Studien zur Immunregulation am Beispiel der Kollagen-Typ-II-induzierten Arthritis

Die Immunisierung von Mäusen bestimmter Stämme (z.B. DBA/1) mit Kollagen-Typ-II (CII) führt zu Gelenkentzündungen, die in ihrem Verlauf der Rheumatoiden Arthritis beim Menschen ähnlich sind. Viele Untersuchungen deuten darauf hin, daß vor allem TH1-Zellen entscheidend an der Entstehung einer CIA beteiligt sind. In diesem Zusammenhang ist IL-12, das an der Induktion der TH1-Zellantwort beteiligt ist, von herausragender Bedeutung. Zur Klärung der Funktion von IL-12 wurde ein IL-12-Antagonist, (IL-12(p40)2), der aus einem Homodimer der IL-12p40-Kette besteht, in vivo eingesetzt. DBA/1-Mäuse, die transgen für die T-Zellrezeptor ß-Kette eines CII-spezifischen, arthritogenen T-Zellklons sind und infolge dessen eine CIA mit 100%-iger Inzidenz, frühem Auftreten und einem schweren chronischen Verlauf entwickeln, wurden mit IL-12(p40)2 behandelt. Die Behandlung von TCR-ßtg-Mäusen mit IL-12(p40)2 verzögerte die Entwicklung einer CIA und führte zu deutlich abgeschwächten Krankheitssymptomen, konnte aber nicht die Induktion einer CIA verhindern. Darüber hinaus produzierten die Milzzellen der IL-12(p40)2-behandelten Gruppe nach einer Stimulation mit CII geringere Menge an IFN-g, verglichen mit Kontrollgruppe. Somit resultiert aus einer in vivo Neutralisation von IL-12 eine supprimierte Entwicklung von CII-spezifischen TH1-Zellen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß endogen gebildetes IL-12 bei der Induktion einer CIA eine wichtige Rolle spielt, indem es die Differenzierung von TH1-Zellen fördert und die Produktion von IFN-g steigert. Hinsichtlich der Funktion von IFN-g bei der CIA gibt es allerdings widersprüchliche Befunde. Zur Klärung der Funktion von IFN-g wurden die TCR-ßtg-Mäuse mit Mäusen gekreuzt, die defizient für die Produktion von IFN-g (IFN-g KO) sind. Es zeigte sich, daß keine der verwendeten F2 (IFN-g KO, TCR-ßtg)-Mäuse nach Immunisierung Symptome einer CIA entwickelten. Somit scheint IFN-g essentiell für die Entstehung einer CIA zu sein. Unerwarteterweise führte aber auch die Behandlung mit IL-12 von F2 (IFN-g KO,TCR-ßtg)-Mäusen in 50% der Tiere zur Entwicklung einer CIA. Da solche Mäuse kein IFN-g bilden können, kann IL-12 auch unabhängig von IFN-g die Induktion einer CIA vermitteln. IL-12 scheint somit eine zweifache Bedeutung bei der Entstehung einer CIA zuzukommen, zum einen als direkter Induktor, wie am Beispiel der F2 (IFN-g KO, TCR-ßtg)-Mäuse nachgewiesen wurde, und zum anderen als starker Promoter der IFN-g-Bildung in normalen Mäusen.

Production, purification, properties and application of the cellulases from a wild type strain of a yeast isolate

Kurzzusammenfassung Produktion, Reinigung, Eigenschaften und Anwendung von Cellulasen eines Wildtyp-Hefeisolates. Die effiziente Verwendung von Cellulose wird in naher Zukonft ein wichtiges Instrument zur Vermeidung einer Nahrungsmittel- und Energieknappheit werden. Deshalb haben wir uns intensiv mit Cellulasen befaßt, die aus Hefestämmen isoliert wurden. Die Fähigkeit der Cellulase-produktion eines Hefe-Stammes der Feuerwanze Pyrrhocoris apterus wurde genauer untersucht. Die systematische Stellung des Hefe-Isolates PAG1 wurde durch Sequenzierung der 18S rDNA bestimmt. Es zeigte eine nahe Verwandtschaft zu einem bereits beschriebenen Stämme der Gattung Trichosporon. Außerdem wurden die Wachstums-bedingungen für eine optimale Cellulase–Produktion bestimmt. Anschließend konnte eine der produzierten Cellulasen mit FPLC aufgereinigt und deren biochemische Eigenschaften (z.B. Substratspezifität, Temperatur optimum, optimaler pH-Wert, Einfluß von Chemikalien) untersucht werden. Eine Analyse der Abbau-Produkte zeigte, daß kristalline Cellulose und CMC zu Cellobiose, Cellulotriose, Cellulotetraose und Cellulopentaose in einem molaren Verhältnis von 32:16:8:1 umgesetezt wurden. Bei Zusatz von ?-Glykosidase aus demselben Hefestamm entstand nur Glucose und Cellobiose in einem molaren Verhältnis von 1:10. Da bisher nur eine Publikation über Cellulase-produzierende Hefe-Stämme erschienen ist, zeigen auch unsere Untersuchungen, daß Wildtyp-Hefestämme Cellulasen mit interessanten Eigenschaften produzieren können.

Forstentomologische Untersuchungen an Eichen unterschiedlicher Vitalität des Pfälzerwaldes

Seit Beginn der Waldzustandserhebungen im Jahr 1984 verschlechterte sich der Zustand der Eiche sowohl auf Bundesebene als auch im Land Rheinland-Pfalz deutlich. 1998 konnten nur noch 5 % der rheinland-pfälzischen Eichen in die Kategorie "ohne Schadensmerkmale" eingestuft werden. Vor diesem Hintergrund ergab sich die Notwendigkeit, die biotischen Stress- und Schadfaktoren näher zu untersuchen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf den holzbewohnenden Käfern von Traubeneichen (Quercus petraea) aus dem Pfälzerwald. Zu diesem Zweck wurden für die erste Probenserie Untersuchungsbäume aus den Vitalitätsstufen 'vital', 'geschädigt', 'ein Jahr tot' und 'zwei Jahre tot' ausgewählt und in die drei Straten Stammfuß, Kronenansatz und Derbholz unterteilt. In der zweiten Probenserie kamen keine 'vitalen' Stämme mehr zum Einsatz. Die einzelnen Proben wurden in Fasseklektoren überführt, in denen die xylobionten Käfer ihre Entwicklung beenden und schlüpfen konnten. Die erste Probenserie wurde im Herbst 1998 entnommen, die zweite Serie im darauffolgenden Herbst. Zusätzlich zu diesen Laboruntersuchungen wurden Freilanduntersuchungen mit Stammeklektoren an vier stehenden Eichen im Wald durchgeführt. Die gefangenen Tiere wurden nach Ordnungen sortiert und gezählt, die Käfer nach Möglichkeit bis zur Art bestimmt. Die Ergebnisse der ersten und zweiten Serie wurden in Abundanzen (Ind./m² Rindenoberfläche) umgerechnet, um einen Vergleich der Proben untereinander möglich zu machen. Insgesamt wurden aus den Fasseklektoren beider Serien Käfer mit einer Abundanz von 36.990 Ind./m² ausgewertet. In den Fallen der Stammeklektoren wurden insgesamt 1.487 Käfer gefunden. Den weitaus größten Teil der Käfer der Fasseklektoren stellen die Borkenkäfer (Scolytidae). Dieses Ergebnis schlägt sich auch in der Betrachtung der Dominanz der einzelnen Arten nieder. In nahezu allen Fällen gehörten die Hauptarten in die Familie Scolytidae. Der mit den Absterbeerscheinungen der Eichen in Verbindung gebrachte Prachtkäfer Agrilus biguttatus (Buprestidae) trat in deutlich geringeren Abundanzen auf. Aufgrund seiner Fraßtätigkeit (Ringelung der Larven im Kambialbereich der Bäume) gehört er aber zu den potentiell stark schädigenden Käfern. Neben A. biguttatus sind auch A. sulcicollis und die gefundenen Borkenkäfer in der Lage, vorgeschädigte und geschwächte Eichen zu befallen und noch weiter zu schwächen. Aus waldhygienischen Gründen sollten deshalb regelmäßige Kontrollen durchgeführt werden. Bei erkennbarem Befall sollten die betroffenen Bäume gefällt und aus dem Bestand entfernt werden. Langfristig können die Vermeidung von nicht-standortgerechtem Eichenanbau und das Anlegen von naturnahen Mischbeständen zu den waldbaulichen Maßnahmen gerechnet werden, die eine Reduktion des Infektionsrisikos zur Folge haben. Die 'ein Jahr toten' Bäume wiesen die mit Abstand höchste Abundanz an Lebendholzbesiedlern auf. Bäume, die bereits ein Jahr länger tot im Bestand standen, wurden von deutlich weniger Lebendholzbesiedlern befallen, d.h. von 'zwei Jahre toten' Bäumen ging ein potentiell geringerer Infektionsdruck aus als von 'ein Jahr toten' Eichen. Im Laufe des Verrottungsprozesses verringert sich diese Gefahr noch weiter, da die Holzfeuchte weiter abnimmt und die Lebendholzbesiedler keine Nahrungsgrundlage mehr vorfinden. Besonders die Gefahr des Neubefalls durch Agrilus von mindestens zweijährig toten Bäumen besteht kaum, weil zumindest die Larven der ersten Stadien des Prachtkäfers auf lebendes Gewebe angewiesen sind.

Isolierung und Charakterisierung von Spirochaeten aus dem Termitendarm

Termiten beherbergen in ihrem Darm eine einzigartige Flora aus Bakterien, Archaeen, Flagellaten und Hefen. Diese symbiontische mikrobielle Gemeinschaft ist am Abbau von komplexen organischen Verbindungen beteiligt und ermöglicht es den Termiten schwer abbaubares Material wie Holz als Nahrungsquelle zu nutzen. Spirochaeten, eine Gruppe beweglicher Bakterien die sich durch ihre besondere Morphologie und Art der Fortbewegung von allen anderen Mikroorganismen abgrenzen lassen, gehören zu den häufigsten Bakterien im Termitendarm. Ziel der Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung bislang unbekannter Spirochaeten aus Termitendärmen. Aus drei niederen Termitenarten konnten sechs spirochaetale Stämme gewonnen und identifiziert werden. Die Isolate ließen sich anhand der 16S rRNA Gensequenzen den Gattungen Treponema und Spirochaeta zuordnen. Im Gegensatz zu allen bislang charakterisierten Spirochaeten zeigte der Stamm SPN1 aus der Termite Neotermes castaneus eine kokkoide Zellform und war unbeweglich. Der Organismus wurde daher als neue Art, Spirochaeta coccoides sp. nov., beschrieben. Bei allen gewonnenen Isolaten handelt es sich um strikt anaerobe Organismen die verschiedene Mono-, Di- und Oligosaccharide fermentieren. Als wesentliche Stoffwechselprodukte konnten Acetat und Ethanol (sowie Formiat bei einem Stamm) identifiziert werden. Weiterhin konnten bei den untersuchten Stämmen eine Reihe von enzymatischen Aktivitäten nachgewiesen werden, die für den Abbau von Lignocellulose im Termitendarm von Bedeutung sind. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Spirochaeten eine wichtige Rolle bei der Fermentation von Abbauprodukten der Lignocellulose im Termitendarm spielen.

Die Rolle der Autoimmunreaktion gegen das SLA/LP-Molekül bei autoimmuner Hepatitis

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des SLA/LP Proteins bei der autoimmunen Hepatits untersucht. Zum einen sollte die Hypothese einer aberranten Expression des SLA/LP Moleküls als Auslöser der Autoimmunreaktion gegen SLA/LP überprüft werden. Hierzu wurde die Expression des SLA/LP Moleküls in Leber und Lymphozyten von Patienten mit verschiedenen hepatischen Erkrankungen und bei gesunden Personen bestimmt. Die quantitativen Expressionsanalysen wurden mittels real-time PCR unter Einsatz SLA/LP-spezifischer Oligonukleotide durchgeführt. Es zeigte sich, dass SLA/LP ubiquitär im Körper exprimiert wird, mit erhöhter Expression im Pankreas. Die Ergebnisse der SLA/LP Expressionsanalysen in peripheren mononukleären Blutzellen und Leberparenchymzellen von Patienten mit einer autoimmunen Hepatitis ergaben keine Hinweise auf eine aberrante Expression des SLA/LPs. Es konnte gezeigt werden, dass SLA/LP im Leberparenchym der Patienten tendenziell eher erhöht exprimiert wird, doch war kein Unterschied zwischen unterschiedlichen hepatischen Erkrankungen nachweisbar. Somit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine aberrante Expression nicht für die Auslösung der Erkrankung zuständig ist. Zum andern sollte in dieser Arbeit überprüft werden, ob eine Autoimmunreaktion gegen SLA/LP zu einer Entzündung in der Leber führen kann. Hierzu wurden Mäuse unterschiedlicher Stämme mit SLA/LP Protein in komplettem Freunds Adjuvans immunisiert und auf Leberschädigung und Leberentzündung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SLA/LP-Autoimmunität Leberentzündung und Leberschädigung auslösen kann. Die Auslösung der Hepatitis war aber vom Mausstamm und der Defizienz von Interleukin 10 abhängig. Somit scheint unter bestimmten immunologischen Bedingungen eine Immunreaktion gegen SLA/LP zu einer Leberentzündung und Leberschädigung zu führen.

Der Einfluss der T-Zellavidität und der TLR-vermittelten Aktivierung Dendritischer Zellen der Haut auf die Funktion zytotoxischer T-Zellen

Zytotoxische T-Zellen (CTL) vermitteln die effektive und gezielte Lyse Virus-infizierter und maligner Zellen. Um den Einfluss der T-Zellavidität auf die Immunodominanz von CTL-Antworten zu untersuchen, wurde ein neues Mausmodell mit zwei T-Zellrezeptor (TCR)-transgenen Stämmen etabliert. Die T-Zellen der beiden Stämme exprimieren denselben TCR in unterschiedlicher Dichte. Studien mit diesem Modell zeigten, dass bei identischen Vorläuferfrequenzen die hochaviden T-Zellen nach Immunisierung auf Kosten der niederaviden T-Zellen proliferieren. Sind die niederaviden T-Zellen jedoch im Überschuss vorhanden, so können sie die Antwort dominieren. Hieraus lässt sich schließen, dass die CTL Immunodominanz durch die Avidität und die Vorläuferfrequenz der T-Zellklone bestimmt wird. Darüber hinaus wurde ein neues transkutanes Immunisierungsverfahren (TCI) entwickelt. Die Applikation eines CTL Epitops zusammen mit dem synthetischen Toll-like Rezeptor 7 Liganden Imiquimod führt zur effizienten Aktivierung TCR-transgener CTLs. Eine in Wild-typ Mäusen generierte CTL-Antwort gegen das SIINFEKL Epitop aus dem Ovalbumin vermittelt die effiziente Lyse inokulierter Ovalbumin-transgener Thymomzellen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass regulatorische T-Zellen die durch TCI vermittelte CTL Aktivierung inhibieren.

Entwicklung molekularbiologischer Methoden zum Nachweis verschiedener Sclerotiniaceae

Botrytis cinerea ist einer der wichtigsten Phytopathogene, der im Bereich der Weinbereitung als Erreger des Edel- bzw. des Grauschimmels von Trauben eine zentrale Stellung einnimmt. Taxonomisch gehört dieser Organismus zur Familie der Sclerotiniaceae, die ausnahmslos Phytopathogene sind und weltweit große Schäden bei verschiedenen Pflanzen verursachen. Die molekularbiologische Identifikation von Vertretern dieser wichtigen Gruppe von Pflanzenpathogenen ist jedoch bis heute ein Problem. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit als Themenschwerpunkt die zweifelsfreie Identifikation einiger Vertreter der Sclerotiniaceae bearbeitet. Hier konnte von neun verschiedenen Organismen die ‚Internal Transcribed Spacer Region’ identifiziert und zusätzlich zur 18S rDNA für eine sichere Identifikation ausgeschlossen werden. Die Unterscheidung der einzelnen Gattungen und verschiedener B. cinerea-Stämme wurde mit Hilfe der neuartigen nSAPD-PCR Technologie erfolgreich überprüft. Hier konnten die drei Gattungen Botrytis, Monilinia sowie Sclerotinia zweifelsfrei differenziert werden. Ferner konnten von Monilinia fructigena, Sclerotinia minor und Sclerotinia sclerotiorum neue Laccase-Gene identifiziert und komplett sequenziert werden, die homolog zur Laccase2 (lcc2) von B. cinerea sind. Auf Basis dieser Sequenzen bzw. Sequenzunterschiede konnte eine Multiplex-PCR zur zweifelsfreien Identifi-kation dieser Spezies etabliert werden. Im Folgenden konnte dieses System auch an Umweltproben aus der Umgebung von Mainz und Wiesbaden, aus Flomborn (Rheinhessen) sowie aus Stollberg (Sachsen) überprüft werden. Anhand dieser Proben konnte gleichzeitig ein konstantes Vorkommen dieses Gens in allen über-prüften Organismen gezeigt werden. Somit ist es zum ersten Mal möglich, ver-schiedene Spezies der Sclerotiniaceae in einer Probe simultan nachzuweisen und zu differenzieren. Anschließend wurde die Laccase-Expression der jeweiligen Sclerotiniaceae überprüft. Für M. fructigena konnte mindestens eine konstitutiv exprimierte Laccase im Kulturüberstand detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten weder S. minor noch S. sclerotiorum eine derartige Aktivität. Da B. cinerea lcc2 expri-miert, wurde dies auch für M. fructigena angenommen. Die reverse Transkription der codierenden mRNA konnte jedoch nicht erfolgreich durchgeführt werden. Die Analyse des Genoms von B. cinerea und S. sclerotiorum zeigte zudem 13 bzw. 8 mögliche Laccase-Gene. Somit ist es wahrscheinlich, dass M. fructigena mehr als einen codierenden Bereich für ein derartiges Enzym besitzt und somit eine oder mehrere andere Laccasen exprimiert. Auf Basis der codierenden DNA-Sequenzen konnten EDV-gestützte Prote-incharakterisierungen mit allen neu entdeckten Laccase-Sequenzen durchgeführt werden. Die hier ermittelten Eigenschaften legen den Schluss nahe, dass es sich ausnahmslos um Proteine handelt, die extrazellulär lokalisiert sind. So besitzen alle drei eine identisch lange Signalsequenz, die für die Translokation in die extra-zelluläre Matrix nötig ist. Des Weiteren zeigen alle Laccasen eine schwache Hydrophobizität, so dass davon ausgegangen werden kann, dass diese Enzyme keine membranständigen Proteine sind. Auch konnten zahlreiche Glykosylie-rungspositionen ermittelt werden und bei M. fructigena die Glykosylierung der akti-ven Laccase nachgewiesen werden. Des Weiteren konnten alle konservierten Kupferbindepositionen ermittelt werden. Der Vergleich zur mRNA der Lcc2 von B. cinerea offenbarte die lcc2 von M. fructigena drei nicht-codierende Intronse-quenzen, für S. minor und S. sclerotiorum jedoch lediglich die ersten beiden. Somit bleibt für alle neu identifizierten Sequenzen die Frage nach der Expression offen. Es wurden weder Deletionen von Nukleotiden noch frame-shift Mutationen in den einzelnen Genen gefunden. Auch geben die Signalsequenzen bzw. die ent-haltenen Kupferbindepositionen keine Aufschluss über das Ausbleiben der Ex-pression dieser Gene. Da das von B. cinerea synthetisierte ß-1,3-1,6-Glucan in der Kellerwirtschaft große Filtrationsprobleme verursacht, wurde als ein zusätzlicher Themenschwerpunkt die Lyse dieses Polymers mit symbiontischen Mikroorganismen aus Termitendär-men untersucht. Da Termiten auf den Abbau von Polymeren, wie Cellulose und Hemicellulosen spezialisiert sind, lag die Vermutung nahe, dass auch das ß-Glucan von symbiontischen Mikroorganismen hydrolysiert werden kann. In der hier vorliegenden Arbeit konnte zwar das ß-Glucan erfolgreich herge-stellt und in pulverisierter Form 5 verschiedenen Termitenspezies als Futter ange-boten werden, die anschließende Isolierung der Darmflora und die Untersuchung der isolierten Mikroorganismen auf ein mögliche glucanolytische Aktivität erbrach-te jedoch nicht den erhofften Erfolg. Hier wurden acht verschiedene filamentöse Ascomyceten bzw. Zygomyceten isoliert, eine lytische Aktivität konnte jedoch bei keiner dieser Spezies gezeigt werden.

Entwicklung von molekularen Sonden für die sichere Identifizierung von Hefen der Gattungen Brettanomyces, Dekkera

Hefen der Gattungen Brettanomyces/Dekkera sind in der Produktion von fermentierten Getränken, insbesondere in der Bier-, Sekt- und Weinherstellung bekannt. Sie können als Schädlingshefen insbesondere durch die Bildung von charakteristischen Sekundärmetaboliten zu einer negativen geschmacklichen Veränderung des Getränks führen. Aufgrund ihres langsamen Wachstums werden diese Hefen bei Routineanalysen mit konventionellen Kultivierungsmethoden leicht übersehen. Ein schneller und eindeutiger Nachweis von Brettanomyces/Dekkera-Hefen ist bis heute problematisch. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur sicheren Detektion und Identifizierung aller fünf bekannten Spezies dieser Gattungen entwickelt. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit Cy3-markierten DNA-Sonden ermöglichte einen direkten mikroskopischen Nachweis dieser Mikroorganismen in der Untersuchungsprobe. Im Hinblick auf die Generierung Art-spezifischer Sonden wurden die ribosomalen Gen-Cluster der verschiedenen Spezies hinsichtlich potentieller Zielregionen analysiert. Eine signifikante Steigerung des Sonden-vermittelten Fluoreszenz-Signals konnte durch die Anwendung eines neuen Sonden-Konzepts (Gemeinschafts-Sonden) auf hochvariable Bereichen der 26S rRNAs, unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstrukturen, realisiert werden. Die Untersuchung der regionalen Verbreitung dieser Hefen in der Weinbauregion Rheinhessen ergab, dass bei 15 % der untersuchten Winzerbetriebe D. bruxellensis in Rotweinproben vorhanden war. Insgesamt konnten bei den Probenuntersuchungen aus 299 Weinen 44 D. bruxellensis-Stämme isoliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden darüber hinaus verschiedene Vitalitätsfärbungen hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit auf Brettanomyces/Dekkera evaluiert und eine Differenzierung dieser Hefen durch einen physiologischen Mikrotiterplatten-Test (Biolog, USA) überprüft.

Konditionale Mutagenese von Desmoglein 2 in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte interzelluläre Verbindungen, die Zellverbänden eine mechanische Stabilität verleihen. Die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen werden mit Hilfe der desmosomalen Cadherine vom Desmoglein- und Desmocollin-Typ miteinander verknüpft. Diese Glykoproteine interagieren miteinander im Interzellularspalt zwischen benachbarten Zellen und stellen mit ihren zytoplasmatischen Domänen einen Ankerpunkt für desmosomale Brückenproteine dar, an welche wiederum die Proteine des Intermediärfilament-Zytoskeletts binden. Bei der Maus spielt das desmosomale Cadherin Desmoglein 2 (DSG2) bereits in frühen Stadien der Embryogenese eine entscheidende Rolle. Homozygote DSG2-Knockout-Mäuse sterben bereits vor der Implantation des Embryos ab. Im adulten Tier ist Dsg2 die am weitesten verbreitete Isoform, in Darm, Leber und Herzmuskel wird es zudem exklusiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Dsg2 in differenzierten Gewebeverbänden adulter Tiere zu untersuchen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehrere transgene Mauslinien hergestellt, in denen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems eine Deletion im DSG2-Gen konditional und gewebsspezifisch induziert werden konnte. Dazu wurden zuerst zwei loxP-Sequenzen und eine mit zwei FRT-Stellen flankierte Neomyzinresistenzgen-Kassette in das DSG2-Gen von embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination eines Targeting-Konstrukts inseriert. Diese Zellen wurden in Blastozysten injiziert und Mauslinien hergestellt. Mit Hilfe der Flpe-Rekombinase wurde anschließend die Resistenzenzgen-Kassette entfernt. Diese Stämme wurden mit Mäusen verpaart, die eine induzierbare und gewebsspezifische Synthese der Cre-Rekombinase ermöglichen. Im Darmepithel und der Leber konnte eine gewebsspezifische Rekombination des DSG2-Gens induziert werden. Untersuchungen der DSG2-mRNA zeigten, dass die DSG2-Rekombination in der Darmschleimhaut nahezu vollständig erfolgte. Immunfluoreszenz-Analysen an Gewebsfragmenten induzierter Tiere mit Isotyp-spezifischen Antikörpern, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden waren, zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Desmosomenzahl und -verteilung. Daher wurden eGFP-Hybride des zu erwartenden mutierten Dsg2-Proteins in Zellen exprimiert und mit wildtypischem Dsg2 verglichen. Es konnte hinsichtlich der Verteilung und Morphologie der Desmosomen keine Unterschiede zwischen beiden Dsg2-Proteinen festgestellt werden. Der Dsg2-Mutante fehlen wichtige Proteinbereiche, die für die trans-Interaktion der extrazellulären Domäne verantwortlich sind, die Haupt-N-Glykosylierungsstelle, sowie eine der insgesamt vier Kalzium-Bindestellen. Dies sind Eigenschaften, von denen man bisher annahm, dass sie eine zentrale Bedeutung für die desmosomale Adhäsion besitzen. Weitere Experimente werden zeigen, inwieweit die hergestellte Dsg2-Mutante in „Stresssituationen“, wie sie z.B. bei Regenerationsvorgängen oder der Tumorgenese auftreten, zu veränderten adhäsiven Eigenschaften führt.

Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Art- und Stamm-Identifizierung pro- und eukaryotischer Organismen

Das Wachstum von Milchsäurebakterien-Arten der Gattungen Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc während der Weinfermentation kann durch die Bildung verschiedener Stoffwechselprodukte zu Weinfehlern führen. Um rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können und einem Weinverderb vorzubeugen, bedarf es geeigneter Identifizierungsmethoden. Klassische mikrobiologische Methoden reichen oft nicht aus, um Mikroorganismen auf Art- und Stammniveau gezielt zu identifizieren. Wegen ihrer schnellen Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit sind molekularbiologische Identifizierungsmethoden zur Kontrolle der mikrobiellen Flora während der Lebensmittelfermentierung in der heutigen Zeit unabdingbar. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden die 23S rRNA-Gensequenzen von neun Pediococcus-Typstämmen sequenziert, analysiert und phylogenetische Analysen durchgeführt. Zur Art-Identifizierung der Pediokokken wurden PCR-Primer generiert und ein Multiplex PCR System entwickelt, mit dem alle typischen Arten simultan in einer Reaktion nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse der Multiplex PCR-Identifizierung von 62 Pediococcus-Stämmen aus Kulturensammlungen und 47 neu isolierten Stämmen aus Wein zeigten, dass einige Stämme unter falschen Artnamen hinterlegt waren, und dass P. parvulus im Weinanbaugebiet Rheinhessen weit verbreitet war. Die Fähigkeit der Pediococcus-Stämme zur Exopolysaccharid-Synthese wurde durch den Nachweis zweier Gene überprüft. Auf Basis der 23S rDNA-Sequenzen wurden rRNA-Sekundärstrukturen mit der neu entwickelten Software Structure Star generiert, die zum Auffinden von Zielbereichen für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden geeignet waren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Pediococcus-Arten reichten aus, um zwei Gruppen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung differenzieren zu können. Die Verwendung unmarkierter Helfer-sonden verbesserte die Zugänglichkeit der Sonden an die rRNA, wodurch das Fluoreszenz-Signal verstärkt wurde. Um Milchsäurebakterien durch Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese differenzieren zu können, wurden Primer entwickelt, mit denen ein hochvariabler 23S rDNA-Bereich amplifiziert werden konnte. Die Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR wurde in der vorliegenden Arbeit zur Art- und Stamm-Differenzierung pro- und eukaryotischer Organismen angewandt. Es wurden vor allem weinrelevante Milchsäurebakterien der Gattungen Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc und Hefen der Gattungen Dekkera / Brettanomyces und Saccharomyces untersucht. Die Cluster-Analyse der Pediococcus-Typstämme führte zu einer unterschiedlichen Baum-Topologie im Vergleich zum phylogenetischen 23S rDNA-Stammbaum. Die Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten O. oeni-Stämme aus Starterkulturen konnten in Bezug auf eine frühere Cluster-Analyse reproduziert werden. Die Untersuchung von 40 B. bruxellensis-Stämmen aus rheinhessischen Weinproben zeigte eine Gruppierung der Stämme gemäß dem Ort der Probennahme. Beim Vergleich der Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Arten P. parvulus und B. bruxellensis, die aus denselben Weinproben isoliert wurden, konnte eine hohe Übereinstimmung der beiden Baum-Topologien beobachtet werden. Anhand der SAPD-PCR Untersuchung von Sekthefen aus Starterkulturen konnten alle Stämme der Art S. cerevisiae zugeordnet werden. Die nSAPD-PCR war darüber hinaus geeignet, um höhere Eukaryoten wie Weinreben zu differenzieren und es konnten die Verwandtschaftsverhältnisse von Mäusen und menschlichen Individuen durch Cluster-Analysen nachvollzogen werden. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik wurden (n)SAPD-Marker in SCAR-Marker konvertiert. Die neu generierten SCAR-Primer konnten zur simultanen Art-Identifizierung von sieben weinschädlichen Milchsäurebakterien in einer Multiplex PCR erfolgreich eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten molekularbiologischen Identifizierungsmethoden können zum Beispiel in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle Anwendung finden.

Isolierung und Identifizierung von wachstumsfördernden Substanzen für das weinrelevante Bakterium Oenococcus oeni aus Fruchtsäften und Blattextrakten

Neben Tomatensaft wurde eine Vielzahl von Säften und Blattextrakten als Medienzusätze auf Wachstumsförderung bei 30 verschiedenen Oenococcus oeni-Stämmen getestet. Es zeigte sich eine breite Wachstumsförderung bei allen Zusätzen mit Ausnahme von Zitronensaft, sodass die Wachstumsfaktoren keine tomatenspezifischen Inhaltsstoffe sein können und eher ubiquitär in der Pflanzenwelt vorkommen. Das Ausmaß der Wachstumsförderung war stammabhängig sehr unterschiedlich und Tomatensaft stellte keineswegs für alle Stämme den optimalen Medienzusatz dar. Durch Schälen der Früchte war eine für die Analytik hilfreiche Abtrennung schalenspezifischer Inhaltsstoffe möglich, wobei auch die Schalenextrakte großes Potential für die Suche nach Wachstumsfaktoren offenbarten und die Wichtigkeit einer Auftrennung der Frucht in die verschiedenen Fruchtbereiche betonte. Aus Tomatensaft konnte analytisch der anorganische Wachstumsfaktor Mangan identifiziert werden. Die größten Zelldichten der Oenokokken-Stämme wurden hierbei bei 67 µM und 34 mM Manganzusatz erreicht. Bei 13 von 20 getesteten Oenokokkenstämmen konnte bei Zusatz von 34 mM Mangan der Tomatensaft ersetzt werden, bei 4 Stämmen (z. B. Stamm B2) fehlten jedoch noch weitere Wachstumsfaktoren und bei 3 Stämmen (z. B. Stamm B120) kam es zu einem verfrühten Absterben. Da weitere Mineralstoffe sowie veraschte Säfte und Blattextrakte keinen positiven Einfluß auf die Oenokokken-Zelldichte hatten, wurde mittels semipräparativer HPLC nach zusätzlichen organischen Wachstumsfaktoren für den Stamm B2 gesucht. Hierzu wurde der nachfolgende Wachstums-Assay miniaturisiert und erfolgreich auf Microtiterplatten etabliert. Es gelang die Isolierung und Identifizierung eines wachstumsfördernden Trisaccharides aus Mangoschalen-Extrakt, das aus den Zuckern Glucose, Rhamnose und Arabinose bestand. Von den monomeren Zuckern erhöhte lediglich die Arabinose die Zelldichte, das Optimum lag bei 1,5 g/l. Auch aus Zitronenmesokarp-Extrakt war die Isolierung eines wachstumsfördernden arabinosehaltigen Disaccharides möglich, die Menge reichte jedoch noch nicht für eine genaue Identifizierung aus. Desweiteren erwies sich 1,5 g/l Cystein als wachstumsstimulierend. Ein Zusatz aller gefundenen Wachstumsfaktoren (34 mM Mangan, 1,5 g/l Arabinose und 1,5 g/l Cystein) ersetzte den Tomatensaft bei weiteren Oenokokken-Stämmen (z.B. Stamm B120) komplett, wobei bei allen Stämmen sogar eine schnellere Anzucht erfolgte. Neben dem Tomatensaft war auch der Zusatz von Hefeextrakt zum Grundmedium nicht mehr nötig, sodass ein neues vereinfachtes Medium für die Anzucht von Oenokokken mit komplexen Nährstoffansprüchen vorgeschlagen werden konnte. Lediglich beim Stamm B2 zeigte sich noch ein OD-Unterschied von 0,2 in der stationären Phase, der nach Adsorptionsversuchen an Polyvinylpolypyrrolidon auf noch unidentifizierte Polyphenole im Tomatensaft zurückzuführen ist. Aus grünem Tee erwies sich das Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG) konzentrationsabhängig sowohl als Hemmstoff (>550 mg/l EGCG) als auch Wachstumsfaktor (400-500 mg/l EGCG) für den Oenokokken-Stamm B2. Der hemmende als auch der fördernde Einfluss auf das Wachstum wurde mittels Sytox/DAPI-Färbung bestätigt. Der sogenannte „Tomatensaft-Faktor“ ist also nicht eine spezielle Substanz, sondern das synergistische Zusammenwirken mehrerer einfacher Substanzen wie Mineralstoffe, Aminosäuren, Kohlenhydrate und Polyphenole. Auch sind die Oenokokken-Stämme bezüglich ihres Nährstoffbedarfes sehr unterschiedlich, sodass für jeden Stamm einzeln das optimale Substratspektrum ermittelt werden muss.

Oligomerisation, localisation and interaction of the sensor histidine kinases DcuS and CitA in Escherichia coli

The two-component system DcuSR of Escherichia coli regulates gene expression of anaerobic fumarate respiration and aerobic C4-dicarboxylate uptake. C4-dicarboxylates and citrate are perceived by the periplasmic domain of the membrane-integral sensor histidine kinase DcuS. The signal is transduced across the membrane by phosphorylation of DcuS and of the response regulator DcuR, resulting in activation of DcuR and transcription of the target genes.rnIn this work, the oligomerisation of full-length DcuS was studied in vivo and in vitro. DcuS was genetically fused to derivatives of the green fluorescent protein (GFP), enabling fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements to detect protein-protein interactions in vivo. FRET measurements were also performed with purified His6-DcuS after labelling with fluorescent dyes and reconstitution into liposomes to study oligomerisation of DcuS in vitro. In vitro and in vivo fluorescence resonance energy transfer showed the presence of oligomeric DcuS in the membrane, which was independent of the presence of effector. Chemical crosslinking experiments allowed clear-cut evaluation of the oligomeric state of DcuS. The results showed that detergent-solubilised His6-DcuS was mainly monomeric and demonstrated the presence of tetrameric DcuS in proteoliposomes and in bacterial membranes.rnThe sensor histidine kinase CitA is part of the two-component system CitAB of E. coli, which is structurally related to DcuSR. CitAB regulates gene expression of citrate fermentation in response to external citrate. The sensor kinases DcuS and CitA were fused with an enhanced variant of the yellow fluorescent protein (YFP) and expressed in E. coli under the control of an arabinose-inducible promoter. The subcellular localisation of DcuS-YFP and CitA-YFP within the cell membrane was studied by means of confocal laser fluorescence microscopy. Both fusion proteins were found to accumulate at the cell poles. The polar accumulation was slightly increased in the presence of the stimulus fumarate or citrate, respectively, but independent of the expression level of the fusion proteins. Cell fractionation demonstrated that polar accumulation was not related to inclusion bodies formation. The degree of polar localisation of DcuS-YFP was similar to that of the well-characterised methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), but independent of their presence. To enable further investigations on the function of the polar localisation of DcuS under physiological conditions, the sensor kinase was genetically fused to the flavin-based fluorescent protein Bs2 which shows fluorescence under aerobic and anaerobic conditions. The resulting dcuS-bs2 gene fusion was inserted into the chromosome of various E. coli strains.rnFurthermore, a protein-protein interaction between the related sensor histidine kinases DcuS and CitA, regulating common metabolic pathways, was detected via expression studies under anaerobic conditions in the presence of citrate and by in vivo FRET measurements.

Transkutane Immunisierung - Mechanismen und Optimierungsstrategien

In dieser Arbeit wurde ein etabliertes Immunisierungsmodell auf der Basis eines synthetischen TLR 7-Liganden zur Aufhebung der suppressiven Eigenschaften von UV B-Strahlung verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass nach Ermittlung eines geeigneten Immunisierungsprotokolls mit UV B die durch TCI vermittelte ausschließlich primäre Immunantwort verstärkt werden konnte, so dass eine Gedächtnisantwort induziert werden konnte. Durch die Immunisierung verschiedenster knockout sowie transgener Stämme konnte bewiesen werden, dass die Reaktion auch nach zusätzlicher UV B-Bestrahlung abhängig von TLR 7 und dem Adaptormolekül MyD88 ist. Bei der Aufklärung der zellulären Mechanismen, die dieser Immunisierungsmethode zu Grunde liegen, konnten dermale DCs, sowie GR1+-Zellen als wichtige Mediatoren identifiziert werden. Eine wesentliche Funktion von epidermalen Langerhans Zellen konnte in diesem Zusammenhang ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auf Zytokinebene Typ I Interferone eine tragende Rolle spielen und die Produktion von IL-12p35 in den Haut-drainierenden Lymphknoten angeregt wird. Supprimiert wird die Immunantwort durch regulatorische T-Zellen, sowie durch die Freisetzung von IL-10, welches nicht ausschließlich von regulatorischen T-Zellen produziert wird. Die Applikation eines blockierenden IL-10-Rezeptor Antikörpers verhinderte die IL-10-vermittelte Suppression und führte zu einer weiteren Verstärkung der Immunantwort. Durch die induzierte Gedächtnisantwort nach UV B/TCI konnte das Immunisierungs-Modell in einem therapeutischen Tumormodell angewandt werden und führt hier zu einer verstärkten Abstoßung von Tumoren, verglichen mit TCI alleine, was die Basis für zukünftige nadelfreie Vakzinierungen für die Behandlung von Krebs oder persistierender Infektionen darstellen könnte.

Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn

Untersuchungen zur Funktion multipler DnaJ-Proteine in dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Sowohl in Synechocystis sp. PCC 6803 als auch in anderen Cyanobakterien konnten multiple DnaJ-Proteine nachgewiesen werden, deren Funktion jedoch noch weitestgehend unverstanden ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen der multiplen DnaJ-Proteine von Synechocystis sp. charakterisiert. Das DnaJ-Protein, Sll0897 gehört aufgrund seiner Domänenstruktur zu den Typ I-Proteinen, Slr0093 und Sll1933 zu den Typ II-Proteinen und Sll0909, Sll1011, Sll1384 und Sll1666 zu den Typ III DnaJ-Proteinen. Durch Komplementationsstudien des E. coli ΔdnaJ-Stammes OD259 konnte eine Komplementation des Wachstumsdefekts bei höheren Temperaturen durch die Proteine Slr0093 und Sll0897 gezeigt werden. In Synechocystis war eine komplette Disruption von sll1933 nicht möglich, weshalb das Protein Sll1933 unter normalen Wachstumsbedingungen essentiell ist. Doppelte Insertionmutationen waren lediglich bei der Kombination der Gene sll0909 und sll1384 möglich. Untersuchungen des Wachstumsverhaltens der dnaJ-Disruptions-stämme unter Hitze- und Kältestressbedingungen zeigten, dass das Protein Sll0897 eine wichtige Funktion bei der Stressantwort in Synechocystis besitzt und unter Hitzestressbedingungen essentiell ist. Eine vollständige Deletion des Gens sll0897 war Synechocystis sp. bereits unter normalen Wachstumsbedingungen nicht möglich. Bei den für ein Wachstum mindestens notwendigen Domänen des Sll0897 handelt es sich um die charakteristische J-Domäne und die Glycin-Phenylalanin-reiche Domäne. Unter Hitzestressbedingungen ist das Volllängen-Protein Sll0897 für ein Wachstum essentiell. rnNeben den in vivo Wachstumsexperimenten wurde eine Methode zur heterologen Expression der sieben DnaJ-Proteine in E. coli und einer nativen Reinigung von Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 etabliert. Untersuchungen zur Thermostabilität der gereinigten Proteine zeigten für das Slr0093 und Sll1666 einen reversiblen Prozess, wodurch sie auch nach dem Hitzestress noch als Faltungshelfer fungieren können. Bei den Proteinen Sll0897 und Sll0909 ist der Prozess jedoch nicht reversibel, so dass sie nach Hitzestresseinwirkung neu synthetisiert oder durch Chaperoneinwirkung korrekt gefaltet werden müssen. Die Affinitäts-„Pull-Down“ Analysen lieferten keine klaren Hinweise auf die DnaK-Interaktionspartner der Proteine Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666, weshalb weitere Untersuchungen notwendig sind. Mit Hilfe der Gelfiltrationsanalysen konnten die errechneten molaren Massen der Proteine Slr0093 und Sll1666 bestätigt und beide Proteine in einer monomeren Form nachgewiesen werden. Die DnaJ-Proteine Sll0897 und Sll0909 konnten in zwei oligomeren Zuständen detektiert werden. Analysen der ATPase-Aktivität des DnaK2-Proteins alleine und des DnaK2-Proteins zusammen mit den DnaJ-Proteinen Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 zeigten eine Steigerung der ATP-Hydrolyserate bei der Interaktion von DnaK und DnaJ, wobei Sll0897 die größte Steigerung der ATPase-Aktivität des DnaK2 induzierte.