DNA damage induced by acrylamide: roe of genetic polymorphisms in DNA damage levels

RESUMO:Em 1994 a acrilamida (AA) foi classificada pela IARC como um provável cancerígeno para o homem. Para além da utilização de AA em numerosas aplicações industriais, a AA está também presente numa grande variedade de alimentos ricos em amido e processados a temperaturas elevadas. Esta exposição através da ingestão de produtos alimentares despoletou elevadas preocupações ao nível do risco para a saúde pública e poderá implicar um risco adicional para o aparecimento de cancro. A glicidamida (GA), o metabolito epóxido formado a partir da oxidação da AA provavelmente através do citocromo P450 2E1, é considerada por vários estudos, o principal responsável pela carcinogenicidade da AA. Actualmente existe uma escassez de resultados relativamente aos mecanismos de genotoxicidade da AA e GA em células de mamífero. Por este motivo, o objectivo deste estudo centra-se na avaliação das consequências genéticas da exposição à AA e GA, recorrendo-se para tal ao uso de células de mamífero como modelo. Tendo como base este objectivo avaliou-se a citotoxicidade da AA e GA, através do ensaio do MTT, e realizaram-se dois testes citogenéticos, o teste das aberrações cromossómicas (CAs) e o teste da troca de cromátides irmãs (SCEs), de modo a avaliar as lesões de DNA induzidas por estes compostos em células de hamster Chinês V79. Os resultados globalmente mostraram que a GA é mais citotóxica e clastogénica do que a AA. No âmbito deste trabalho, foi também efectuada a quantificação de aductos específicos de DNA, nomeadamente N7-(2-carbamoil-2-hidroxietil)guanina (N7-GA-Gua) e N3-(2-carbamoil-2-hidroxietil)adenina (N3-GA-Ade). Os resultados obtidos permitem afirmar que os níveis de N7-GA-Gua e a concentração de GA apresentam uma relação linear dose-resposta. Foi também identificada uma óptima correlação entre os níveis de N7-GA-Gua e a frequência de troca de cromátides irmãs. Adicionalmente, e de forma a compreender os mecanismos de toxicidade da AA, estudaram-se os mecanismos dependentes da modulação do glutationo reduzido (GSH), nomeadamente da butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da síntese de GSH, do GSH-monoetil estér (GSH-EE), um composto permeável nas células e que é intra-celularmente hidrolisado a GSH e ainda do GSH adicionado exogenamente ao meio de cultura, em células V79. Os resultados obtidos reforçaram o papel da modulação do GSH nos efeitos de citotoxicidade e clastogenicidade da AA. Para além dos estudos efetuados com células V79, procedeu-se também à determinação da frequência de SCEs, à quantificação de aductos específicos de DNA, bem como ao ensaio do cometa alcalino em amostras de dadores saudáveis expostos à AA e GA. Tanto os resultados obtidos através do ensaio das SCE, como pela quantificação de aductos específicos de DNA, ambos efectuados em linfócitos estimulados, originaram resultados comparáveis aos obtidos anteriormente para as células V79, reforçando a ideia de que a GA é bastante mais genotóxica do que a AA. Por outro lado, os resultados obtidos pelo ensaio do cometa para exposição à AA e GA mostraram que apenas esta última aumenta o nível das lesões de DNA. Outro objectivo deste trabalho, foi a identificação de possíveis associações existentes entre as lesões de DNA, quantificadas através do ensaio das SCEs e do cometa, e biomarcadores de susceptibilidade, tendo em conta os polimorfismos genéticos individuais envolvidos na destoxificação e nas vias de reparação do DNA (BER, NER, HRR e NHEJ) em linfócitos expostos à GA. Tal permitiu identificar associações entre os níveis de lesão de DNA determinados através do ensaio das SCEs, e os polimorfismos genéticos estudados, apontando para uma possível associação entre o GSTP1 (Ile105Val) e GSTA2 (Glu210Ala) e a frequência de SCEs. Por outro lado, os resultados obtidos através do ensaio do cometa sugerem uma associação entre as lesões de DNA e polimorfismos da via BER (MUTYH Gln335His e XRCC1 Gln39Arg) e da via NER (XPC Ala499val e Lys939Gln), considerando os genes isoladamente ou combinados. Estes estudos contribuem para um melhor entendimento da genotoxicidade e carcinogenicidade da AA e GA em células de mamífero, bem como da variabilidade da susceptibilidade individual na destoxificação e reparação de lesões de DNA provocadas pela exposição a estes xenobióticos alimentares. ----------- ABSTRACT:Acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen by IARC. Besides being used in numerous industrial applications, AA is also present in a variety of starchy cooked foods. This AA exposure scenario raised concerns about risk in human health and suggests that the oral consumption of AA is an additional risk factor for cancer. A considerable number of findings strongly suggest that the reactive metabolite glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by cytochrome P450 2E1, plays a central role in AA carcinogenesis. Until now there are a scarcity of results concerning the mechanisms of genotoxicity of AA and GA in mammalian cells. In view of that, the study described in this thesis aims to unveil the genetic consequences of AA and GA exposure using mammalian cells as a model system. With this aim we evaluated the cytotoxicity of AA and GA using the MTT assay and subsequently performed two cytogenetic end-points: chromosomal aberrations (CAs) and sister chromatid exchanges (SCEs), in order to evaluate DNA damage induced by these compounds in V79 Chinese hamster cell line. The results showed that GA was more cytotoxic and clastogenic than AA. Within the scope of this thesis the quantification of specific DNA adducts were also performed, namely N7-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine (N7-GA-Gua) and N3-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenine (N3-GA-Ade). Interestingly, the GA concentration and the levels of N7-GA-Gua presented a linear dose-response relationship. Further, a very good correlation between the levels of N7-GA-Gua and the extent of SCEs were observed. In order to understand the mechanisms of AA-induced toxicity, the modulation of reduced glutathione (GSH)-dependent mechanisms were studied, namely the evaluation of the effect of buthionine sulfoximine (BSO), an effective inhibitor of GSH synthesis, of GSH-monoethyl ester (GSH-EE), a cell permeable compound that is intracellularly hydrolysed to GSH and also of GSH endogenously added to culture medium,z in V79 cell line. The overall results reinforced the role of GSH in the modulation of the cytotoxic and clastogenic effects induced by AA.Complementary to the studies performed in V79 cells, SCEs, specific DNA-adducts and alkaline comet assay in lymphocytes from healthy donors exposed to AA and GA were also evaluated. Both, the frequency of SCE and the quantification of specific GA DNA adducts, produced comparable results with those obtained in V79 cell line, reinforcing the idea that GA is far more genotoxic than AA. Further, the DNA damaging potential of AA and GA in whole blood leukocytes evaluated by the alkaline comet assay, showed that GA, but not AA, increases DNA damage. Additionally, this study aimed to identify associations between DNA damage and biomarkers of susceptibility, concerning individual genetic polymorphisms involved in detoxification and DNA repair pathways (BER, NER, HRR and NHEJ) on the GA-induced genotoxicity assessed by the SCE assay and by the alkaline comet assay. The extent of DNA damage determined by the levels of SCEs induced by GA seems to be modulated by GSTP1 (Ile105Val) and GSTA2 (Glu210Ala) genotypes. Moreover, the results obtained from the comet assay suggested associations between DNA damage and polymorphisms of BER (MUTYH Gln335His and XRCC1 Gln399Arg) and NER (XPC Ala499Val and Lys939Gln) genes, either alone or in combination. The overall results from this study contribute to a better understanding of the genotoxicity and carcinogenicity of AA and GA in mammalian cells, as well as the knowledge about the variability in individual susceptibility involved in detoxification and repair of DNA damage due to these dietary xenobiotics.

Fibra alimentar: composição, métodos e implicações alimentares

A fibra alimentar é uma entidade complexa e um conceito ainda pouco claro para a maioria das pessoas. O termo foi primeiramente introduzido por Hisplay em 1953 e desde então a definição de fibra alimentar têm vindo a evoluir até aos dias de hoje. Atualmente é definida como um conjunto de substâncias que resiste à digestão, e cujo consumo surte efeitos benéficos na saúde humana. O presente trabalho dá a conhecer a história evolutiva da fibra alimentar, natureza dos seus constituintes, as metodologias desenvolvidas para a sua quantificação, as principais fontes de fibra alimentar e por fim os efeitos fisiológicos inerentes ao seu consumo, tais como os efeitos laxativos, atenuação dos níveis de colesterol e glicose, entre outros. O consumo de fibra alimentar contribui para o combate a doenças não comutáveis.

Desenvolvimento e optimização de um sensor de fibra óptica para determinação da concentração de oxigénio

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Instrumentação, Manutenção Industrial e Qualidade

Desenvolvimento de novos métodos analíticos para controle da qualidade de alimentos - análise de micotoxinas

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Bioorgânica

A rede GÉANT e as tendências de desenvolvimento das novas redes de comunicação em fibra óptica

Trabalho realizado sob orientação do Prof. António Brandão Moniz para a disciplina “Factores Sociais da Inovação” do Mestrado Engenharia Informática realizado na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (Portugal).

Desenvolvimento de processos inovadores para a reutilização da fibra acrílica

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Aplicação do desenho de experiências na optimização da quantificação de isocianatos livres em materiais em contacto com alimentos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Novas utilizações das potencialidades BIM – apoio à medição de trabalhos realizados e produção de modelos as-built fiáveis e ricos em informação para a fase de manutenção

Congresso Construção 2012 - 4º Congresso Nacional/18, 19 e 20 Dezembro

Comparação do desempenho de sensores de fibra óptica e de dispositivos tradicionais na monitorização de deformações em estruturas de betão

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Civil

Higiene das mãos dos manipuladores de alimentos dos estabelecimentos de restauração e bebidas do concelho de Alcobaça

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Análise e avaliação de riscos numa empresa da indústria transformadora - processo de fabrico de poliéster reforçado a fibra de vidro

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Redes de Nova Geração: Uma Proposta para Cadastro em Sistemas de Informação Geográfica de Redes Fixas de Telecomunicações em Fibra Óptica

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Gestão do Território variante de Sistemas de Informação Geográfica e Detecção Remota

Caracterização de argamassas de cal aérea e terra. A influência do traço e tipo de fibra natural

A crescente consciencialização das sociedades para a reabilitação de edifícios tem aumentado o interesse da comunidade científica por argamassas tradicionais baseadas em materiais mais susten-táveis e compatíveis com suportes antigos. Contrariamente ao cimento, de uso generalizado nas últi-mas décadas, as argamassas com base em cal aérea têm recuperado espaço na construção graças aos seus bons resultados, sobretudo quando aplicadas em edifícios antigos. A introdução de fibras naturais constitui uma tentativa para melhorar certas características das argamassas, aumentando a sua durabilidade, sem perder sustentabilidade. Contudo, a incorporação de terra e fibras naturais em argamassas de cal aérea não é actualmente uma prática generalizada, pelo que o seu estudo é im-prescindível para perceber a sua viabilidade. Neste contexto, esta dissertação avalia a influência da introdução de terra argilosa e de fibras natu-rais em argamassas de cal aérea. As argamassas estudadas são constituídas por cal aérea e areias siliciosas, partindo de traços volumétricos 1:2 e 1:3. Nas argamassas de traço mais forte é feita uma substituição de 25% do ligante (cal aérea) por terra, enquanto nas de traço mais fraco se substitui 10% de areia fina por terra. Realizaram-se ensaios de caracterização nas argamassas em estado fresco e em estado endurecido (28, 90 e 180 dias), sobre provetes condicionados em laboratório (prismáticos e sobre tijolo) e, aos 28 dias, sobre painéis de reboco aplicados num murete de taipa existente na Estação de Exposição Natural de Revestimentos do DEC da FCT-UNL. No estado fresco verificou-se que a introdução de fibras naturais nas argamassas aumenta o seu espalhamento, melhorando a trabalhabilidade. No estado endurecido, constatou-se que a inclusão dessas fibras tornou as argamassas mais porosas e, consequentemente, com melhor comportamento térmico e pior comportamento mecânico, pela redução de resistências. No comportamento face à água, a adição de lã de ovelha destacou-se como uma solução que melhora, consideravelmente, as condições de secagem. A generalidade das argamassas estudadas revela grande aptidão para apli-cação em reboco de edifícios antigos mas o teor de fibras deve ser limitado.

Identificação de oportunidades de melhoria no sistema de monitorização e controlo de qualidade de cor na fibra acrílica tinta

Este trabalho desenvolveu-se na empresa FISIPE no âmbito da melhoria da qualidade fibra tinta pelo processo de Gel-Dyeing (um dos processos mais importantes na empresa, representando um dos produtos mais vendidos) e incidiu em três vertentes centradas em, 1) Corantes; 2) Reprodução de cores; 3) Fibras. Em relação aos corantes foram efectuados dois estudos: a) O controlo da qualidade dos corantes ao nível do fornecimento, dado que a empresa depende de diversos fornecedores para a maioria dos corantes individuais. Concluiu-se que o mesmo corante para fornecedores diferentes não é comparável pois a amostra populacional não é a mesma. b) A estabilidade das soluções utilizadas para reprodução de cores estudando, em particular, os efeitos da luz, concentração, arejamento e do tempo de armazenamento tendo-se observado que, maioritariamente, as soluções podem ser armazenadas durante um período de 28 dias sem uma perda significativa de actividade. Na reprodução de cores estudaram-se duas das principais causas de insucessos de produção: a) O comportamento pouco reprodutível em laboratório do corante azul 147. Obtiveram-se, com a adição de electrólito, resultados satisfatórios, com o corante a possuir um rendimento próximo ao da fábrica. b) A degradação de certos corantes durante o processo de recozimento provoca que a mesma receita em laboratório e na fábrica origine cores diferentes. Assim, compararam-se os resultados colorimétricos entre 110 testes de laboratório e as respectivas produções e determinou-se que para uma maior concentração de corantes numa produção, o ajuste necessário realizar nos factores correctivos existentes é também menor. Por fim, no que respeita às fibras, desenvolveu-se um novo método de determinação do valor de saturação da fibra. Com base neste método, foi estudado um caso real numa fibra que apresentava anomalias de tingimento observando-se que a capacidade de tingimento era inferior (menor valor de saturação) à do padrão.

Implementação e validação do método de deteção de alergénios em alimentos por PCR em tempo real no Laboratório SGS

As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública a nível mundial, que ocorre em todas as faixas etárias, tendo maior incidência em crianças. Mediada pelo sistema imunitário, a alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre devido à presença de alergénios alimentares, que são identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar que ocorram reações alérgicas em indivíduos sensíveis, sendo a rotulagem um componente indispensável para a identificação dos alergénios presentes nos alimentos. Dentro dos métodos utilizados para a deteção de alergénios está a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que é capaz de identificar o gene que codifica a proteína alergénica. Este método possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na área alimentar para a deteção de organismos genéticamente modificados e alergénios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificação de alergénios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de análises de sensibilidade, precisão e robustez, o método de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteção qualitativa de oito alergénios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avelã, caju, noz, pistáchio, sésamo e soja, no Laboratório da SGS - Société Générale de Surveillance. Destes alergénios, foi possível a validação de sete, demonstrando que o método de PCR em tempo real, para os presentes alergénios, possui elevada precisão e sensibilidade nos resultados obtidos.