Identificação de micobactérias não tuberculosas através de métodos moleculares não comerciais

Embora Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose humana, seja a principal causa de micobacteriose no Homem, outras micobactérias não tuberculosas (MNT), podem também causar infecção em seres humanos, sendo cada vez mais frequentemente isoladas no laboratório de micobacteriologia. Dada a morosidade da identificação de MNT por métodos convencionais, torna-se essencial o desenvolvimento de métodos rápidos e fiáveis para a sua identificação. Neste estudo foram comparados três métodos moleculares para a identificação de MNT, baseados na análise de restrição enzimática após amplificação de: (i) região rRNA 16S-23S “Internal Transcribed Spacer” (ITS), (ii) gene hsp65, e (iii) zona ITS e regiões adjacentes, 16S e 23S rDNA. Para este fim, avaliamos 50 isolados, correspondendo a 47 isolados clínicos de MNT e três estirpes de referência, representando as 11 espécies de MNT mais frequentemente isoladas no laboratório de Micobactérias do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT, UNL) e uma estirpe referência de M. tuberculosis, e identificadas anteriormente utilizando o sistema comercial GenoType® Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience). O PCR-RFLP do gene hsp65 proporcionou os melhores resultados, identificando correctamente 42 dos 49 isolados de MNT, pertencentes a M. avium, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. chelonae, M. fortuitum, M. abscessus, M. szulgai, M. peregrinum e M. xenopi. O PCR-RFLP da região ITS identificou correctamente 28 dos 49 isolados testados, não distinguindo M. intracellulare/M. scrofulaceum, M. avium/M. bohemicum e M. kansasii/M. szulgai. Finalmente, o PCR-RFLP da região ITS e regiões adjacentes mostrou o pior desempenho, com apenas oito isolados correctamente identificados e falhando na amplificação de diversos isolados. Dos três métodos testados, o PCR-RFLP do gene hsp65 e da região ITS mostraram maior capacidade de identificação e reprodutibilidade. No entanto, a sua aplicação exige uma optimização cuidadosa das condições de análise e a sua aplicabilidade depende, em grande parte, da diversidade xi de MNT em cada laboratório. Verificaram-se também várias dificuldades a nível da interpretação dos resultados. Assim, apesar das vantagens referidas na literatura para estes três métodos, verificou-se que o grau de variabilidade e dificuldade de interpretação associados aos padrões obtidos, limitam a sua implementação no laboratório de diagnóstico de micobacteriologia.

The role of the efflux mechanisms in multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis

Abstract The emergence of multi and extensively drug resistant tuberculosis (MDRTB and XDRTB) has increased the concern of public health authorities around the world. The World Health Organization has defined MDRTB as tuberculosis (TB) caused by organisms resistant to at least isoniazid and rifampicin, the main first-line drugs used in TB therapy, whereas XDRTB refers to TB resistant not only to isoniazid and rifampicin, but also to a fluoroquinolone and to at least one of the three injectable second-line drugs, kanamycin, amikacin and capreomycin. Resistance in Mycobacterium tuberculosis is mainly due to the occurrence of spontaneous mutations and followed by selection of mutants by subsequent treatment. However, some resistant clinical isolates do not present mutations in any genes associated with resistance to a given antibiotic, which suggests that other mechanism(s) are involved in the development of drug resistance, namely the presence of efflux pump systems that extrude the drug to the exterior of the cell, preventing access to its target. Increased efflux activity can occur in response to prolonged exposure to subinhibitory concentrations of anti-TB drugs, a situation that may result from inadequate TB therapy. The inhibition of efflux activity with a non-antibiotic inhibitor may restore activity of an antibiotic subject to efflux and thus provide a way to enhance the activity of current anti-TB drugs. The work described in this thesis foccus on the study of efflux mechanisms in the development of multidrug resistance in M. tuberculosis and how phenotypic resistance, mediated by efflux pumps, correlates with genetic resistance. In order to accomplish this goal, several experimental protocols were developed using biological models such as Escherichia coli, the fast growing mycobacteria Mycobacterium smegmatis, and Mycobacterium avium, before their application to M. tuberculosis. This approach allowed the study of the mechanisms that result in the physiological adaptation of E. coli to subinhibitory concentrations of tetracycline (Chapter II), the development of a fluorometric method that allows the detection and quantification of efflux of ethidium bromide (Chapter III), the characterization of the ethidium bromide transport in M. smegmatis (Chapter IV) and the contribution of efflux activity to macrolide resistance in Mycobacterium avium complex (Chapter V). Finally, the methods developed allowed the study of the role of efflux pumps in M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance (Chapter VI). By this manner, in Chapter II it was possible to observe that the physiological adaptation of E. coli to tetracycline results from an interplay between events at the genetic level and protein folding that decrease permeability of the cell envelope and increase efflux pump activity. Furthermore, Chapter III describes the development of a semi-automated fluorometric method that allowed the correlation of this efflux activity with the transport kinetics of ethidium bromide (a known efflux pump substrate) in E. coli and the identification of efflux inhibitors. Concerning M. smegmatis, we have compared the wild-type M. smegmatis mc2155 with knockout mutants for LfrA and MspA for their ability to transport ethidium bromide. The results presented in Chapter IV showed that MspA, the major porin in M. smegmatis, plays an important role in the entrance of ethidium bromide and antibiotics into the cell and that efflux via the LfrA pump is involved in low-level resistance to these compounds in M. smegmatis. Chapter V describes the study of the contribution of efflux pumps to macrolide resistance in clinical M. avium complex isolates. It was demonstrated that resistance to clarithromycin was significantly reduced in the presence of efflux inhibitors such as thioridazine, chlorpromazine and verapamil. These same inhibitors decreased efflux of ethidium bromide and increased the retention of [14C]-erythromycin in these isolates. Finaly, the methods developed with the experimental models mentioned above allowed the study of the role of efflux pumps on M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance. This is described in Chapter VI of this Thesis, where it is demonstrated that induced resistance to isoniazid does not involve mutations in any of the genes known to be associated with isoniazid resistance, but an efflux system that is sensitive to efflux inhibitors. These inhibitors decreased the efflux of ethidium bromide and also reduced the minimum inhibitory concentration of isoniazid in these strains. Moreover, expression analysis showed overexpression of genes that code for efflux pumps in the induced strains relatively to the non-induced parental strains. In conclusion, the work described in this thesis demonstrates that efflux pumps play an important role in the development of drug resistance, namely in mycobacteria. A strategy to overcome efflux-mediated resistance may consist on the use of compounds that inhibit efflux activity, restoring the activity of antimicrobials that are efflux pump substrates, a useful approach particularly in TB where the most effective treatment regimens are becoming uneffective due to the increase of MDRTB/XDRTB.

Sustentabilidade do SIG municipal da CM de Vila Franca de Xira - Operacionalização de um grupo de trabalho multidisciplinar, estruturalmente suportado pelo ArcGis Server Empertrise Advanced

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Gestão do Território.

Anemia de células falciformes na idade pediátrica : contribuição para o estudo das suas principais complicações e indicadores de prognóstico

RESMO: Introdução: A anemia de células falciformes doença hereditária, com repercussão multi-orgânica, tem grande variabilidade na sua expressão clínica. Daí o interesse do estudo de indicadores de prognóstico. A investigação realizada foi precedida de um resumo histórico incidindo sobre a compreensão de aspectos fundamentais da doença ao longo dos tempos. Na primeira parte do estudo e após revisão bibliográfica, foram referidos dados da fisiopatologia como base para os estudos que integram a presente dissertação. Abordou-se o estado da arte relativamente às complicações, aos indicadores de prognóstico e à terapêutica utilizada. Objectivos: Constituíram objectivos deste estudo realizado numa amostra populacional representativa: identificar as lesões a nível dos sistemas cardio-respiratório e nervoso central, avaliando-se as respectivas repercussões; avaliar a presença de indicadores de prognóstico entre as variáveis seleccionadas; estudar a eficácia e toxicidade da HU nos doentes com as formas graves da ACF. Para a prossecução destes objectivos foram delineados para além do estudo global três estudos específicos: Estudo 1- repercussão no sistema cardio-respiratório; Estudo 2- repercussão no sistema nervoso central; Estudo 3- terapêutica com hidroxiureia. Doentes e métodos: Procedeu-se a um estudo prospectivo e multi-institucional durante um período de três anos tendo-se seleccionado para a amostra, e de acordo com critérios pré-definidos, 30 doentes com ACF na fase estável da doença, com idades compreendidas entre os sete e os 18 anos, todos de origem africana à excepção de um caucasiano. O diagnóstico baseou-se em técnicas de electroforese e estudo molecular que definiu o genotipo da doença e a presença da delecção da -talassémia assim como os haplotipos da amostra populacional. Foram utilizadas diferentes metodologias para avaliar a existência de lesão pulmonar e cerebral. Através do estudo estatístico foram seleccionadas diversas variáveis como hipotéticos indicadores de prognóstico. Estudo 1. Para determinar a existência de lesão a nível pulmonar usaram-se duas metodologias diferentes, a avaliação da função pulmonar com estudo da saturação da Hb em O2 no sangue arterial e a tomografia computadorizada de alta resolução. Estudou-se também a possível disfunção cardíaca como repercussão da lesão pulmonar, através do ecocardiograma, e os indicadores de prognóstico com significado estatístico para a lesão encontrada. Estudo 2. O desenho deste estudo foi sobreponível ao anterior, mas com metodologia adequada para o SNC. Procedeu-se ao estudo das lesões cerebrais por meio de exames imagiológicos, (RMN-CE e DTC) e de testes psicológicos. Correlacionaram-se as três metodologias utilizadas e a importância de cada uma para a decisão de atitudes terapêuticas preventivas. Estudo 3. Consistiu num estudo aberto prospectivo não controlado com nove crianças e adolescentes com formas graves de ACF, com o objectivo de avaliar a eficácia da terapêutica com hidroxiureia, durante um período de 24 meses. Todos os doentes completaram no mínimo 15 meses de terapêutica, com uma dose final média de 194 mg/K/dia. Resultados globais: Durante o período anterior à investigação caracterizou-se a amostra populacional estudada quanto ao fenotipo genético, clínico e hematológico de acordo com os critérios utilizados por outros investigadores. Verificou-se: predomínio do haplotipo Bantu na forma homozigótica em 53% dos doentes; número total de EVO ≥3/ano em 87,5% dos doentes; crises de sequestração em 18,75%; dactilites no primeiro ano de vida em 31,2%; quadro de sépsis grave apenas num doente; crises de hiper-hemólise em 50%; e STA em 59,38% dos doentes. Quanto ao fenotipo hematológico evidenciaram-se como factores de risco reticulocitose (13,1x103/l) e hiperbilirrubinémia (2,5 mg/dl) e como factores de bom prognóstico a presença de delecção de um gene da -talassémia em 46,9% dos doentes e valor médio de Hb 8,1 g/dl. Resultados dos estudos parcelares: Estudo 1. Deste estudo infere-se que a DPR ligeira foi diagnosticada em 70% dos doentes, uma vez que as alterações da difusão não foram estatisticamente significativas, o estudo dos gases no sangue não evidenciaram resultados anormais e a TCAR evidenciou alterações em 43,3% dos doentes. Apenas num doente se verificou doença pulmonar obstrutiva relacionada com maior número da STA.O estudo da disfunção cardíaca encontrada em 86,7% dos doentes não reflecte a repercussão da DPR a nível cardíaco, podendo estar associada às alterações fisiopatológicas da própria anemia crónica. Encontraram-se indicadores de prognóstico hematológicos e clínicos. Entre os primeiros, valores de Hb ≥8,5 g/dl e de HbF ≥13% foram considerados indicadores de bom prognóstico para a lesão pulmonar. Em relação aos parâmetros clínicos, as STA não foram consideradas indicadoras de prognóstico para a DPR ao contrário do que se verificou com o número de EVO. Pela análise dos parâmetros genéticos e socio-económicos provou-se a ausência de relação estatisticamente significativa com lesão pulmonar. Estudo 2. Pela RMN-CE foram diagnosticados ES em 33,3% com uma localização preferencial na substância branca profunda em 26,6% dos doentes. Relativamente aos parâmetros hematológicos seleccionados, o valor médio da HbF 8,6% constituíu um indicador de bom prognóstico para o aparecimento de ES, enquanto o valor médio de leucócitos 12.39x103/μl foi considerado um indicador de mau prognóstico. No estudo do DTC apenas um doente apresentou aumento da velocidade do fluxo cerebral na ACM igual a 196 cm/segundos, associado a vasculopatia grave. Os testes psicológicos alterados em 80% dos doentes mostraram ser o método mais sensível para detectar alterações do neurodesenvolvimento, mas sem correlação com os ES em 10% dos doentes. Realça-se a baixa percentagem de DTC patológicos encontrados neste estudo em relação ao número elevado de ES e de testes psicológicos alterados, não se verificando concordância entre os três exames. Dos indicadores de prognóstico estudados a -talassémia foi considerada um factor de protecção para o coeficiente de inteligência da escala de Wechsler. Em relação a parâmetros clínicos estudados os doentes com maior número de EVO, tem em média valores inferiores nos testes psicológicos. Estudo 3. Neste estudo verificou-se que o valor médio da HbF aumentou significativamente de 7,0±4% para 13,7±5,3% (p=0,028) ao fim de 15 meses de terapêutica com hidroxiureia. Clinicamente todos os doentes responderam significativamente com uma redução de 80% no número de EVO, 69% no número de internamentos, 76% no número de dias de hospitalização e 67% no número de transfusões. Deste modo comprovou-se não só a eficácia desta terapêutica neste grupo pediátrico como também a falta de efeitos secundários significativos. Considera-se a necessidade de estudos mais prolongados e em grande séries, para com segurança se usar a HU antes que a lesão orgânica se estabeleça, portanto logo nos primeiros anos de vida. Conclusão: Na amostra populacional estudada foram evidenciadas lesões pulmonares e cerebrais na grande maioria dos doentes que condicionaram a sua qualidade de vida. Foram identificados indicadores de prognóstico que poderão eventualmente ditar medidas terapêuticas precoces com o objectivo de diminuir a morbilidade e a mortalidade neste grupo etário. Demonstrou-se que a terapêutica com a HU foi eficaz e bem tolerada----------ABSTRACT: Background: Sickle cell anemia (SCA), a hereditary disease characterized by pain and lifetime multi-organic lesion, is a challenge for all that work with carriers of this disease. The clinical expression variability of SCA is a constant reality and a problem to be solved in the current world of investigation, for which the knowledge of prognostic indicators responsible for the different aspects of clinical evolution diversity wiil be an added value. The study is preceded by a historical summary of the most important factors in the evolution of SCA, which are in themselves, an incentive for future research. In the first part of the study, after an extensive bibliographical revision, physiopathology data is referred to in general and specifically regarding the target organs, that constituted the base for the studies presented in the dissertation. The state of the art for the complications to be studied, the choice of prognostic indicators and the therapeutics application, were approached for the renewed interest in the theme. Aims: In regard to the investigation, the objective was to study the lesions in the most affected organs of a chosen pediatric group, to investigate prognostic indicators for lung and cerebral lesions and to evaluate the protective effect of hydroxyurea in children with severe outcomes. Patients and methods: A prospective and multi-institutional study was carried out during a three-year period, February 1998 to March 2001, with children and adolescents followed up at a Immunohematology Outpatient Clinic of Dona Estefânia's Hospital, Lisbon. Based in predefined criteria, 30 children with SCA were selected in a stable phase of the disease, aged from seven to 18 years old, all of whom were of African origin with exception of one who was Caucasian. The diagnosis was based on electrophoresis techniques and molecular study that allowed to define the genotype, the presence of deletional alpha-thalassemia as well as haplotypes in the population. Different methodologies were used to evaluate the existence of lung and cerebral lesion. Statistical study of the different variables selected the prognostic indicators. In Study 1, to determine the existence of lung lesion two different methodologies were used: pulmonar function study with arterial blood gases determination; and high resolution computerized tomography. Heart dysfunction as a repercussion of lung lesion was also studied through echocardiography, and prognostic indicators were statistically significant for lesions found. The design of Study 2 was similar to Study 1, but with the appropriate methodology for CNS. After neurological examination, which was normal in all patients (control group), cerebral lesions were studied with imagiologic exams (MRN-CE and TCD) and psychological tests. These three methodologies were correlated and the importance of each one in the decision of the therapeutic profilactic attitudes. Study 3 consisted of a controlled prospective open study in children with severe forms of SCA, with the aim of the evaluating therapeutic effectiveness of hydroxyurea, during a period of 24 months. Results: In the global overall study preceding the Studies 1,2 and 3, there were a prevalence of haplotype Bantu (53%) and other risk factors, namely the number of VOC (87,5%), sequestration crisis (18,75%), dactilytis in first year of life(31,2%), hyperhemolysis crisis (50%) and ATC in more than half of the patients (59,38%). This group of bad prognostic indicators, associated with the population of the lower class according to the Graffar scale, demonstrates the importance of primary health care services, information provided to the children and their relatives, as well as the interest in prophylactic therapeutics, specific screening and prenatal diagnosis. Study 1. It was evident from this study that slight RPD was diagnosed in 70% of the patients, because alterations of the diffusion had no statistical significance and arterial blood gases determinations were normal. Only one patient had restrictive lung disease related with numerous ACS. However ACS was not considered a prognostic indicator for RPD, contrary to the number of EVO. HRTC revealed discreet fibrotic lines that could be related with slight RPD, but the lack of correlation of these two exams (33%) supports the value of lung function tests for precocious diagnosis of RPD. Heart dysfunction was found in 86,7% of patients, does not reflect the repercussion of RPD, but with the physiopathology of chronic anemia. Hematologic and clinical prognostic indicators were found. Good prognostic indicators for the non-evolution of RPD with average Hb values of ≥ 8,5 g/dl and average HbF values of ≥13%, respectively. The genetic and social-economic factors had no statistical significance; nevertheless, they were more prevalent among Bantu haplotype (53,3%) in patients with RPD. Study 2. RMN-CE detected SI in 33,3% of the patients, with preferential location in deep white substance in 26,6% and in front lobe in 20%. This distribution can be related to structural aspects of the brain and with the high sensibility of this organ to hypoxia. From the hematological parameters selected, average HbF value 8,6% and average leucocyte count 12.39x103/μl were prognostic indicators with different meaning to SI. The increase in the total bilirubin related to hyperhemolysis clinically explains the genesis of SI In the TCD study, only one patient had increased cerebral flow speed >196 cm/sec in CMA, which corresponded to serious vasculopathy in AngioMR. This patient never present previously neurological symptoms and had several hyperhemolysis crisis and VOC as risk factors. Low percentage of pathological TCD in this study, in relation to the high number of SI and altered tests, although without correlation among the three exams, is probably attributed to factors related to the methodology, aspects of cerebral physiopathology or perhaps a sign of good prognostic if the duration of study had not been so short. TCD should be used as a screening method in the age groups with higher risk of AVC and should never be considered separately in prophylactic therapeutics indication. Psychological tests were the most sensitive method to detect neurodevelopment impairment; in 80% of patients the neuropsychologics tests were altered, but without correlation with SI (10%). Since SI can become evident during the first two years of life and develop with time, the first psychological tests should be carried out between 3 and 5 years of age to timely be referred to special education and stimulation programs. Prognostic indicators to psychological tests were also found: alpha-thalassemia was found to be a protection factor of the IQ, just as other hematologic factors (hematocrit, MGCV and erythrocytes count). In relation to clinical parameters, although without statistical significance, patients with larger number of VOC had average lower scores versus the average in tests, except in TP. Results from different studies were conclusive as to the type of lesion found and the importance of prognostic indicators. Study 3. All the patients completed a minimum of 15 months therapeutic treatment with the final average daily dose of 19±4 mg/kg/day. The average value of the fetal hemoglobin increased significantly from 7,0±3,9% to 13,7±5,3% (p=0.028). The HbF average values increased from 6% to 15% after 15 months of therapeutic treatment. Clinically there was a reduction of 80% in the number of VOE , 69% in the number of hospitalization, 76% in the number of days of hospitalization and 67% in the number of transfusions. Once again the effectiveness of this treatment in this pediatric group, as well as the lack of any significant secondary effects, was evident. The study confirms the need for further detailed research in order to safely effect the appropriate treatment prior to the development of organic lesions, which ideally should be in the first year of life. Conclusions: These results allow us to clarify the importance of either pulmonary lesions or either nervous central system impairment among patients, children and adolescents, with sickle cell anemia. These lesions were demonstrated in most of the patients studied compromising their quality of life and the mortality. The treatment with HU is proved to be effective and having low toxicity.

Aplicação de sistemas moleculares na detecção rápida de MDR-TB e XDR-TB

Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da tuberculose em humanos e segundo as estimativas da Organização Mundial da Saúde, um terço da população mundial está infectada com esta bactéria, calculando-se que no ano de 2008 aproximadamente 9,4 milhões de pessoas contraíram tuberculose activa. Associada a esta tendência, encontra-se o aumento alarmante da incidência de tuberculose resistente aos antibióticos, mais propriamente da tuberculose multirresistente e extensivamente resistente. Nesta Dissertação estudaram-se três sistemas de detecção molecular (INNO-LiPA Rif. TB, Innogenetics, Ghent, Bélgica, MTBDRplus e MTBDRsl, GenoType, GmbH, Nehren, Alemanha), que permitem detectar o complexo M. tuberculosis e as mutações mais comuns associadas à resistência aos antibióticos de primeira e segunda linha. Para o efeito, na primeira parte do trabalho os três sistemas em estudo foram testados em 21 isolados clínicos pertencentes à colecção do Laboratório de Micobactérias do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT, UNL), com o propósito de avaliar a sua capacidade para identificar o complexo M. tuberculosis e detectar mutações ligadas à resistência aos fármacos de primeira e segunda linha. Na segunda parte do trabalho, os sistemas INNO-LiPA Rif. TB e MTBDRplus foram testados em 33 amostras respiratórias com baciloscopia positiva, com o propósito de aferir a “performance” destes sistemas para a detecção directa de tuberculose multirresistente em amostras respiratórias. Na primeira parte do trabalho os três sistemas em estudo apresentaram elevada sensibilidade na identificação do complexo M. tuberculosis em culturas, bem como na detecção de mutações ligadas à resistência aos antibióticos de primeira linha, com excepção do etambutol. No que diz respeito à detecção da resistência aos antibióticos de segunda linha, não foi possível calcular os valores de sensibilidade e especificidade. Na segunda parte do trabalho, o INNO-LiPA Rif. TB demonstrou ser o sistema mais robusto para a análise directa de amostras respiratórias com baciloscopia positiva, para um diagnóstico precoce de tuberculose e detecção de resistência à rifampicina. O MTBDRplus não se mostrou uma alternativa viável ao INNO-LiPA Rif. TB, pois apresentou baixa sensibilidade para a identificação do complexo M. tuberculosis e vários problemas no passo de amplificação. O MTBDRsl não foi testado, por não ter sido detectada nenhuma amostra multirresistente.

Au-nanossondas aplicação na detecção de Mycobacterium tuberculosis e plasmodium berghei

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Caracterização de estirpes de Mycobacterium bovis: estudos de crescimento e de interacção com macrófagos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

New strategies to detect and understand genotype-by-environment interactions and QTL-by-environment interactions

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Estatística e Gestão do Risco, especialidade em Estatística

Caracterização de estirpes Mycobacterium Tuberculosis da família Lisboa: análise de regiões de diferença e single nucleotide polymorphisms

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Gold nanoprobes for the detection of mutations associated with antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis complex

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Novas estratégias no combate à tuberculose: a NADH-MENAQUINONA desidrogenase do tipo II de Mycobacterium tuberculosis

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Lab on paper: biossensores colorimétricos de papel para a detecção de membros do complexo Mycobacterium tuberculosis

Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto Lab on Paper, desenvolvido no Centro de Investigação de Materiais (CENIMAT) da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT - UNL)

Aplicação de sistemas moleculares na detecção rápida de MDR-TB e XDR-TB

Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da tuberculose em humanos e segundo as estimativas da Organização Mundial da Saúde, um terço da população mundial está infectada com esta bactéria, calculando-se que no ano de 2008 aproximadamente 9,4 milhões de pessoas contraíram tuberculose activa. Associada a esta tendência, encontra-se o aumento alarmante da incidência de tuberculose resistente aos antibióticos, mais propriamente da tuberculose multirresistente e extensivamente resistente. Nesta Dissertação estudaram-se três sistemas de detecção molecular (INNO-LiPA Rif. TB, Innogenetics, Ghent, Bélgica, MTBDRplus e MTBDRsl, GenoType, GmbH, Nehren, Alemanha), que permitem detectar o complexo M. tuberculosis e as mutações mais comuns associadas à resistência aos antibióticos de primeira e segunda linha. Para o efeito, na primeira parte do trabalho os três sistemas em estudo foram testados em 21 isolados clínicos pertencentes à colecção do Laboratório de Micobactérias do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT, UNL), com o propósito de avaliar a sua capacidade para identificar o complexo M. tuberculosis e detectar mutações ligadas à resistência aos fármacos de primeira e segunda linha. Na segunda parte do trabalho, os sistemas INNO-LiPA Rif. TB e MTBDRplus foram testados em 33 amostras respiratórias com baciloscopia positiva, com o propósito de aferir a “performance” destes sistemas para a detecção directa de tuberculose multirresistente em amostras respiratórias. Na primeira parte do trabalho os três sistemas em estudo apresentaram elevada sensibilidade na identificação do complexo M. tuberculosis em culturas, bem como na detecção de mutações ligadas à resistência aos antibióticos de primeira linha, com excepção do etambutol. No que diz respeito à detecção da resistência aos antibióticos de segunda linha, não foi possível calcular os valores de sensibilidade e especificidade. Na segunda parte do trabalho, o INNO-LiPA Rif. TB demonstrou ser o sistema mais robusto para a análise directa de amostras respiratórias com baciloscopia positiva, para um diagnóstico precoce de tuberculose e detecção de resistência à rifampicina. O MTBDRplus não se mostrou uma alternativa viável ao INNO-LiPA Rif. TB, pois apresentou baixa sensibilidade para a identificação do complexo M. tuberculosis e vários problemas no passo de amplificação. O MTBDRsl não foi testado, por não ter sido detectada nenhuma amostra multirresistente.

Infeção por Mycobacterium Tuberculosis em profissionais de saúde : metodologia de avaliação do risco e sua aplicação num hospital central

RESUMO - A Tuberculose surge, de acordo com o último relatório da Organização Mundial da Saúde, como a segunda principal causa de morte em todo o mundo, de entre as doenças infeciosas. Em 2012, 1.3 milhões de pessoas morreram devido a esta patologia e surgiram 8.6 milhões de novos casos. De entre os grupos de risco de infeção, surgem os profissionais de saúde. A dificuldade no diagnóstico da Tuberculose, o contacto próximo com os pacientes, as medidas de controlo de infeção por vezes inadequadas são algumas das razões que explicam o risco mais elevado de contrair Tuberculose no local de trabalho. Esta Dissertação de Mestrado pretende estabelecer uma nova classificação de risco de infeção por M. tuberculosis em estabelecimentos de saúde, com vista a promover a saúde destes profissionais, inovadora nos critérios de avaliação das medidas de controlo de infeção e de análise dos casos de exposição não protegida a Tuberculose ativa. Esta metodologia de avaliação foi o resultado de uma revisão bibliográfica sobre a temática, tendo sido aplicada num hospital para verificar a sua adequabilidade e mais-valia.

Molecular tools in the diagnostic and epidemiology of infections caused by members of Mycobacterium avium Complex

Mycobacterium avium Complex (MAC) comprises microorganisms that affect a wide range of animals including humans. The most relevant are Mycobacterium avium subspecies hominissuis (Mah) with a high impact on public health affecting mainly immunocompromised individuals and Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) causing paratuberculosis in animals with a high economic impact worldwide. In this work, we characterized 28 human and 67 porcine Mah isolates and evaluated the relationship among them by Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA). We concluded that Mah population presented a high genetic diversity and no correlations were inferred based on geographical origin, host or biological sample. For the first time in Portugal Map strains, from asymptomatic bovine faecal samples were isolated highlighting the need of more reliable and rapid diagnostic methods for Map direct detection. Therefore, we developed an IS900 nested real time PCR with high sensitivity and specificity associated with optimized DNA extraction methodologies for faecal and milk samples. We detected 83% of 155 faecal samples from goats, cattle and sheep, and 26% of 98 milk samples from cattle, positive for Map IS900 nested real time PCR. A novel SNPs (single nucleotide polymorphisms) assay to Map characterization based on a Whole Genome Sequencing analysis was developed to elucidate the genetic relationship between strains. Based on sequential detection of 14 SNPs and on a decision tree we were able to differentiate 14 phylogenetic groups with a higher discriminatory power compared to other typing methods. A pigmented Map strain was isolated and characterized evidencing for the first time to our knowledge the existence of pigmented Type C strains. With this work, we intended to improve the ante mortem direct molecular detection of Map, to conscientiously aware for the existence of Map animal infections widespread in Portugal and to contribute to the improvement of Map and Mah epidemiological studies.