Contribuição da microbiologia preditiva na análise de cremes de pasteleiro

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Diagnóstico laboratorial em microbiologia clínica: um estudo no centro hospitalar

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Estudo e desenvolvimento do método de detecção de metabolitos no fluido lacrimal

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Microbiologia preditiva aplicada à análise de amostras de carne de vaca e porco

A microbiologia preditiva é a conjugação de conhecimentos provenientes de disciplinas como a matemática, estatística e os sistemas de informação e tecnologia que pretende providenciar modelos preditivos que prevejam o comportamento microbiano em ambientes alimentares, de forma a poder prevenir a deterioração dos géneros alimentares bem como as doenças de origem alimentar. Os modelos preditivos primários, secundários e terciários são aplicados no intuito de melhorar a qualidade e segurança alimentar e particularmente os terciários, podem ser utilizados como ferramentas auxiliadoras na área de HACCP; é necessário ter em conta que estes modelos são uma representação muito simplificada da realidade, que possuem limitações devido á complexidade do comportamento microbiano e dos ambientes alimentares, podendo por isto estimar previsões que se desviem das situações reais. O presente trabalho tem como principal objectivo averiguar a aplicabilidade da microbiologia preditiva, particularmente, dos modelos terciários ou softwares preditivos, na análise de amostras de carne de vaca e porco armazenadas a 5ºC e 10ºC, comparando os resultados obtidos através da análise microbiológica clássica, realizada no laboratório de microbiologia da empresa SGS, com os resultados obtidos das previsões provenientes de dois softwares preditivos, nomeadamente, ComBase Predictor e PMP (Pathogen Modeling Program). Para tal, foram realizadas análises microbiológicas, por forma a realizar contagens de E.coli, S.aureus, L.monocytogenes e pesquisa de Salmonella e análises químicas para analisar o pH, aw e NaCl de 20 amostras de carne de vaca e 20 amostras de carne de porco Adicionalmente foram efetuadas contagens de microrganismos totais a 30ºC. Os resultados demonstraram que a ferramenta preditiva ComBase conseguiu efectuar melhores previsões para o crescimento de E. coli, S. aureus e L. monocytogenes em amostras de carne de vaca e de porco do que a ferramenta preditiva PMP. Contudo, mesmo sendo melhor, as previsões efectuadas pelo programa apresentaram desvios em relação às contagens reais que muito provavelmente se relacionam com a existência da flora de decomposição. Os resultados estimados pela ferramenta PMP foram sempre muito mais elevados do que os resultados obtidos na análise microbiológica laboratorial, o que demonstrou a sua não aplicabilidade a este tipo de amostras.

Marcação CE, optimização e caracterização de uma superfície de redução de pressão para doentes acamados

A presente dissertação tem como objectivo principal o estudo e a elaboração da Marcação CE de um dispositivo médico de classe I. Este dispositivo, com a marca comercial Corkgel, tem como finalidade o alívio de pressão em doentes acamados e a prevenção de úlceras de pressão. O processo para a obtenção da Marcação CE implica a elaboração da documentação técnica, o cumprimento dos requisitos essenciais presentes nas directivas europeias e a realização da análise de risco do dispositivo em estudo. O conceito da Marcação CE é apresentado no Capítulo I. No Capítulo II estão discriminados os passos para a obtenção da marcação CE para qualquer dispositivo médico, sendo também abordadas as diferenças entre dispositivos médicos de classes de risco diferentes (I, IIa, IIb, III). No Capítulo III é apresentada a documentação técnica para o processo de marcação CE do Corkgel regida pela directiva 93/42/CE. A caracterização experimental dos dispositivos Corkgel, essencial para a gestão de risco, está descrita no Capítulo IV. A gestão de risco requer dados analíticos e/ou evidências de conformidade, nesse sentido, foram realizados testes de toxicidade, através de técnicas de espectroscopia e cromatografia gasosa, testes de envelhecimento químico/mecânico, inflamabilidade e microbiologia, que são referentes aos requisitos de saúde. Além disso, foram realizados testes de pressão, transpiração e de compatibilidade com técnicas de imagem médica, no sentido de evidenciar a eficácia do Corkgel em reduzir a incidência das úlceras de pressão. O cumprimento dos requisitos essenciais implica um processo de gestão de risco que tem como finalidade a identificação dos riscos com vista à sua redução/eliminação. Este processo foi accionado na fase de pré mercado, mas terá que continuar na fase pós mercado. Nem todos os testes para avaliar a eficácia do Corkgel foram terminados, além disso os testes de microbiologia e toxicidade não foram conclusivos. Quando o produto estiver em conformidade, deverá ser registado num organismo notificado, por exemplo no INFARMED, em Portugal. Merece referência o facto que, após a aposição da marcação CE, o fabricante terá que estabelecer procedimentos de vigilância de mercado, para prevenir e/ou corrigir não conformidades que venham a ser detectadas.

Reacção de cisão da molécula de azoto em xénon supercrítico

Apenas há 100 anos atrás foi finalmente estabelecido que os sistemas biológicos têm a capacidade de fixar o azoto. A Química ainda se encontrava atrasada, mas em 1913, Haber e Bosh projectaram a primeira instalação comercial de fixação do azoto e fundaram a indústria química inorgânica moderna. Os mecanismos destes dois processos relacionados são, no entanto, muito diversos. Laplaza e Cummins apresentaram na revista Science uma reacção que representa o culminar de 30 anos de trabalho da comunidade química na fixação de azoto em condições próximas das atmosféricas. Esta descoberta apresenta um complexo inorgânico simples que pode quebrar a ligação tripla da molécula de azoto para formar um novo nitrilo-complexo sem a necessidade de qualquer outro reagente. Esta publicação inspirou o trabalho apresentado nesta tese. Como a transferência de massa entre as fases – gasosa (azoto) e o solvente líquido – constituía um factor limitativo da cinética da reacção, assim a utilização de um solvente supercrítico pareceu ser uma melhoria óbvia. O xénon é o único fluido supercrítico, à temperatura ambiente suficientemente inerte quimicamente para ser usado como solvente em contacto com uma substância extremamente reactiva, capaz de quebrar a ligação da molécula de azoto. Neste trabalho, a reacção descoberta por Laplaza e Cummins foi efectuada em xénon supercrítico. A realização desta reacção envolveu diversas etapas: 1. As sínteses do composto Mo(NRAr)3 (1) (onde R é C(CD3)2CH3 e Ar é 3,5-C6H3(CH3)2), usando caixa de luvas e técnicas sob atmosfera de árgon; 2. A construção de uma nova instalação, projectada para a realização da reacção do composto 1 com o azoto em xénon supercrítico, com monitorização contínua através de espectrofotometria visível; 3. A introdução de sucessivas modificações devido a dificuldades experimentais imprevistas conduziu à reconstrução substancial da primeira instalação utilizada, de forma a ser possível medir a solubilidade do composto 1 em xénon supercrítico, e de proporcionar a difusão do azoto no xénon. 4. Medições da solubilidade do complexo 1 em xénon supercrítico, à temperatura ambiente e pressões entre 6 e 10MPa; 5. Medições da cinética da reacção do composto 1 com azoto gasoso, usando xénon supercrítico como solvente, em diversas condições, com diversos ambientes de solventes, em diferentes quantidades do composto 1, e usando métodos de detecção completamente diferentes do método espectroscópico inicialmente programado; 6. Utilização de simulações em CFD (Computer Fluid Dynamics) para interpretar os resultados obtidos. Estas simulações sugerem que a elevada densidade do xénon induz a sedimentação lenta do excesso (não dissolvido) do composto 1, que controla a distribuição do produto da reacção dentro do reactor. A conclusão principal foi a de que a cisão da ligação da molécula do azoto pelo composto 1 pode ser obtida em segundos em xénon supercrítico.

Ocorrência e diversidade de leveduras no filoplano de plantas seleccionadas do Parque Natural da Serra da Arrábida

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia (especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Leveduras isoladas de produtos frutícolas: Capacidade fermentativa e estudos sobre a H+-ATPase da membrana plasmática

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia(especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

Caracterização de filmes negros em pedras graníticas: o caso de estudo da Igreja da Venerável Ordem Terceira de São Francisco

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro

Recuperação de nanopartículas metálicas por ultrafiltração

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Estudo da soldadura em carga de uma tubagem API 5L

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Relatório de estágio de Mestrado em Ensino de Biologia e de Geologia no 3.º ciclo do Ensino Básico e no Ensino Secundário

Relatório de Estágio Pedagógico apresentado, na Faculdade de Ciências e Tecnologia, da Universidade Nova de Lisboa, para obtenção do grau de Mestre em Ensino de Biologia e de Geologia

Contributo para o estudo da infecção congénita pelo vírus citomegálico em Portugal

Resumo O vírus citomegálico humano (CMV) é o principal agente de infecção congénita, atingindo cerca de 0.2 a 2.2% de todos os recém-nascidos. As crianças que nascem infectadas por este vírus têm cerca de 11% a 12.7% de probabilidades de apresentarem sintomas e sinais de doença citomegálica ao nascimento, podendo cerca de 40 a 58% destas virem a apresentar sequelas neurológicas permanentes. Das crianças infectadas que terão infecção assintomática no período neo-natal, 5 a 15% poderão vir igualmente a sofrer de sequelas tardias, sobretudo a surdez ou o atraso mental. Em Portugal, desconhece-se a dimensão deste problema. O primeiro objectivo desta dissertação foi, desta forma, a determinação da prevalência através do recurso aos cartões do diagnóstico precoce (“Guthrie cards”), utilizando uma técnica de nested-PCR dirigida para o vírus. Foram estudados 3600 cartões, seleccionados de todo o território nacional (continente e ilhas), de uma forma proporcional ao número de nascimentos em cada distrito, dos quais 38 foram positivos, o que dá uma prevalência de 1.05% (intervalo de confiança para 95%: 0.748-1.446). A revisão sobre a experiência acumulada nos últimos 15 anos, na área do diagnóstico pré-natal, juntamente com um estudo adicional sobre a técnica da avidez, permitiu retirar algumas ilações, nomeadamente que este diagnóstico constitui uma arma diagnostica fiável para a avaliação pré-natal desta infecção congénita e que a selecção dos casos para amniocentese deverá obedecer a indicações serológicas precisas, como a “seroconversão para IgG” ou a “IgM confirmada” (devendo o método de confirmação ser a avidez das IgG com um índice <0,6) e as alterações ecográficas de etiologia não esclarecida. A possibilidade de utilizar pools de urinas para detectar a infecção congénita por CMV foi abordada na terceira parte do trabalho experimental. A metodologia aí descrita teve correlação total com o método de referência, permitindo uma redução bastante significativa nos tempos de execução e nos custos em consumíveis, pelo que abre a possibilidade da sua utilização para o rastreio da infecção congénita por CMV nos recém-nascidos.

The role of ribonuclease R in bacterial adaptation to cold shock

RESUMO:Os microrganismos reagem à súbita descida de temperatura através de uma resposta adaptativa específica que assegura a sua sobrevivência em condições desfavoráveis. Esta adaptação inclui alterações na composição da membrana, na maquinaria de tradução e transcrição. A resposta ao choque térmico pelo frio induz uma repressão da transcrição. No entanto, a descida de temperatura induz a produção de um grupo de proteínas específicas que ajudam a ajustar/re-ajustar o metabolismo celular às novas condições ambientais. Em E. coli o processo de adaptação demora apenas quatro horas, no qual um grupo de proteínas específicas são induzidas. Depois desde período recomeça lentamente a produção de proteínas.A ribonuclease R, uma das proteínas induzidas durante o choque térmico pelo frio, é uma das principais ribonucleases em E. coli envolvidas na degradação do RNA. É uma exoribonuclease que degrada RNA de cadeia dupla, possui funções importantes na maturação e “turnover” do RNA, libertação de ribossomas e controlo de qualidade de proteínas e RNAs. O nível celular desta enzima aumenta até dez vezes após exposição ao frio e estabiliza em células na fase estacionária. A capacidade de degradar RNA de dupla cadeia é importante a baixas temperaturas quando as estruturas de RNA estão mais estáveis. No entanto, este mecanismo é desconhecido. Embora a resposta específica ao “cold shock” tenha sido descoberta há mais de duas décadas e o número de proteínas envolvidas sugerirem que esta adaptação é rápida e simples, continuamos longe de compreender este processo. No nosso trabalho pretendemos descobrir proteínas que interactuem com a RNase R em condições ambientais diferentes através do método “TAP-tag” e espectrometria de massa. A informação obtida pode ser utilizada para deduzir algumas das novas funções da RNase R durante a adaptação bacteriana ao frio e durante a fase estacionária. Mais importante ainda, RNase R poderá ser recrutada para um complexo de proteínas de elevado peso molecular durante o “cold-shock”.------------ABSTRACT:Microorganisms react to the rapid temperature downshift with a specific adaptative response that ensures their survival in unfavorable conditions. Adaptation includes changes in membrane composition, in translation and transcription machinery. Cold shock response leads to overall repression of translation. However, temperature downshift induces production of a set of specific proteins that help to tune cell metabolism and readjust it to the new environmental conditions. For Escherichia coli the adaptation process takes only about four hours with a relatively small set of specifically induced proteins involved. After this time, protein production resumes, although at a slower rate. One of the cold inducible proteins is RNase R, one of the main E. coli ribonucleases involved in RNA degradation. RNase R is an exoribonuclease that digest double stranded RNA, serves important functions in RNA maturation and turnover, release of stalled ribosomes by trans-translation, and RNA and protein quality control. The level of this enzyme increases about ten-fold after cold induction, and it is also stabilised in cells growing in stationary phase. The RNase R ability to digest structured RNA is important at low temperatures where RNA structures are stabilized but the exact role of this mechanism remains unclear. Although specific bacterial cold shock response was discovered over two decades ago and the number of proteins involved suggests that this adaptation is fast and simple, we are still far from understanding this process. In our work we aimed to discover the proteins interacting with RNase R in different environmental conditions using TAP tag method and mass spectrometry analysis. The information obtained can be used to deduce some of the new functions of RNase R during adaptation of bacteria to cold and in stationary growth phase. Most importantly RNase R can be recruited into a high molecular mass complex of protein in cold shock.

Role of ß-lactamase operon on mecA expression in Staphylococcus aureus

RESUMO: Os Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA, do inglês “methicillin-resistant Staphylococcus aureus”) são um dos principais agentes responsáveis por infeções hospitalares. Os MRSA são resistentes a praticamente todos os antibióticos β-lactâmicos devido a dois mecanismos principais: produção de β-lactamase (bla), codificada pelo gene blaZ, e produção de uma proteína de ligação à penicilina (PBP2a, do inglês “penicillin binding protein 2”), codificada pelo gene mecA. Estes dois genes são regulados por sistemas homólogos, constituídos por um sensor-transdutor (BlaR1 e MecR1) e um repressor (BlaI e MecI), de tal modo que ambos os sistemas são capazes de co-regular os genes mecA e blaZ, embora com eficiências de indução muito diferentes. De facto, a indução mediada pelo sistema mecI-mecR1 é tão lenta que se acredita que este sistema não está funcional na maioria das estirpes MRSA. No entanto, dados recentes do nosso laboratório, demonstram a ausência de relação entre a presença do gene mecI e o nível de resistência à meticilina em estirpes MRSA epidémicas, e também que, o fenótipo de resistência da grande maioria das estirpes não é perturbado pela sobre-expressão em trans do repressor mecI. Curiosamente, as duas estirpes em que a expressão da resistência foi afetada pela sobre-expressão do mecI são negativas para o locus da β-lactamase, o que sugere que este locus pode interferir diretamente com a repressão do gene mecA mediada pelo MecI. Nesta tese de mestrado esta hipótese foi explorada usando estratégias de biologia molecular e ensaios fenotípicos da resistência aos -lactâmicos. Os resultados obtidos demonstram que a presença do plasmídeo nativo da β-lactamase não só anula a repressão mediada pelo MecI, como também aumenta o nível de resistência das estirpes parentais. Várias hipóteses foram então formuladas para explicar estas observações. Dados preliminares, em conjunto com evidências experimentais publicadas, sugerem que o BlaI forma hetero-dímeros com o MecI que, após a indução, são inativados eficientemente pelo BlaR1. Em conclusão, estes resultados apresentam novas perspetivas para o mecanismo de regulação do mecA e para uma nova importante função do operão da β-lactamase para o fenótipo das estirpes MRSA.-------------------ABSTRACT: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an important nosocomial pathogen and is also emerging in the community. MRSA is cross-resistant to virtually all β-lactam antibiotics and has acquired two main resistance mechanisms: production of β-lactamase (bla), coded by blaZ, and production of penicillin binding protein 2a (PBP2a), coded by mecA. Both genes are regulated by homologous sensor-transducers (BlaR1 and MecR1) and repressors (BlaI and MecI), and coregulation of mecA and blaZ by both systems has been demonstrated, although with remarkable different efficiencies. In fact, induction of mecA by mecI-mecR1 is so slow that it is believed it is not functional in most MRSA strains. However, recent data from our laboratory has unexpectedly demonstrated that not only there is no correlation between the presence of mecI gene and the resistance level in epidemic MRSA strains, but also that for most strains there were no significant changes on the resistance phenotype upon the mecI overexpression in trans. Interestingly, the two strains in which mecI overexpression affected the resistance expression were negative for the bla locus, suggesting that this locus may interfere directly with the MecI-mediated repression of mecA and account for those puzzling observations. In this master thesis we have explored this hypothesis using molecular biology strategies and phenotypic analysis of -lactam resistance. The data obtained demonstrate that the presence of a wild-type plasmid containing the bla locus not only disrupts the MecImediated repression, but also significantly enhances the expression of resistance. Several preliminary hypotheses were formulated to explain these observations and preliminary data, together with published evidence, support the working model that BlaI forms functional hetero-dimers with MecI, which upon induction are readily inactivated by BlaR1. These results provide new insights into the regulatory mechanism(s) of mecA and open new perspectives for the role of β-lactamase operon in the MRSA phenotype.