��le mit monoklonalen Antik��rpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberfl��chenmolek��le analysiert. Kreuzreaktivit��tsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-���Panel��� gaben Aufschluss ��ber die Reaktivit��t der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, h��matopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentit��ten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-���Responder���-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-���Responder���-Lymphozyten eine st��rkere Proliferation und Zytotoxizit��t nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven ���Responder���-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorl��ufer- und ���central memory���-T-Zellen enth��lt. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschlie��lich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte au��erdem h��matopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivit��t isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine st��rkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivit��t. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bem��hungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen w��ren in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen erm��glichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen k��nnten. Zum anderen k��nnten diese T-Zellen m��glicherweise f��r eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abh��ngig. Dazu geh��ren unter anderen: das ausgew��hlte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleins��uren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bez��glich des Applikationsortes repr��sentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu f��r die Interaktion zwischen antigenpr��sentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden k��nnen und eine hohe stimulatorische Kapazit��t besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz erh��hen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazit��t in vivo f��hrte. Dar��ber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5��� sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Dom��ne eines MHC-Klasse-I-Molek��ls am 3��� der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Pr��sentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen f��hrt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpr��sentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs f��hrt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabh��ngigen Weise f��hrt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse bef��higt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ���Priming��� CD8+ T-Zellen in naiven M��usen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren bef��higt eine zytolytische Aktivit��t gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Dar��ber hinaus waren wir in der Lage Ged��chtnisszellen expandieren zu k��nnen. Abschlie��end konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunit��t besitzt.

Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente M��use einen erh��hten Atemwegswiderstand, einen pathologische Ver��nderung der Lunge und einen erh��hten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erh��hten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erh��hte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) M��usen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erh��hten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) M��use eine erh��hte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund f��r die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten M��usen ist eine erh��hte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) ���long-lived memory Zellen��� in den NFATc2(-/-) M��usen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID M��use, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) M��use isoliert werden, behandelt wurden, eine erh��hten Atemwegswiderstand, eine erh��hte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und f��hrt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die H��he des Atemwegswiderstandes unterdr��ckt.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpr��sentierenden Zellen exprimierte EBI-3 geh��rt zur Familie der l��slichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intraven��se Injektion der B16-F10 Zelllinie f��hrte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer h��heren Lebenserwartung dieser M��use im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Dar��ber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten M��usen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden w��hrend ��nderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die k��rzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zus��tzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterst��tzt wurden, erkl��rt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten M��usen produzierten h��here Mengen an IFN-g w��hrend die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Molek��le exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verst��rkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser M��use. Dies wiederum resultierte im TNF-��� und TRAIL abh��ngigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten M��use, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten M��usen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypm��use transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empf��ngerm��usen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Immunevasion des murinen Cytomegalovirus: Regulatoren der MHC-Klasse-I vermittelten Antigenpr��sentation

Zu den Immunevasionsmechanismen des murinen Cytomegalovirus, die sich im Laufe der Koevolution von Virus und Wirt entwickelt haben, geh��rt die Interferenz von drei viralen Regulatoren mit der Antigenpr��sentation ��ber MHC-Klasse-I-Molek��le, wodurch die Aktivierung von zytotoxischen CD8 T-Zellen beeinflusst wird: W��hrend m152/gp40 peptidbeladene MHC-Klasse-I-Komplexe im cis-Golgi-Kompartiment akkumuliert, f��hrt m06/gp48 diese Komplexe der lysosomalen Degradation zu. Im Gegensatz dazu vermittelt m04/gp34 deren Transport an die Zelloberfl��che, wurde in der Literatur bisher aber trotzdem als Inhibitor der CD8 T-Zellaktivierung beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss dieser viralen Proteine auf die Peptidpr��sentation bzw. die T-Zellaktivierung zu untersuchen. Dazu wurde ein Set von Viren verwendet, das neben mCMV-WT aus mCMV-Deletionsmutanten besteht, die jedes der regulatorischen Proteine einzeln bzw. in allen m��glichen Kombinationen exprimieren, einschlie��lich einer Mutante, die keines der Proteine besitzt. Entgegen der bisher g��ltigen Annahme konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass m04/gp34 die Antigenpr��sentation nicht inhibiert. Wird es allein exprimiert, bleibt die T-Zellaktivierung unbeeinflusst. Wird es zusammen mit m152/gp40 exprimiert, stellt es die T-Zellaktivierung wieder her, indem es den herunter regulierenden Effekt von m152/gp40 antagonisiert. Dieser positiv regulierende Effekt von m04/gp34 wird wiederum durch m06/gp48 aufgehoben. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, wie die verschiedenen Effekte dieser Virusproteine in vivo das ��berleben im infizierten Wirt steuern. So wird im adoptiven Transfermodell die Infektion mit der Deletionsmutante, die m152/gp40 alleine exprimiert, schlechter kontrolliert als die Infektion mit der m152/gp40 und m04/gp34 exprimierenden Mutante. Dieser die CD8 T-Zellkontrolle verbessernde Effekt von m04/gp34 wird durch m06/gp48 wieder aufgehoben. Dass ein viraler Erreger nicht nur negative Regulatoren der Antigenpr��sentation exprimiert, sondern auch einen positiven Regulator, der den Effekt eines negativen Regulators wieder aufhebt, ist in der Literatur beispiellos. Durch differentielle Expression dieser Regulatoren er��ffnet sich damit dem Virus die M��glichkeit, die Antigenpr��sentation gezielt zu modulieren.

Host immune response in immunodeficient mice against infection with Cryptosporidium parvum

Immunantwort von immundefizienten M��usen gegen��ber Infektionen mit Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum ist ein intrazellul��rer, protozoischer Krankheitserreger, der im immunkompromittierten Wirt zu lebensbedrohender Enteritis f��hren kann. CD4+ T-Zellen und Interferon (IFN)-�� spielen wesentliche Rollen bei der Wirtsimmunantwort gegen die Infektion. Dennoch sind die Effektormechanismen, die zur Resistenz f��hren nur wenig verstanden. In dieser Studie wurde die Immunantwort von IFN-��- und Interleukin (IL)-12-Defektm��usen parallel zu Wildtypm��usen analysiert. Die Ergebnisse identifizierten IFN-�� als Schl��sselzytokin bei der nat��rlichen und erworbenen Immunit��t w��hrend der Erst- und Folgeinfektion mit C. parvum. Tumornekrosefaktor (TNF)-�� ist m��glicherweise ein Induktor der fr��hen IFN-��-Antwort in IL-12 Knockout-M��usen. Weiterhin tragen offenbar sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine zur ��berwindung der Prim��rinfektion bei, die ersten mehr als die letztgenannten. Zytokingene waren am Ort der Infektion (Ileum) dramatisch ver��ndert, nicht aber in den lokalen Lymphknoten und der Milz. Nach Folgeinfektion ergab sich in Abwesenheit von IFN-�� eine signifikante Erh��hung der Th2-Zytokine IL-5 and IL-13. Die Ergebnisse zeigten weiterhin, dass das Th1-Zytokin IL-18 zur Resistenz gegen��ber C. parvum beitr��gt, m��glicherweise durch verschiedene Immunfunktionen, wie der Regulation von Serum-IFN-�� w��hrend der Infektion und/oder der Erhaltung der Homeostase der Th1/Th2-Zytokine durch Regulation der Th2-Zytokine. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen den Transfer von Resistenz gegen��ber C. parvum von infizierten auf na��ve M��use mittels stimulierter intraepithelialer Lymphozyten und CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse weisen auf die Gegenwart von C. parvum-spezifischen CD4+ T-Zellen in anderen lymphatischen Geweben neben der Darmmukosa hin. Eine Stimulation der Spendertiere durch Infektion war notwendig f��r eine ��bertragbare sch��tzende Immunit��t. Dennoch konnte die ��bertragene Immunit��t nicht die Infektion der Empf��ngertiere vollst��ndig verhindern; eine Verdopplung der Spenderzellen f��hrte zu keinem besseren Ergebnis. Weiterhin ergab der Transfer von CD4+ und CD8+ T-Zellen (Pan-T-Zellen) keinen erh��hten Schutz der naiven Empf��ngertiere als der alleinige Transfer von CD4+ T-Zellen. Dies weist auf die fehlende Bedeutung der CD8+ T-Zellen beim Schutz vor C. parvum-Infektion hin.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilit��tsantigenen und Leuk��mie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene h��matopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leuk��mien die einzige kurative Behandlungsm��glichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidit��t und Mortalit��t zu senken und ihre Effektivit��t zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegen��ber der unerw��nschten GvHD (graft-versus-host disease) m��glichst selektiv verst��rkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-��bereinstimmung zwischen Spender und Empf��nger sind so genannte Minorhistokompatibilit��tsantigene (mHAgs) und Leuk��mie-assoziierte Antigene (LAA) die mutma��lichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leuk��mie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leuk��mie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enth��lt die Aminos��uren 316 - 327. PLAUR wird in lymphoh��matopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen ��berexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivit��t assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leuk��miezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen f��r die Elimination der Empf��nger-H��matopoese unter Einschluss der Leuk��mieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterf��hrende Untersuchungen m��ssen zeigen, ob diese Antigene tats��chlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repr��sentativen Spektrums solcher Antigene w��rde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschlie��en helfen.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schl��sselmolek��l zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine gro��e Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in fr��hen Phasen als Tumorsuppressor, w��hrenddessen es in sp��ten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher f��r ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Splei��form des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. F��r diese Splei��form konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von ��berexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine ver��nderte Lokalisation der Smurf2 Splei��formen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Splei��en des Exons2 f��hrte dabei zu ��nderungen der Topologie der N-terminalen C2-Dom��ne, wodurch sich eine ver��nderte Lokalisation in der Zelle beschreiben lie��. Mit der ver��nderten intrazellul��ren Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine ��nderung. So konnte ��berraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine ��berexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verst��rkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegen��ber TGF-beta. Dies f��hrte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse best��tigt werden konnte, da�� das dE2Smurf2 nach ��berexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abh��ngig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, da�� durch die h��here Sensitivit��t gegen��ber TGF-beta naive T-Zellen unter Einflu�� von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, da�� die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, da�� bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INF�� produzierten.So zeigten in vivo Versuche, da�� die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entz��ndung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine st��rkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INF�� und Granzym B erkl��rt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten M��use, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant st��rkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer ��berproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erkl��rt werden. Klonierungsexperimente f��hrten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell ��ber die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entz��ndlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein f��r die Modulation von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O��Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabh��ngigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde ��berpr��ft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivit��ten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und dar��ber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies f��hrte zur Klonierung einer f��r TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinit��t die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminos��urepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminos��urepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 tr��gt mutma��lich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermedi��rem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2��-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht f��r eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies f��r verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivit��t war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualit��t war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Ph��notyp und mutma��lich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein f��r eine Immuntherapie, die sich auf das tats��chliche Potential des individuellen T-Zellsystems st��tzen kann.

Mechanismen zur Suppression der experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die Transplantation von allogenen h��matopoetischen Stammzellen stellt f��r viele Patienten mit h��matologischen Erkrankungen, wie beispielsweise akuter Leuk��mie, oftmals die einzige kurative Therapieoption dar. Die Erkennung von Empf��ngerantigenen durch immunkompetente Zellen des Spenders bietet dabei die Basis f��r erw��nschte Graft-versus-Tumor-Effekte, verursacht jedoch h��ufig au��erdem die unerw��nschte Graft-versus-Host Disease (GvHD), eine mitunter schwerwiegende Komplikation. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Mechanismen zur Hemmung alloreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen (TZ) und folglich zur Hemmung der akuten GvHD in einem experimentellen GvHD-Modell untersucht, welches auf dem Transfer von allogenen Zellen zwischen MHC-inkompatiblen Mausst��mmen basiert. Die vorliegende Arbeit weist zum Einen darauf hin, dass das Fehlen MyD88- und TRIF-vermittelter Toll-like-Rezeptor-Signale zumindest im Rahmen des hier verwendeten Transplantationsmodells nicht zwingend zu einer Hemmung der akuten GvHD f��hrt. Zum Anderen konnte belegt werden, dass CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) kompetente Suppressoren der durch alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ ausgel��sten akuten GvHD darstellen. In weiterf��hrenden Experimenten ist gezeigt worden, dass die Tregs sich verschiedener Mechanismen bedienen, um ihre Zielzellen zu inhibieren. Das suppressive Zytokin Interleukin-10 kann als l��slicher Mediator zumindest in vitro offenbar eine Rolle bei der Treg-vermittelten Suppression alloreaktiver TZ spielen. Da jedoch auch Tregs aus Interleukin-10-defizienten Spendern die GvHD-Entstehung in den Empf��ngern abschw��chen konnten, m��ssen noch weitere Mechanismen involviert sein. Es konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro eine zellkontaktabh��ngige Kommunikation mittels gap junctions haupts��chlich zwischen den Tregs und den allogenen Dendritischen Zellen (DCs) nachgewiesen werden, welche prinzipiell den Transfer von cAMP m��glich macht. Die Kommunikation zwischen Tregs und DCs resultierte in einem supprimierten Ph��notyp der DCs, gekennzeichnet durch eine verminderte Expression kostimulatorischer Molek��le auf ihrer Oberfl��che. Solche supprimierten DCs k��nnen als Folge die alloreaktiven Spender-TZ vermutlich nicht aktivieren. Das cAMP-erh��hende Rolipram konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro die Proliferation alloreaktiver CD4+ und CD8+ TZ hemmen. Daneben konnte die Treg-vermittelte Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD in vivo durch die zus��tzliche Verabreichung von Rolipram noch gesteigert werden. Im letzten Kapitel dieser Arbeit wurde beschrieben, dass die alleinige Aktivierung alloreaktiver CD8+ TZ ausreichend ist, um eine akute GvHD auszul��sen. In diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, dass CD4+ CD25+ Tregs die akute GvHD auch in einer scheinbar MHC-II-unabh��ngigen Weise hemmen k��nnen. Zusammenfassend belegt die vorliegende Arbeit, dass Tregs in einem MHC-inkompatiblen Transplantationsmodell alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ und folglich die Entstehung einer GvHD effizient hemmen k��nnen. Bei der Hemmung der GvHD kommen wahrscheinlich verschiedene Mechanismen zum Tragen. Zumindest in vivo scheint von Tregs produziertes Interleukin-10 eine untergeordnete Rolle bei der Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD zu spielen, hierbei steht vermutlich vielmehr der cAMP-abh��ngige Suppressionsmechanismus im Vordergrund.

Exploring the function of IL-10, BTLA and DCs as regulators of immune responses

This thesis focuses on different aspects of immune regulation, both at the cellular and molecular levels. More specifically, this work concentrates on the importance of Interleukin-10, B and T Lymphocyte Attenuator (BTLA), and dendritic cells in respect to immune regulation, with special emphasis on autoimmunity. In this thesis, we show that the cellular source of IL10 production can dramatically influence the outcome of an autoimmune response. We show that T cell-derived IL10 plays an important role in controlling the viability of recently activated T cells, allowing them to become fully functional T effector cells. T cell-specific IL10-deficient mice failed to induce EAE when immunized with MOG peptide. Furthermore, when re-challenged with MOG or other stimuli, these T cells exhibited increased apoptosis rates. Here we report for the first time the generation of a novel mouse model that allows the conditional over-expression of BTLA. We show that BTLA can negatively regulate CD4+ T cells responses, when expressed by the T cells themselves. BTLA over-expression by CD8+ T cells or dendritic cells, however, resulted in enhanced viral clearance. In this study, we show that depletion of DCs, either early on from birth or later in adulthood, does not prevent EAE induction, but instead leads to a lower state of tolerance and stronger immune response. We also show that DCs are responsible for the upregulation of PD-1 on antigen-specific T cells and subsequently induce the formation of Tregs during immune responses.

In vivo konditionale Depletion von latentem murinen Cytomegalovirus

Die Lunge stellt einen Hauptort der CMV-Latenz dar. Die akute CMV-Infektion wird durch infiltrierende antivirale CD8 T-Zellen terminiert. Das virale Genom verbleibt jedoch im Lungengewebe in einem nicht replikativen Zustand, der Latenz, erhalten. Es konnte bereits gezeigt werden, dass w��hrend der Latenz die Major Immediate Early- (MIE) Gene ie1- und ie2 sporadisch transkribiert werden. Bisher konnte diese beginnende Reaktivierung latenter CMV-Genome nur in einer Momentaufnahme gezeigt werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; zur ��bersicht: Reddehase et al., 2008). Die sporadische Expression der MIE-Gene f��hrt jedoch zur Pr��sentation eines antigenen IE1-Peptids und somit zur Stimulation antiviraler IE1-Peptid-spezifischer CD8 T-Zellen, die durch ihre Effektorfunktion die beginnende Reaktivierung wieder beenden. Dies f��hrte uns zu der Hypothese, dass MIE-Genexpression ��ber einen Zeitraum betrachtet (period prevalence) h��ufiger stattfindet als es in einer Momentaufnahme (point prevalence) beobachtet werden kann.rnrnUm die H��ufigkeit der MIE-Genexpression in der Dynamik in einem definierten Zeitraum zu erfassen, sollte eine Methode entwickelt werden, welche es erstmals erm��glicht, selektiv und konditional transkriptionell aktive Zellen sowohl w��hrend der akuten Infektion als auch w��hrend der Latenz auszul��schen. Dazu wurde mit Hilfe der Zwei-Schritt BAC-Mutagenese ein rekombinantes death-tagged Virus hergestellt, welches das Gen f��r den Diphtherie Toxin Rezeptor (DTR) unter Kontrolle des ie2-Promotors (P2) enth��lt. Ist der P2 transkriptionell aktiv, wird der DTR an der Zelloberfl��che pr��sentiert und die Zelle wird suszeptibel f��r den Liganden Diphtherie Toxin (DT). Durch Gabe von DT werden somit alle Zellen ausgel��scht, in denen virale Genome transkriptionell aktiv sind. Mit zunehmender Dauer der DT-Behandlung sollte also die Menge an latenten viralen Genomen abnehmen.rnrnIn Western Blot-Analysen konnte das DTR-Protein bereits 2h nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Pr��sentation des DTR an der Zelloberfl��che wurde indirekt durch dessen Funktionalit��t bewiesen. Das rekombinante Virus konnte in Fibroblasten in Gegenwart von DT nicht mehr replizieren. In akut infizierten Tieren konnte die virale DNA-Menge durch eine einmalige intraven��se (i.v.) DT-Gabe signifikant reduziert werden. Verst��rkt wurde dieser Effekt durch eine repetitive i.v. DT-Gabe. Auch w��hrend der Latenz gelang es, die Zahl der latenten viralen Genome durch repetitive i.v. und anschlie��ende intraperitoneale (i.p.) DT-Gabe zu reduzieren, wobei wir abh��ngig von der Dauer der DT-Gabe eine Reduktion um 60\% erreichen konnten. Korrespondierend zu der Reduktion der DNA-Menge sank auch die Reaktivierungsh��ufigkeit des rekombinanten Virus in Lungenexplantatkulturen. rnrnrnUm die Reaktivierungsh��ufigkeit w��hrend der Latenz berechnen zu k��nnen, wurde durch eine Grenzverd��nnungsanalyse die Anzahl an latenten viralen Genomen pro Zelle bestimmt. Dabei ergab sich eine Kopienzahl von 9 (6 bis 13). Ausgehend von diesen Ergebnissen l��sst sich berechnen, dass, bezogen auf die gesamte Lunge, in dem getesteten Zeitraum von 184h durch die DT-Behandlung 1.000 bis 2.500 Genome pro Stunde ausgel��scht wurden. Dies entspricht einer Ausl��schung von 110 bis 280 MIE-Gen-exprimierenden Lungenzellen pro Stunde. Damit konnte in dieser Arbeit erstmals die Latenz-assoziierte Genexpression in ihrer Dynamik dargestellt werden.rn

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ���missing-self��� recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn

Untersuchung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in der murinen und humanen kutanen Leishmaniasis

F��r die Ausheilung von L. major-Infektionen ist eine effektive Th1-/Tc1-Antwort unerl��sslich. Dennoch sind bis heute nicht alle Mechanismen der sch��tzenden Immunabwehr beim Menschen und in der Maus endg��ltig gekl��rt. Deshalb bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, Th1-/Tc1-Antworten und damit die Schnittstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eingehender zu untersuchen. F��r diesen Ansatz wurde zun��chst der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf den Verlauf der Infektion anhand von BALB/c- und C57BL/6-Zellen analysiert. Als entscheidender Faktor f��r Heilung und Suszeptibilit��t wurde mit Hilfe von Knochenmarkschim��ren die Herkunft der T und/oder B Zellen identifiziert. Erst die Aktivierung durch Th1-/Tc1-Zellen versetzt L. major-infizierte Makrophagen in die Lage, die intrazellul��ren Parasiten abzut��ten. In diesem Aktivierungsprozess spielt die TNF-induzierte Signalweiterleitung ��ber den TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) eine wichtige Rolle. TNF-R1 ist mit dem Signalmolek��l FAN assoziiert. In dieser Arbeit konnte anhand von M��usen, denen FAN fehlt, die Involvierung dieses Molek��ls in der Induktion eines Th1-Zytokinsprofils und in der Kontrolle der Parasitenzahl sowie der lokalen Begrenzung der Infektion gezeigt werden. Weiterhin wurde unter Verwendung immundefizienter M��use die Realisierbarkeit eines PBMC-Transfermodells gepr��ft. Ein solches wird zur Validierung an M��usen gewonnener Erkenntnisse und als pr��klinisches Testsystem der humanen kutanen Leishmaniasis dringend ben��tigt. In allen getesteten St��mmen lie�� sich durch den Transfer humaner PBMC die L. major-Infektion beeinflussen. Humane CD4+ und CD8+ T-Zellen waren an den Infektionsstellen pr��sent und es konnten antigenspezifische Immunreaktionen nnachgewiesen werden. Das PBMC-Transfermodell konnte durch die Transplantation humaner Haut auf immundefiziente M��use zus��tzlich entscheidend verbessert werden. In diesen Transplantaten lie��en sich L. major-Infektionen etablieren und durch zus��tzlichen Transfer von PBMC die Zahl humaner CD45+ Zellen an der Infektionsstelle deutlich steigern. In ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis der Determinanten von Heilung und Suszeptibilit��t der kutanen Leishmaniasis bei und zeigt neue Ansatzpunkte f��r eine Beeinflussung des Krankheitsverlaufes auf. Die Etablierung eines pr��klinischen Testmodells der humanen Leishmaniasis ist entscheidend, um das Wissen ��ber die murine Leishmaniasis auf die humane Erkrankung zu ��bertragen. So kann dem dauerhaften Problem der Entwicklung von Vakzinen an M��usen, die keine Wirksamkeit gegen die humane Erkrankung zeigen, begegnet werden. Ein vollst��ndig etabliertes Modell wird es erm��glichen, der humanen Erkrankung zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen und Patienten-spezifisch aber auch allgemeing��ltig Vakzinierungs-Ans��tze und Therapien unter experimentellen Bedingungen zu testen.