Die eNOS als ein therapeutisches Zielmolekül kardiovaskulärer Erkrankungen

Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) erfüllt – solange sie funktionell ist – vasoprotektive und anti-atherosklerotische Funktionen im kardiovaskulären System. So stellt die eNOS ein therapeutisches Zielmolekül kardiovaskulärer Erkrankungen dar. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurden Hinweise auf eine „eNOS-Entkopplung“, d.h. die NOS-katalysierte Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies, gefunden. Wir haben in den letzten Jahren Substanzen identifiziert, die die eNOS-Expression steigern, aber auch gleichzeitig die eNOS-Entkopplung revertieren können. Midostaurin z.B. korrigierte einerseits die eNOS-Entkopplung durch Unterdrückung der Expression der vaskulären NADPH-Oxidasen und erhöhte andererseits die eNOS-Expression im Gefäß-Endothel. Kombination dieser beiden Wirkungen führte zur Relaxation der Widerstandsgefäße in atherosklerotischen Mäusen und zur Blutdrucksenkung in spontan-hypertensiven Ratten. So scheint es eine praktikable Strategie für kardiovaskuläre Erkrankungen zu sein, die eNOS-Expression zu steigern und gleichzeitig die eNOS-Entkopplung zu verhindern bzw. eine bereits bestehende eNOS-Entkopplung zu revertieren.

Untersuchung der Modulation adaptiver Immunantworten in Abhängigkeit der Reifung dendritischer Zellen

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Bildung von DALIS während der Reifung von dendritischen Zellen untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass die DALIS-Bildung mit dem Aktivierungszustand der Zelle eng verknüpft ist. Es konnten verschiedene Hitzeschockproteine in Zusammenhang mit der DaLIS-Bildung gebracht werden und ein Molekül der Siganlgebung identifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Veränderung von dendritischen Zellen in Anwesenheit von regulatorischen T-Zellen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass zwischen den Zellen Gap Junctions entstehen, durch die cAMP von den regulatorischen T-Zellen auf die dendritischen Zellen übertragen werden kann. Weiter konnte gezeigt werden, dass regulatorische T-Zellen IL-10 sezernieren und so die dendritischen Zellen inhibieren.

Einfluss der AMPK-Aktivität auf Endothelfunktion, oxidativen Stress und vaskuläre Inflammation

Die AMPK ist ein ubiquitär exprimiertes, heterotrimeres Enzym, das bei Energiemangel das Überleben der Zelle sichert. Um diese Funktion ausüben zu können fungiert die AMPK als sogenannter „Energie-Sensor“, der durch steigende AMP Mengen aktiviert wird. In diesem Zustand werden ATP verbrauchende Reaktionen inhibiert und gleichzeitig ATP generierende Vorgänge induziert. Im vaskulären System konnte gezeigt werden, dass die endotheliale NOSynthase durch die AMPK aktiviert, die Angiogenese stimuliert, die Endothelzellapoptose und das Wachstum von Gefäßmuskelzellen inhibiert wird. All diese Prozesse sind fundamental in der Entwicklung von kardiovaskulären Krankheiten, was auf eine protektive Funktion der AMPK im vaskulären System hindeutet. In der vorliegenden Arbeit sollten die Effekte der in vivo Modulation der AMPK Aktivität auf Endothelfunktion, oxidativen Stress und Inflammation untersucht werden. Dazu wurden zwei unterschiedliche Mausmodelle genutzt: Einerseits wurde die AMPK Aktivität durch den pharmakologischen AMPK-Aktivator AICAR stimuliert und andererseits die vaskulär vorherrschende AMPK-Isoform durch knock out ausgeschaltet. Zur Induktion von oxidativem Stress wurde ein bereits charakterisiertes Angiotensin II-Modell angewandt. Zur Untersuchung gehörten neben den Superoxid-Messungen auch die Bestimmung der Stickstoffmonoxid-Mengen in Serum und Aortengewebe, die Relaxationsmessungen in isometrischen Tonusstudien sowie HPLC-basierte Assays. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Aktivierung der AMPK mittels AICAR die Angiotensin II induzierte Endotheldysfunktion, der oxidative Stress und auch die vaskuläre Inflammation verbessert werden konnte. Weiterhin zeigte sich dass der knock out der vaskulären Isoform (α1) im Angiotensin II Modell eine signifikant verstärkte Endotheldysfunktion, oxidativen Stress und Inflammation nach sich zog. Anhand der erhobenen Daten konnte die NADPH-Oxidase als Hauptquelle des Angiotensin II induzierten oxidativen Stresses identifiziert werden, wobei sich diese Quelle als AMPK sensitiv erwies. Durch die Aktivierung konnte die Aktivität der NADPH-Oxidase verringert und durch die α1AMPK Defizienz signifikant erhöht werden. Auch die mitochondriale Superoxidproduktion konnte durch die Modulation der AMPK Aktivität beeinflusst werden. Die vaskuläre Inflammation, die anhand der Surrogaten VCAM-1, COX-2 und iNOS untersucht wurde, konnte durch Aktivierung der AMPK verringert werden, der knock out der α1AMPK führte so einer sehr starken Expressionssteigerung der induzierbaren NO-Synthase, was in einem starken Anstieg der NO-Produktion und somit der Peroxynitritbildung resultierte.Die dargestellten Daten deuten stark auf eine protektive Funktion der AMPK im vaskulären System hin und sollte als therapeutisches Ziel, nicht nur in Bezug auf diabetische Patienten, in Betracht gezogen werden.

Regulation of Nox4 expression by histone deacetylases in human endothelial cells : involvement of epigenetic mechanisms

Nox4 is a member of the NADPH oxidase family, which represents a major source of reactive oxygen species (ROS) in the vascular wall. Nox4-mediated ROS production mainly depends on the expression levels of the enzyme. The aim of my study was to investigate the mechanisms of Nox4 transcription regulation by histone deacetylases (HDAC). Treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC-derived EA.hy926 cells with the pan-HDAC inhibitor scriptaid led to a marked decrease in Nox4 mRNA expression. A similar down-regulation of Nox4 mRNA expression was observed by siRNA-mediated knockdown of HDAC3. HDAC inhibition in endothelial cells was associated with enhanced histone acetylation, increased chromatin accessibility in the human Nox4 promoter region, with no significant changes in DNA methylation. In addition, the present study provided evidence that c-Jun played an important role in controlling Nox4 transcription. Knockdown of c-Jun with siRNA led to a down-regulation of Nox4 mRNA expression. In response to scriptaid treatment, the binding of c-Jun to the Nox4 promoter region was reduced despite the open chromatin structure. In parallel, the binding of RNA polymerase IIa to the Nox4 promoter was significantly inhibited as well, which may explain the reduction in Nox4 transcription. In conclusion, HDAC inhibition decreases Nox4 transcription in human endothelial cells by preventing the binding of transcription factor(s) and polymerase(s) to the Nox4 promoter, most likely because of a hyperacetylation-mediated steric inhibition. In addition, HDAC inhibition-induced Nox4 downregulation may also involves microRNA-mediated mRNA destabilization, because the effect of the scriptaid could be partially blocked by DICER1 knockdown or by transcription inhibition.

Effects of maternal PETN treatment of spontaneously hypertensive rats on blood pressure in the offspring

Pentaerithrityltetranitrat (PETN) ist ein organisches Nitrat und wird in der Klinik zur Behandlung der Angina Pectoris eingesetzt. PETN hat, wenn direkt verabreicht, kaum Wirkung auf den Blutdruck. Diese Arbeit wurde konzipiert, um einen potentiellen „perinatalen Programmierung“-Effekt von PETN in spontan-hypertensiven Ratten (SHR), einem Rattenmodel der genetischen Hypertonie, zu testen. Die F0-Elterntiere wurden mit PETN (50 mg/kg/Tag) während der Schwangerschaft und der Laktation behandelt; die F1-Nachkommen bekamen nach der Ablaktation normales Haltungsfutter. Der Blutdruck wurde an den Nachkommen vom 3. Monat bis zum 8. Monat nach der Geburt gemessen. Maternale PETN-Behandlung hatte kaum Wirkung auf den Blutdruck in den männlichen SHR-Nachkommen. Dagegen zeigten die weiblichen Nachkommen der PETN-Behandlungsgruppe eine persistente Reduktion des Blutdrucks. Der systolische Blutdruck war in den weiblichen Nachkommen in der PETN-Gruppe etwa 13 mmHg niedriger im 4. Monat und etwa 10 mmHg niedriger im 8. Monat als in den Kontrolltieren. Dieser lang-anhaltende Effekt ging mit einer substanziellen Änderung der Genexpression einher, die auch beim 8. Monat noch nachzuweisen war. In den Aorten der weiblichen F1-Nachkommen wurde Veränderungen an Genexpression der α-adrenergen Rezeptoren sowie Endothelin-Rezeptoren festgestellt, die aber funktionell von minimaler Bedeutung für die PETN-Wirkung waren. Hingegen war eine klare Rolle des StickstoffmoNOXid (NO) zu sehen. Maternale PETN-Behandlung führte zur Heraufregulation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) und der GTP-Cyclohydrolase I (GCH-1). GCH-1 ist für die Biosynthese des Tetrahydrobiopterins, eines essentiellen eNOS-Kofaktors, entscheidend, und dadurch auch für die eNOS-Funktionalität. Zusätzlich wurden auch anti-oxidative Enzyme wie die mitochondriale Superoxid-Dismutase (SOD2), die Glutathion-Peroxidase 1 (GPx1) und die Hem-Oxygenase 1 (HO-1) heraufreguliert, und die Superoxid-produzierende NADPH-Oxidase NOX1 herunterreguliert. Dies kann zur Verminderung vom oxidativen Stress und Erhöhung der NO-Bioverfügbarkeit führen. Letztlich wurde auch ~ 74 ~ die Sirtuin 1 (SIRT1) durch maternale PETN-Behandlung heraufreguliert, die auch zur Heraufregulation der SOD2, GPx1 und eNOS beitragen kann. Im Organbad-Experiment wurde die Acetylcholin-induzierte, Endothel-abhängige Vasodilatation in der Aorta der weiblichen Nachkommen der PETN-Gruppe verstärkt. Diese verbesserte Endothelfunktion, was vermutlich aus der Genexpressionsänderung resultiert, stellt sehr wahrscheinlich einen Schlüsselmechanismus der Blutdrucksenkung in den Nachkommen der PETN-behandelten F0-Tiere dar.

Molekulare Mechanismen Proteinkinase C-induzierter Nox4-Hochregulation in humanen Endothelzellen

Eine verstärkte Transkription von NADPH-Oxidasen (Nox) wird mit der Entstehung von atherosklerotischer Veränderungen in Verbindung gebracht. Die Arbeit unserer Gruppe zeigte, dass die Aktivität der Proteinkinase C (PKC) zu einer Nox4-Hochregulation führt, der dominanten NOX Isoform in endothelialen Zellen. Die vorliegende Arbeit zielte auf die Aufdeckung der dowm-stream gelegenen Mechanismen. Die Behandlung von humanen EA.hy 926-Zellen mit dem PKC Aktivator Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) für 48 h führte in eine signifikante Nox4-mRNA-Hochregulation, welche mittels PKC-Inhibitoren oder PKC alpha siRNA abgewendet werden konnte. PMA führte zu einer andauernden Aktivierung der MAP-Kinase Erk1/2. Die PMA vermittelte Nox4-Expression konnte durch Erk1/2-Inhibitoren oder durch Erk1/2-Knock-down geblockt werden. Down-stream konnte die Involvierung der Erk1/2-Substarte Elk-1 und c-Fos mittels siRNA-Experimente gezeigt werden. Darüber hinaus blockte die Inhibierung der Histondeacetylasen (HDACs) mit Scriptaid oder durch HDAC3-Knock-down mittels siRNA die PMA-induzierte Nox4-Expression in EA.hy 926-Zellen, weswegen eine Rolle für HADC3 in der Regulation der Nox4-Expression angezeigt wurde. Abschließend reduzierte ein Knock-down von p53 (siRNA) deutlich die basale Expression von Nox4, hatte aber nur einen kleinen Effekt auf die PMA-induzierte Nox4-Expression. Zusammenfassend zeigen die Daten der vorliegenden Arbeit, dass in einer PKC alpha induzierten Nox4-mRNA-Hochregulation Erk1/2, Elk-1, cFos und HDAC3 involviert sind.

Investigations on DNA methylation by Dnmt2 and impact of tRNA modifications on TLR7 stimulation

The incorporation of modified nucleotides into ribonucleic acids (RNAs) is important for their structure and proper function. These modifications are inserted by distinct catalytic macromolecules one of them being Dnmt2. It methylates the Cytidine (C) at position 38 in tRNA to 5-methylcytidine (m5C). Dnmt2 has been a paradigm in this respect, because all of its nearest neighbors in evolution are DNA-cytosine C5-methyltransferases and methylate DNA, while its (own) DNA methyltransferase activity is the subject of controversial reports with rates varying between zero and very weak. This work determines whether the biochemical potential for DNA methylation is present in the enzyme. It was discovered that DNA fragments, when presented as covalent RNA:DNA hybrids in the structural context of a tRNA, can be more efficiently methylated than the corresponding natural tRNA substrate. Additional minor deviations from a native tRNA structure that were seen to be tolerated by Dnmt2 were used for a stepwise development of a composite system of guide RNAs that enable the enzyme to perform cytidine methylation on single stranded DNA in vitro. Furthermore, a proof-of-principle is presented for utilizing the S-adenosyl methionine-analog cofactor SeAdoYn with Dnmt2 to search for new possible substrates in a SELEX-like approach.rnIn innate immunity, nucleic acids can function as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) recognized by pattern recognition receptors (PRRs). The modification pattern of RNA is the discriminating factor for toll-like receptor 7 (TLR7) to distinguish between self and non-self RNA of invading pathogens. It was found that a 2'-O-methylated guanosine (Gm) at position18, naturally occurring at this position in some tRNAs, antagonizes recognition by TLR7. In the second part of this work it is pointed out, that recognition extends to the next downstream nucleotide and the effectively recognized molecular detail is actually a methylated dinucleotide. The immune silencing effect of the ribose methylation is most pronounced if the dinucleotide motif is composed of purin nucleobases whereas pyrimidines diminish the effect. Similar results were obtained when the Gm modification was transposed into other tRNA domains. Point mutations abolishing base pairings important for a proper tertiary structure had no effect on the immune stimulatory potential of a Gm modified tRNA. Taken together these results suggest a processive type of RNA inspection by TLR7.rn

Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTPlambda bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns

Der isthmische Organisator liegt an der Grenze zwischen dem sich entwickelnden Mittel- und Hinterhirn und kontrolliert Wachstum und Musterbildung dieser beiden Hirnregionen. In der vorliegenden Arbeit wird die räumliche und zeitliche Expression der Rezeptor-ähnlichen Protein Tyrosin Phosphatase lambda aus dem Huhn (cRPTPλ, auch als cRPTPψ bekannt) während der Entwicklung dieser Struktur beschrieben. Nach einer anfänglich weitläufigen Expression im kaudalen Vorderhirn und in der Mittelhirnregion, beschränkt sich die Expression von cRPTPλ zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 auf die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, den Bereich der späteren neuralen Retina und Linse und auf einen schmalen Ring anterior der isthmischen Einschnürung, welcher der molekularen Mittel- / Hinterhirngrenze (MHO) entspricht. Ab dem embryonalen Tag E3.5 wird RPTPλ dann auch im gesamten Mittelhirn gebildet. Um Hinweise auf die Funktion von cRPTPλ zu bekommen, wurde die Regulation dieses Moleküls untersucht. Die Expression von cRPTPλ am MHO wird von dem Fibroblasten Wachstumsfaktor Fgf8 und dem Transkriptionsfaktor Lmx1b, nicht aber von dem sezernierten Glykoprotein Wnt1 induziert. Der Transkriptionsfaktor En-1 unterdrückt die Expression von cRPTPλ am MHO. cRPTPλ-Expression im Mittelhirn wird negativ durch das sezernierte Protein Sonic Hedgehog reguliert, während Lmx1b und En-1 dort keinen Einfluss auf das Expressionsmuster von cRPTPλ haben. Fgf8 und Wnt1 sind maßgeblich an der Regulation von Wachstum und Musterbildung des embryonalen Mittelhirns beteiligt. Funktionelle Studien zu RPTPλ deuten darauf hin, dass dieses Protein als negativer Rückkopplungsmechanismus beider Signalwege wirken kann. RNAi- und Überexpressionsstudien am MHO lieferten Hinweise darauf, dass RPTPλ der Induktion der Wnt1-Expression durch Fgf8 entgegenwirkt. Dies scheint durch Interaktion noch unbekannter Faktoren mit der Juxtamembrandomäne von RPTPλ vermittelt zu werden. Auf das Expressionsmuster von Fgf8 selbst, oder einer Reihe anderer Faktoren, die ebenfalls von Fgf8 reguliert werden, hat RPTPλ allerdings keinen Einfluss. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine „künstliche“ Aufrechterhaltung der Expression von cRPTPλ im Mittelhirn zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 zu einem stark verkleinerten Mesenzephalon führt. RPTPλ bindet in vivo an β-Catenin, ein zentrales Protein des kanonischen Wnt-Signalweges, und moduliert dadurch vermutlich das Wnt-Signal, welches seinerseits Proliferation im Mesenzephalon fördert. Durch diesen Mechanismus könnte cRPTPλ als „Bremse“ des kanonischen Wnt-Signalweges im Mittelhirn wirken.

Untersuchungen zur Induktion von Filopodien durch das Amyloid Precursor Like Protein 1 (APLP1), ein Mitglied der APP-Genfamilie

Die Alzheimer Krankheit ist eine fortschreitendende Demenzerkrankung von der in Deutschland ca. 1,6 Millionen Menschen betroffen sind. Im Gehirn der Patienten finden sich sogenannte amyloide Plaques, deren Hauptbestandteil das Aβ-Protein ist. Dieses Peptid ist ein Spaltprodukt des APP-Proteins (engl. amyloid precursor protein). APP ist das namensgebende Mitglied der APP-Proteinfamilie zu der neben APP die beiden APP-Homologen APLP1 und APLP2 (engl. amyloid precursor like protein) gehören. Obwohl inzwischen über die pathologische Rolle dieser Proteinfamilie bei der Alzheimer Krankheit vieles bekannt ist, bleiben die physiologischen Funktionen dieser Proteine bisher größtenteils ungeklärt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals einen APLP1-spezifischen Effekt auf die Ausbildung von Filopodien. Sowohl das humane als auch das murine APLP1 induzierten nach transienter Überexpression die Bildung zahlreicher filopodialer Fortsätze auf der Membran von PC12-Zellen. Vergleichbare Resultate konnten mit beiden APLP1-Proteinen auch auf der Membran von embryonalen (E18.5), cortikalen Neuronen der Ratte gezeigt werden. Dass APLP1 einen derartigen Effekt auf Neuronen und PC12-Zellen zeigt, begründet die Annahme, dass APLP1 in vivo eine Funktion bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen übernimmt. Anhand von Versuchen mit deletierten APLP1-Proteinen und APLP1/APLP2-Chimärproteinen konnte gezeigt werden, dass die von Exon 5 und Exon 6 codierten Bereiche des APLP1 für die Induktion der Filopodien essentiell sind. Unter Einbeziehung von in ihrer räumlichen Struktur bereits bekannten Domänen und aufgrund von Homologievergleichen der primären Aminosäuresequenz dieser Region mit entsprechenden Bereichen der APP- bzw. APLP2-Proteine wurde die wahrscheinliche Lage der Filopodien-induzierenden Domäne innerhalb des von Exon 6 codierten Bereiches diskutiert. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die untersuchte Induktion von Filopodien durch die sogenannte α-Sekretierung moduliert werden kann. Unter den gewählten Versuchsbedingungen war nur membranständiges APLP1, nicht aber sekretiertes APLP1 in der Lage, Filopodien zu induzieren. Abschliessend wurden Ergebnisse gezeigt, die erste Einblicke in Signalkaskaden erlauben, die von APLP1 angesteuert werden und so die Enstehung der Filopodien auslösen. Bezüglich des primären Prozesses der Signalkaskade, der Bindung von APLP1 an einen bisher unbekannten Rezeptor, wurde die Möglichkeit diskutiert, ob APP oder APLP2 oder sogar APLP1 selbst als Rezeptor fungieren könnten. Die beobachteten Prozesse nach Überexpression von APLP1 entsprechen vermutlich einer physiologischen Funktion bei der Differenzierung von Neuronen, die mit der Interaktion einer extrazellulär gelegenen Domäne mit einem Rezeptor beginnt, die Aktivierung einer Signalkaskade zur Akrinreorganisation zu Folge hat und die Entstehung filopodialer Strukturen auslöst.

Zelluläre Kontrolle adulter Neurogenese - Expression und Funktion des VEGF-Rezeptor-1 (Flt-1) im adulten Säugerhirn

Neurale Stammzellen sind im adulten Säugerhirn in der Subventrikulären Zone (SVZ) der Lateralventrikel und dem Hippokampus lokalisiert. In der SVZ entstandene neurale Zellen migrieren entlang eines von Astrozyten umgebenen Pfades, dem Rostralmigratorischen Strom (RMS), zum Olfaktorischen Bulbus (OB), wo sie zu olfaktorischen Interneuronen differenzieren. Vaskuläre Wachstumsfaktoren, wie VEGF-A beeinflussen die adulte Neurogenese. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig detailliert die spezifische Expression des VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR-1) in den Regionen olfaktorischer und hippokampaler Neurogenese des adulten ZNS. Die Ergebnisse zeigen, dass VEGFR-1 im adulten Hirn hauptsächlich in GFAP-positiven Zellen in der SVZ, dem RMS, dem OB, dem Corpus callosum und dem Hippokampus exprimiert ist. In vivo-Analysen transgener Mäuse (Flt-1TK-/-), denen die Signaltransduktionsdomäne des VEGFR-1 fehlt, demonstrieren hier erstmals eine Rolle des VEGFR-1 in adulter Neurogenese. Flt-1TK-/- weisen eine erhöhte Proliferation neuronaler Vorläuferzellen der SVZ auf. Im RMS ist jedoch 6 Tage nach BrdU-Administration die Anzahl markierter Zellen im Vergleich zum Wildtyp (wt) um 47,97% reduziert, ohne dass es zu einer Akkumulation in der SVZ kommt. Zusammen mit der in Kulturversuchen stark erhöhten Migrationsgeschwindigkeit von Neuroblasten der Flt-1TK-/- und einer verminderten Abwanderung von Zellen aus dem RMS ins Corpus callosum der Flt-1Tk-/-, weist dies auf eine gesteigerte Migration zum OB hin. Tatsächlich war der OB der Flt-1TK-/-, vor allem die Plexiform- und Periglomerulärzellschicht (PGL), signifikant vergrößert. Im OB der transgenen Tiere migrieren zudem signifikant mehr BrdU-markierte Zellen in die PGL. Dort differenzieren signifikant mehr Neurone als im wt. Subtypisierungen zeigen, zudem eine erhöhte Differenzierung in dopaminerge Interneurone in der PGL der Flt-1TK-/-. Im Gehirn Flt-1TK-/- war die Konzentration von VEGF-A erhöht. Intrazerebroventrikuläre Infusion von VEGF-A in wt-Tiere erbrachte den eindeutigen Nachweis, dass die Erhöhung der VEGF-A-Konzentration im Gehirn der Flt-1TK-/- ursächlich für die in diesen Tieren beobachtete Reduktion der BrdU-positiven Zellen im RMS ist. Dies ist gleichzeitig der erste Nachweis einer Wirkung von VEGF-A auf Neuroblasten im RMS in vivo unter physiologischen Bedingungen. Die erhöhte VEGF-A-Konzentration könnte auch den anderen hier dargelegten Effekten zugrunde liegen. VEGFR-1 ist somit ein regulatorischer Faktor für die adulte olfaktorische Neurogenese und spielt eine potentielle Rolle in der Differenzierung dopaminerger Interneurone.

Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.

Die regulatorische Funktion des Usher-Syndrom-Proteins SANS in Proteinnetzwerken

Die vorliegende kumulative Arbeit umfasst Analysen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen des humanen Usher-Syndroms (USH), der häufigsten Ursache kombinierter vererblicher Taub-Blindheit. Ziel dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse zur Funktion der USH-Proteine und den von ihnen organisierten Protein-Netzwerken in der Photorezeptorzelle zu erhalten. Dadurch sollten weitere Einsichten in die molekularen Ursachen des retinalen Phänotyps von USH gewonnen werden. Die Ergebnisse dieser Analysen wurden in einem Übersichtsartikel (I) und zwei Originalarbeiten (II, III) zusammengestellt.rn Im Übersichtsartikel (I) wurden die vorliegenden Hinweise zusammengefasst, die USH auf Grundlage der molekularen Verbindungen ebenfalls als Ciliopathien definiert. Zudem wird die Bedeutung des periciliären USH-Proteinnetzwerkes für das sensorische Cilium (Außensegment) der Photorezeptorzelle herausgestellt. rn In Publikation II wurde der Aufbau des USH1-USH2-Proteinnetzwerkes als Teil des periciliären Komplexes analysiert, der beim cargo handover von vesikulärer Fracht vom Innensegment- auf den ciliären Transport für die Photorezeptorzelle essentiell ist. Experimentell wurde Ush2a als neuer SANS-Interaktionspartner validiert. Des Weiteren wurde ein ternärer Komplex aus den USH-Proteinen SANS, Ush2a und Whirlin identifiziert, dessen Zusammensetzung durch die phosphorylierungsabhängige Interaktion zwischen SANS und Ush2a reguliert werden könnte. Dieser ternäre Komplex kann sowohl der Integrität der Zielmembran dienen als auch am Transfer von Molekülen ins Außensegment beteiligt sein.rn In Publikation III wurde das MAGUK-Protein Magi2 als neuer Interaktionspartner von SANS identifiziert und die Interaktion durch komplementäre Interaktionsassays validiert. Dabei wurde ein internes PDZ-Binde-Motiv in der SAM-Domäne von SANS identifiziert, das die Interaktion zur PDZ5-Domäne von Magi2 phosphorylierungsabhängig vermittelt. Dadurch wurde bestätigt, dass SANS durch post-translationale Modifizierung reguliert wird. Weiterführende Experimente zur Funktion des Magi2-SANS-Komplexes zeigen, dass Magi2 an Prozess der Rezeptor-vermittelten Endocytose beteiligt ist. Die Phosphorylierung von SANS durch die Kinase CK2 spielt bei der Endocytose ebenfalls eine wichtige Rolle. Der Phosphorylierungsstatus von SANS moduliert die Interaktion zu Magi2 und reguliert dadurch negativ den Prozess der Endocytose. In RNAi-Studien wurde die durch Magi2-vermittelte Endocytose darüber hinaus mit dem Prozess der Ciliogenese verknüpft. Die Analyse der subzellulären Verteilung der Interaktionspartner lokalisieren Magi2 im periciliären Komplex und assoziieren das periciliäre USH-Proteinnetzwerk dadurch mit dem Prozess der Endocytose in der ciliary pocket. Der SANS-Magi2-Komplex sollte demnach für Aufbau und Funktion des sensorischen Ciliums der Photorezeptorzelle eine wichtige Rolle spielen.rn Die Gesamtheit an Informationen, die aus den Publikationen dieser Dissertation und aus den Kooperationsprojekten (*) resultieren, haben die Kenntnisse zur zellulären Funktion der USH-Proteine und ihrer Interaktionspartner und damit über die pathogenen Mechanismen von USH erweitert. Dies bildet die Basis, um fundierte Therapiestrategien zu entwickeln.