Untersuchungen zur Funktion multipler DnaJ-Proteine in dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Sowohl in Synechocystis sp. PCC 6803 als auch in anderen Cyanobakterien konnten multiple DnaJ-Proteine nachgewiesen werden, deren Funktion jedoch noch weitestgehend unverstanden ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen der multiplen DnaJ-Proteine von Synechocystis sp. charakterisiert. Das DnaJ-Protein, Sll0897 gehört aufgrund seiner Domänenstruktur zu den Typ I-Proteinen, Slr0093 und Sll1933 zu den Typ II-Proteinen und Sll0909, Sll1011, Sll1384 und Sll1666 zu den Typ III DnaJ-Proteinen. Durch Komplementationsstudien des E. coli ΔdnaJ-Stammes OD259 konnte eine Komplementation des Wachstumsdefekts bei höheren Temperaturen durch die Proteine Slr0093 und Sll0897 gezeigt werden. In Synechocystis war eine komplette Disruption von sll1933 nicht möglich, weshalb das Protein Sll1933 unter normalen Wachstumsbedingungen essentiell ist. Doppelte Insertionmutationen waren lediglich bei der Kombination der Gene sll0909 und sll1384 möglich. Untersuchungen des Wachstumsverhaltens der dnaJ-Disruptions-stämme unter Hitze- und Kältestressbedingungen zeigten, dass das Protein Sll0897 eine wichtige Funktion bei der Stressantwort in Synechocystis besitzt und unter Hitzestressbedingungen essentiell ist. Eine vollständige Deletion des Gens sll0897 war Synechocystis sp. bereits unter normalen Wachstumsbedingungen nicht möglich. Bei den für ein Wachstum mindestens notwendigen Domänen des Sll0897 handelt es sich um die charakteristische J-Domäne und die Glycin-Phenylalanin-reiche Domäne. Unter Hitzestressbedingungen ist das Volllängen-Protein Sll0897 für ein Wachstum essentiell. rnNeben den in vivo Wachstumsexperimenten wurde eine Methode zur heterologen Expression der sieben DnaJ-Proteine in E. coli und einer nativen Reinigung von Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 etabliert. Untersuchungen zur Thermostabilität der gereinigten Proteine zeigten für das Slr0093 und Sll1666 einen reversiblen Prozess, wodurch sie auch nach dem Hitzestress noch als Faltungshelfer fungieren können. Bei den Proteinen Sll0897 und Sll0909 ist der Prozess jedoch nicht reversibel, so dass sie nach Hitzestresseinwirkung neu synthetisiert oder durch Chaperoneinwirkung korrekt gefaltet werden müssen. Die Affinitäts-„Pull-Down“ Analysen lieferten keine klaren Hinweise auf die DnaK-Interaktionspartner der Proteine Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666, weshalb weitere Untersuchungen notwendig sind. Mit Hilfe der Gelfiltrationsanalysen konnten die errechneten molaren Massen der Proteine Slr0093 und Sll1666 bestätigt und beide Proteine in einer monomeren Form nachgewiesen werden. Die DnaJ-Proteine Sll0897 und Sll0909 konnten in zwei oligomeren Zuständen detektiert werden. Analysen der ATPase-Aktivität des DnaK2-Proteins alleine und des DnaK2-Proteins zusammen mit den DnaJ-Proteinen Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 zeigten eine Steigerung der ATP-Hydrolyserate bei der Interaktion von DnaK und DnaJ, wobei Sll0897 die größte Steigerung der ATPase-Aktivität des DnaK2 induzierte.

Within Synechocystis sp. PCC6803 as well as in other cyanobacteria multiple DnaJ proteins were identified, but most of their functions have not been understood yet. Within this study the functions of the multiple DnaJ proteins of Synechocystis sp. were characterized. Based on the domain structure the DnaJ protein Sll0897 can be classified as a type I protein. Slr0093 and Sll1933 are type II proteins and Sll0909, Sll1011, Sll1384 and Sll1666 represent type III DnaJ proteins. Only expression of the dnaJ genes slr0093 and sll0897 complemented the growth defect of the E. coli deletion strain OD259 at elevated temperatures. In Synechocystis a complete disruption of sll1933 was not possible; therefore the Sll1933 protein is essential under normal growth conditions. Only the two Synechocystis dnaJ genes sll0909 and sll1384 could be disrupted in combination. Investigations of the growth behavior of the dnaJ disruption strains under heat- and cold-stress conditions have shown that the Sll0897 protein fulfills a major role in the stress response of Synechocystis and that this protein is essential under heat-stress conditions. Already under normal growth conditions a complete deletion of the sll0897 gene was not possible in Synechocystis. It could be shown that the characteristic J-domain and the glycine-phenylalanine-rich region are sufficient for cell survival at normal growth temperatures but under heat-stress conditions the full length protein Sll0897 is essential. rnIn addition to the in vivo growth experiments a method for heterologous expression of the seven DnaJ proteins in E. coli and a native purification of Slr0093, Sll0897, Sll0909 and Sll1666 were established. Investigations of the thermo stability of the purified proteins Slr0093 and Sll1666 had shown a reversible denaturation process, enabling them to function as a chaperone after heat-stress. In contrast this process is not reversible for the proteins Sll0897 and Sll0909. Therefore they have to be newly synthesized after heat-stress conditions or correctly be folded by chaperones. Affinity pull-down experiments did not show a clear evidence of DnaK interaction partners for the proteins Slr0093, Sll0897, Sll0909 and Sll1666, making further investigations necessary. Gel filtration analyses could confirm the calculated molar masses of the Slr0093 and Sll1666 proteins and a monomeric state could be proven for both proteins. The proteins Sll0897 and Sll0909 were detected in two oligomeric states. Analyses of the ATPase activity of the DnaK2 protein alone and in combination with the DnaJ proteins Slr0093, Sll0897, Sll0909 and Sll1666 has shown an increase of the ATP hydrolyses by interaction of DnaK and DnaJ. The major increase of the ATPase activity of DnaK2 was induced by the Sll0897 protein.