Die regulatorische Funktion des Usher-Syndrom-Proteins SANS in Proteinnetzwerken

Die vorliegende kumulative Arbeit umfasst Analysen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen des humanen Usher-Syndroms (USH), der häufigsten Ursache kombinierter vererblicher Taub-Blindheit. Ziel dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse zur Funktion der USH-Proteine und den von ihnen organisierten Protein-Netzwerken in der Photorezeptorzelle zu erhalten. Dadurch sollten weitere Einsichten in die molekularen Ursachen des retinalen Phänotyps von USH gewonnen werden. Die Ergebnisse dieser Analysen wurden in einem Übersichtsartikel (I) und zwei Originalarbeiten (II, III) zusammengestellt.rn Im Übersichtsartikel (I) wurden die vorliegenden Hinweise zusammengefasst, die USH auf Grundlage der molekularen Verbindungen ebenfalls als Ciliopathien definiert. Zudem wird die Bedeutung des periciliären USH-Proteinnetzwerkes für das sensorische Cilium (Außensegment) der Photorezeptorzelle herausgestellt. rn In Publikation II wurde der Aufbau des USH1-USH2-Proteinnetzwerkes als Teil des periciliären Komplexes analysiert, der beim cargo handover von vesikulärer Fracht vom Innensegment- auf den ciliären Transport für die Photorezeptorzelle essentiell ist. Experimentell wurde Ush2a als neuer SANS-Interaktionspartner validiert. Des Weiteren wurde ein ternärer Komplex aus den USH-Proteinen SANS, Ush2a und Whirlin identifiziert, dessen Zusammensetzung durch die phosphorylierungsabhängige Interaktion zwischen SANS und Ush2a reguliert werden könnte. Dieser ternäre Komplex kann sowohl der Integrität der Zielmembran dienen als auch am Transfer von Molekülen ins Außensegment beteiligt sein.rn In Publikation III wurde das MAGUK-Protein Magi2 als neuer Interaktionspartner von SANS identifiziert und die Interaktion durch komplementäre Interaktionsassays validiert. Dabei wurde ein internes PDZ-Binde-Motiv in der SAM-Domäne von SANS identifiziert, das die Interaktion zur PDZ5-Domäne von Magi2 phosphorylierungsabhängig vermittelt. Dadurch wurde bestätigt, dass SANS durch post-translationale Modifizierung reguliert wird. Weiterführende Experimente zur Funktion des Magi2-SANS-Komplexes zeigen, dass Magi2 an Prozess der Rezeptor-vermittelten Endocytose beteiligt ist. Die Phosphorylierung von SANS durch die Kinase CK2 spielt bei der Endocytose ebenfalls eine wichtige Rolle. Der Phosphorylierungsstatus von SANS moduliert die Interaktion zu Magi2 und reguliert dadurch negativ den Prozess der Endocytose. In RNAi-Studien wurde die durch Magi2-vermittelte Endocytose darüber hinaus mit dem Prozess der Ciliogenese verknüpft. Die Analyse der subzellulären Verteilung der Interaktionspartner lokalisieren Magi2 im periciliären Komplex und assoziieren das periciliäre USH-Proteinnetzwerk dadurch mit dem Prozess der Endocytose in der ciliary pocket. Der SANS-Magi2-Komplex sollte demnach für Aufbau und Funktion des sensorischen Ciliums der Photorezeptorzelle eine wichtige Rolle spielen.rn Die Gesamtheit an Informationen, die aus den Publikationen dieser Dissertation und aus den Kooperationsprojekten (*) resultieren, haben die Kenntnisse zur zellulären Funktion der USH-Proteine und ihrer Interaktionspartner und damit über die pathogenen Mechanismen von USH erweitert. Dies bildet die Basis, um fundierte Therapiestrategien zu entwickeln.

The present cumulative thesis deals with analyses to elucidate the molecular base of the human Usher syndrome (USH), the most common form of combined hereditary deaf-blindness. Aim of the project was to gather novel insights into the function of USH proteins and associated protein networks in photoreceptor cells. Thereby, a deeper understanding of the molecular cause of the retinal USH-phenotype should be gained. The results of these analyses were assembled in one review article (publication I) and two papers (publication II and III).rn The review article summarized the existing references defining USH as a ciliopathy based on the molecular links. Furthermore, the importance of the periciliary USH protein network for the sensory cilium (outer segment) of the photoreceptor cells was featured.rn In publication II the composition of the periciliary USH1-USH2 protein network was analyzed. As part of the periciliary complex this network is essential for cargo handover of load vesicles from the inner segment transport to the ciliary transport system. In assays we identified Ush2a as new SANS interaction partner and validated a ternary complex composed of the USH proteins SANS, Ush2a and whirlin. The complex assembly might be regulated by the phosphorylation dependent interaction between SANS and Ush2a and could be involved in maintaining the integrity of the cargo target membrane as well as transporting molecules into the outer segment.rn In publication III the MAGUK protein Magi2 was identified as new SANS´ interaction partner and the direct interaction was validated by complementary binding assays. Thereby, an internal binding motif in the SAMS domain of SANS was identified, which regulates the interaction to the PDZ5 domain of Magi2 phosphorylation dependent. This confirmed the regulation of SANS by post-translational modifications Further experiments to analyze the function of the SANS-Magi2 complex demonstrated the involvement of Magi2 in receptor-dependent endocytosis. This process is regulated by the phosphorylation of SANS by the kinase CK2. The phosphorylation state of SANS modulates the interaction to Magi2 and regulates thereby negatively the endocytosis. In RNAi studies, the Magi2-mediated endocytosis could be associated with the process of ciliogenesis. Analyses of the subcellular distribution of SANS and Magi2 localize Magi2 in the periciliary complex and associate the periciliary USH protein network with the process of endocytosis in the ciliary pocket. The SANS-Magi2 complex might play an important role in development and maintenance of the sensory cilium of the photoreceptor cell.rn The information resulting from the publication of this thesis and from cooperation projects (*) extended the knowledge of the cellular function of USH proteins and their interaction partners and with it the pathogenic mechanisms leading to USH. This is the base to develop substantiated therapeutic strategies.