Moluscos bivalves em Portugal: composição química e metais contaminantes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Construção e caracterização de mutantes dirigidos da CbiKP de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Caracterização do perfil de expressão de microRNAs na miocardiopatia hipertrófica

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Transplante hepático sequencial com preservação da veia cava inferior (técnica de "Duplo Piggyback") : uma técnica original

RESUMO:Desde a declaração de Bethesda em 1983, a transplantação hepática é considerada um processo válido e aceite na prática clínica para muitos doentes com doença hepática terminal, relativamente aos quais não houvesse outra alternativa terapêutica. Em 1991, por proposta de Holmgren, professor de genética, o cirurgião sueco Bo Ericzon realizou em Huntingdon (Estocolmo) o primeiro transplante hepático num doente PAF (Polineuropatia Amilloidótica Familiar), esperando que a substituição do fígado pudesse frenar a evolução da doença. Nesta doença hereditária autossómica dominante, o fígado, apesar de estrutural e funcionalmente normal, produz uma proteína anormal (TTR Met30) responsável pela doença. A partir de então, a transplantação hepática passou a ser a única terapêutica eficaz para estes doentes. Portugal é o país do mundo com mais doentes PAF, tendo sido o médico neurologista português Corino de Andrade quem, em 1951, identificou e descreveu este tipo particular de polineuropatia hereditária, também conhecida por doença de Andrade. Com o início da transplantação hepática programada em Setembro de 1992, o primeiro doente transplantado hepático em Portugal, no Hospital Curry Cabral, foi um doente PAF. Desde logo se percebeu que a competição nas listas de espera em Portugal, entre doentes hepáticos crónicos e doentes PAF viria a ser um problema clínico e ético difícil de compatibilizar. Em 1995, Linhares Furtado, em Coimbra, realizou o primeiro transplante dum fígado dum doente PAF num doente com doença hepática metastática, ficando este tipo de transplante conhecido como transplante sequencial ou “em dominó”. Fê-lo no pressuposto de que o fígado PAF, funcional e estruturalmente normal, apesar de produzir a proteína mutada causadora da doença neurológica, pudesse garantir ao receptor um período razoável de vida livre de sintomas, tal como acontece na história natural desta doença congénita, cujas manifestações clínicas apenas se observam na idade adulta. A técnica cirúrgica mais adequada para transplantar o doente PAF é a técnica de “piggyback”, na qual a hepatectomia é feita mantendo a veia cava do doente, podendo o transplante ser feito sem recorrer a bypass extracorporal. Antes de 2001, para fazerem o transplante sequencial, os diferentes centros alteraram a técnica de hepatectomia no doente PAF, ressecando a cava com o fígado conforme a técnica clássica, recorrendo ao bypass extracorporal. No nosso centro imaginámos e concebemos uma técnica original, com recurso a enxertos venosos, que permitisse ao doente PAF submeter-se à mesma técnica de hepatectomia no transplante, quer ele viesse a ser ou não dador. Essa técnica, por nós utilizada pela primeira vez a nível mundial em 2001, ficou conhecida por Transplante Sequencial em Duplo Piggyback. Este trabalho teve como objectivo procurar saber se a técnica por nós imaginada, concebida e utilizada era reprodutível, se não prejudicava o doente PAF dador e se oferecia ao receptor hepático as mesmas garantias do fígado de cadáver. A nossa série de transplantes realizados em doentes PAF é a maior a nível mundial, assim como o é o número de transplantes sequenciais de fígado. Recorrendo à nossa base de dados desde Setembro de 1992 até Novembro de 2008 procedeu-se à verificação das hipóteses anteriormente enunciadas. Com base na experiência por nós introduzida, a técnica foi reproduzida com êxito em vários centros internacionais de referência, que por si provaram a sua reprodutibilidade. Este sucesso encontra-se publicado por diversos grupos de transplantação hepática a nível mundial. Observámos na nossa série que a sobrevivência dos doentes PAF que foram dadores é ligeiramente superior àqueles que o não foram, embora sem atingir significância estatística. Contudo, quando se analisaram, apenas, estes doentes após a introdução do transplante sequencial no nosso centro, observa-se que existe uma melhor sobrevida nos doentes PAF dadores (sobrevida aos 5 anos de 87% versus 71%, p=0,047).Relativamente aos receptores observámos que existe um benefício a curto prazo em termos de morbi-mortalidade (menor hemorragia peri-operatória) e a longo prazo alguns grupos de doentes apresentaram diferenças de sobrevida, embora sem atingir significância estatística, facto este que pode estar relacionado com a dimensão das amostras parcelares analisadas. Estes grupos são os doentes com cirrose a vírus da hepatite C e os doentes com doença hepática maligna primitiva dentro dos critérios de Milão. Fora do âmbito deste trabalho ficou um aspecto relevante que é a recidiva da doença PAF nos receptores de fígado sequencial e o seu impacto no longo prazo. Em conclusão, o presente trabalho permite afirmar que a técnica por nós introduzida pela primeira vez a nível mundial é exequível e reprodutível e é segura para os doentes dadores de fígado PAF, que não vêem a sua técnica cirúrgica alterada pelo facto de o serem. Os receptores não são, por sua vez, prejudicados por receberem um fígado PAF, havendo mesmo benefícios no pós-operatório imediato e, eventualmente, alguns grupos específicos de doentes podem mesmo ser beneficiados.---------ABSTRACT: Ever since Bethesda statement in 1983, Liver Transplantation has been accepted as a clinical therapeutic procedure for many patients with advanced hepatic failure Holmgren, professor of genetics, suggested that one could expect that transplanting a new liver could lead to improve progressive neurological symptoms of Familial Amyloidotic Polyneuropathy (PAF). Bo Ericzon, the transplant surgeon at Huddinge Hospital in Stockholm, Sweden, did in 1991 the first Liver Transplant on a FAP patient. FAP is an inherited autosomal dominant neurologic disease in which the liver, otherwise structural an functionally normal, produces more than 90% of an abnormal protein (TTR Met30) whose deposits are responsible for symptoms. Liver Transplantation is currently the only efficient therapy available for FAP patients. Portugal is the country in the world where FAP is most prevalent. The Portuguese neurologist Corino de Andrade was the first to recognize in 1951 this particular form of inherited polyneuropathy, which is also known by the name of Andrade disease. Liver Transplantation started as a program in Portugal in September 1992. The first patient transplanted in Lisbon, Hospital Curry Cabral, was a FAP patient. From the beginning we did realize that competition among waiting lists of FAP and Hepatic patients would come to be a complex problem we had to deal with, on clinical and ethical grounds. There was one possible way-out. FAP livers could be of some utility themselves as liver grafts. Anatomically and functionally normal, except for the inherited abnormal trace, those livers could possibly be transplanted in selected hepatic patients. Nevertheless the FAP liver carried with it the ability to produce the mutant TTR protein. One could expect, considering the natural history of the disease that several decades would lapse before the recipient could suffer symptomatic neurologic disease, if at all. In Coimbra, Portugal, Linhares Furtado performed in 1995 the first transplant of a FAP liver to a patient with metastatic malignant disease, as a sequential or “domino” transplant. FAP Liver Transplant patients, because of some dysautonomic labiality and unexpected reactions when they are subjected to surgery, take special advantage when piggyback technique is used for hepatectomy. This technique leaves the vena cava of the patient undisturbed, so that return of blood to the heart is affected minimally, so that veno-venous extracorporeal bypass will not be necessary. The advantages of piggyback technique could not be afforded to FAP patients who became donors for sequential liver transplantation, before we did introduce our liver reconstruction technique in 2001. The hepatectomy took the vena cava together with the liver, which is the classical technique, and the use of extracorporeal veno-venous bypass was of necessity in most cases. The reconstruction technique we developed in our center and used for the first time in the world in 2001 consists in applying venous grafts to the supra-hepatic ostia of piggyback resected FAP livers so that the organ could be grafted to a hepatic patient whose liver was itself resected with preservation of the vena cava. This is the double piggyback sequential transplant of the liver. It is the objective of this thesis to evaluate the results of this technique that we did introduce, first of all that it is reliable and reproducible, secondly that the FAP donor is not subjected to any additional harm during the procedure, and finally that the recipient has the same prospects of a successful transplant as if the liver was collected from a cadaver donor. Our series of liver transplantation on FAP patients and sequential liver transplants represent both the largest experience in the world. To achieve the analysis of the questions mentioned above, we did refer to our data-base from September 1992 to November 2008. The reconstructive technique that we did introduce is feasible: it could be done with success in every case ion our series. It is also reproducible. It has been adopted by many international centers of reference that did mention it in their own publications. We do refer to our data-base in what concerns the safety for the FAP donor.Five years survival of FAP transplanted patients that have been donors (n=190) has been slightly superior to those who were not (n=77), with no statistical significance. However, if we consider five year survival of FAP transplanted patients after the beginning of sequential transplant program in our center, survival is better among those patients whose liver was used as a transplant (87% survival versus 71%, p=0.047). In what concerns recipients of FAP livers: Some short-term benefit of less perioperative morbi-mortality mainly less hemorrhage. In some groups of particular pathologies, there is a strong suggestion of better survival, however the scarcity of numbers make the differences not statistically significant. Patients with cirrhosis HVC (83% versus73%) and patients with primitive hepatic cancer within Milan criteria (survival of 70% versus 58%) are good examples. There is one relevant problem we left beyond discussion in the present work: this is the long-term impact of possible recurrence of FAP symptoms among recipients of sequential transplants. In Conclusion: The reconstruction technique that we did develop and introduce is consistently workable and reproducible. It is safe for FAP donors with the advantage that removal of vena cava can be avoided. Hepatic patients transplanted with those livers suffer no disadvantages and have the benefit of less hemorrhage. There is also a suggestion that survival could be better in cirrhosis HVC and primary liver cancer patients.

Comparison of different techniques for mouse transgenesis

RESUMO: O uso de ratinhos transgénicos em neurociências aumentou consideravelmente nos últimos anos devido ao crescente interesse em compreender o cérebro e a necessidade de solucionar situações clínicas do foro neurológico e psiquiátrico. Para esse efeito, diferentes métodos de produção de animais transgénicos têm sido testados. O objectivo desta tese foi comparar métodos de integração aleatória de um transgene no genoma de ratinhos em termos de eficiência, estabilidade da integração do transgene, número de animais e de horas de trabalho necessárias para cada método. Assim, foi comparado o método mais utilizado - microinjecção pronuclear (PNMI) - com duas outras técnicas cujo desempenho foi considerado promissor – a transferência génica através dos testículos por electroporação e transfecção por lentivírus in vivo. As três técnicas foram realizadas usando um gene repórter sob o controlo de um promotor constitutivo, e depois reproduzidas usando um gene de interesse de modo a permitir obtenção de um animal capaz de ser usado em experimentação laboratorial. O transgene de interesse utilizado codifica uma proteína de fusão correspondendo a uma variante da rodopsina (channelrhodopsin) fundida à proteína enhanced yellow fluorescente protein ((EYFP) resultando num produto designado ChR2-EYFP. Este animal transgénico apresentaria expressão deste canal iónico apenas em células dopaminergicas, o que, com manipulação optogenética, tornaria possivel a activação especifica deste grupo de neurónios e, simultaneamente, a observação do impacto desta manipulação no comportamento num animal em livre movimento. Estas ferramentas são importantes na investigação básica em neurociências pois ajudam a esclarecer o papel de grupos específicos de neurónios e compreender doenças como a doença de Parkinson ou a esquizofrenia onde a função de certos tipos de neurónios de encontra alterada. Quando comparados os três métodos realizados verifica-se que usando um gene repórter PMNI resulta em 31,3% de, a de animais transgénicos obtidos, a electroporação de testículos em 0% e a injecção de lentivírus em 0%. Quando usado o gene de interesse, os resultados obtidos são, respectivamente, 18,8%, 63,9% e 0%.--------------ABSTRACT: The use of transgenic mice is increasing in all fields of research, particularly in neuroscience, due to the widespread need of animal models to solve neurological and psychiatric medical conditions. Different methodologies have been tested in the last decades in order to produce such transgenic animals. The ultimate goal of this thesis is to compare different methods of random integration of a transgene in the genome of mice in terms of efficiency, stability of the transgene integration, number of animals required and the labour intensity of each technique. We compared the most used method – pronuclear microinjection (PNMI) – with two other promising techniques – Testis Mediated Gene Transfer (TMGT) by electroporation and in vivo lentiviral transfection. The three techniques were performed using a reporter gene – green fluorescent protein (GFP), whose transcription was driven by the constitutive cytomegalovirus (CMV) promoter. These three techniques were later reproduced using the tyrosine hydroxylase promoter (TH) and the neuronal manipulator, channelrhodopsin-2 fused to the enhanced yellow fluorescent reporter protein (ChR2-EYFP). The transgenic animal we sough to produce would express the light driven channel only in dopaminergic cells, making possible to specifically activate this group of neurons, while simultaneously observe the behaviour in a freely moving animal. This is a very important tool in basic neuroscience research since it helps to clarify the role of specific groups of neurons, map circuits in the brain, and consequently understand neurological diseases such as Parkinson’s disease or schizophrenia, where the function of certain types of neurons is affected. When comparing the three methods, it was verified that using a reporter gene PNMI resulted in 31.3% of transgenic mice obtained, testis electroporation in 0% and lentiviral injection in 0%. When using the gene of interest, the results obtained were, respectively, 18.8%, 63.9% and 0%.

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carotídeo (CB) é um pequeno órgão sensível a variações na PaO2, PaCO2 e pH. As células tipo I (células glómicas) do corpo carotídeo, as unidades sensoriais deste órgão, libertam neurotransmissores em resposta às variações dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pré-sinápticos, localizados nas células tipo I, quer em recetores póssinápticos, localizados nas terminações do nervo do seio carotídeo, ou em ambos. A activação dos recetores pré-sinápticos modula a atividade do corpo carotídeo, enquanto que, a activação dos recetores pós-sinápticos, de carater excitatório, desencadeia um aumento da frequência de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolarização dos neurónios do gânglio petroso, e posterior despolarização de um grupo específico de neurónios do centro respiratório central, desencadeando, como resposta final, hiperventilação. Estes recetores pré- e pós-sinápticos podem ser classificados em ionotrópicos ou metabotrópicos, estando os últimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as variações dos gases arteriais são detetadas pelo CB não se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que alterações nos níveis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de deteção de variações de O2 e CO2. Os níveis de cAMP podem ser regulados através da sua via de síntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sensível aos eurotransmissores e adenilato ciclase solúvel (sAC)sensível a variações de HCO3/CO2, e pela sua via de degradação mediada por fosfodiesterases. A via de degradação do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terapêutico para o tratamento de patologias do foro respiratório (e.g. asma, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstructiva crónica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta dissertação partiu da hipótese de que a actividade do CB é manipulada por fármacos, que interferem com a via de sinalização do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdução do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas responsáveis pela via de sinalização do cAMP é ou não regulada por variações de O2/CO2. Assim, a relevância deste trabalho é a de estudar e identificar possíveis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respiratório. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracterização farmacológica da PDE4 no CB e em tecidos não quimiorecetores (e.g. gânglio cervical superior e artérias carótidas), e na observação do efeito de hipóxia aguda na acumulação dos níveis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantificação de cAMP foi efectuada por técnica imunoenzimática (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, não específicos (IBMX) e específicos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos níveis de cAMP acumulados, em situações de normóxia (20%O2/5%CO2) e hipóxia (5%O2/5%CO2). A caracterização das PDE no gânglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a técnica de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) em culturas primárias de neurónios, na presença de inibidores não específicos (IBMX) e específicos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, através de RT-qPCR, as alterações na expressão de PDE3A-B e PDE4A-D, no gânglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxigénio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de síntese do cAMP no CB em resposta a variações na concentração de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracterização da sAC, dado que a sua actividade é regulada por variações de HCO3/CO2. A caracterização da expressão e regulação da sAC, em resposta a variações de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos não quimioreceptores periféricos (e.g. gânglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente através da quantificação dos níveis de cAMP (quantificação por EIA), induzidos por diferentes concentrações de HCO3/CO2, na presença de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A expressão das isoformas da tmAC no CB e gânglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estudámos a contribuição relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as alterações: 1) nos níveis de cAMP (quantificado por EIA) na presença de diferentes concentrações de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativação da proteína cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em células tipo I do CB; e 3) na frequência de descarga do CSN (registos) na presença e ausência de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por último, foi caracterizada a expressão e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) através de técnicas de RT-qPCR e EIA. A expressão das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus através de RT-qPCR. Por fim, comparámos a contribuição da tmAC e sAC nos níveis de cAMP no locus coeruleus em condições de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 está funcional no corpo carotídeo, artérias carótidas e gânglio cervical superior de rato, embora a PDE2 só se encontre funcional neste último; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos níveis de acumulação de cAMP foram exacerbados em situações de hipóxia aguda no CB e artérias carótidas, mas foram atenuados no gânglio cervical superior; 3) No gânglio cervical superior, diferentes tipos de células apresentaram uma caracterização específica de PDEs, sugerindo uma subpopulação de células neste gânglio com funções fisiológicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no gânglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incubações de gânglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxigénio, não alteraram (não regularam) significativamente a expressão das diferentes isoformas de PDE neste órgão; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior expressão no CB comparativamente aos restantes orgãos estudados, exceptuando os testículos, orgão controlo. Variações de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os níveis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentrações acima dos 24mM HCO3/5%CO2 não induziram alterações nos níveis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condições fisiológicas (normocapnia) e que este enzima não desempenha qualquer papel na deteção de situações de hipercapnia; 6) No CB, a expressão das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 é mais elevada comparativamente à expressão da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500μM, 2’5’-ddADO, 30-300μM, SQ 22536, 200μM) e da sAC (KH7, 10-100μM) para estudar a contribuição relativa destes enzimas na acumulação do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumulação dos níveis de cAMP em condições de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condições de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condições de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situações de hipocapnia; 8) Não se observaram variações nos níveis de cAMP em resposta a diferentes concentrações de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibitório induzido por ddADO e KH7 foi sobreponível após 5 ou 30 minutos de incubação em todas as concentrações de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por último, verificou-se um aumento na frequência da descarga do nervo do seio carotídeo entre as condições de normocapnia e hipercapnia acídica. Ao contrário do KH7 (10μM), o 2’5’-ddADO reduziu significativamente a frequência de descarga do nervo, quer em condições de normocapnia quer de hipercapnia acídica. Contudo, não se verificou aumento na frequência de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isohídrica, sugerindo que a sensibilidade à hipercapnia no CB é mediada por variações de pH. Em conclusão, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinalização do cAMP possam ser bons alvos terapêuticos em condições particulares, a sua actividade não é específica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP não é um mediador específico da transdução à hipercapnia neste orgão. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os níveis de cAMP são mais elevados em condições fisiológicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma função homeostática neste orgão. Por último, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condições de hipercapnia, não são observáveis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ.

Produção de partículas semelhantes a retrovírus como candidatas a vacina para a Hepatite C

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Determinação do valor tecnológico e de utilização de vários tipos de misturas de farinha de trigo mole e sêmola de trigo duro para o fabrico de pão tradicional

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Anti-apolipoprotein A-I antibodies in the pathogenesis of Alzheimer disease : project plan

RESUMO: A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência em todo o mundo e sua prevalência deverá duplicar até 2050. Os mecanismos precisos responsáveis pela AD são desconhecidas mas as características histopatológicas estão bem caracterizadas. A hipótese mais importante para a perda neuronal e declínio cognitivo na AD é a cascata amilóide que indica que AD é o resultado da sobreprodução de beta amilóide (Aβ) e / ou remoção ineficaz; a acumulação do BA no cérebro seria o passo crítico na patogénese da AD. Actualmente, a identificação de proteínas que se ligam ao Aβ e modulam a sua agregação e neurotoxicidade pode proporcionar a base para novas abordagens terapêuticas. A apolipoproteína AI (ApoA-I), o principal componente das HDL humanas, interage com o domínio extracelular da proteína precursora de amilóide (APP), bem como com o Aβ. Estudos epidemiológicos têm mostrado uma diminuição acentuada da ApoA-I plasmática em doentes com AD, com uma correlação inversa entre o nível de ApoA-I e o risco de AD. Este trabalho pretende apresentar um projecto que tem como objectivo investigar se os anticorpos anti-apo AI podem impedir a formação de complexos Aβ / ApoA-I, bloqueando o efeito protector da ApoA-I. A hipótese baseia-se na possibilidade dos doentes com AD terem anticorpos anti-ApoA-I plasmáticos e de estes poderem interferir com a formação do complexo no LCR.------- ABSTRACT:Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia world-wide and its prevalence is expected to double by the year 2050. The precise mechanisms responsible for AD are unknown but the histopathologic features are well-characterised. The most compelling hypothesis for neuronal loss and cognitive decline in AD is the amyloid cascade hypothesis which states that AD is the result of amyloid beta (Aβ) overproduction and/or ineffective clearance and its accumulation in the brain would be the critical step in AD pathogenesis. Currently, identification of proteins that bind Aβ and modulate its aggregation and neurotoxicity could provide the basis for novel treatment approaches. Apolipoprotein A-I (ApoA-I), the main constituent of human HDL, ApoA-I interacts with the extracellular domain of amyloid precursor protein (APP), as well as with Aβ itself. Epidemiological studies have shown a marked decrease of plasma ApoA-I levels in AD patients, with an inverse correlation between the ApoA-I level and the risk of AD. This work intends to present a project that aims to investigate if anti-ApoA-I antibodies may prevent the formation of the Aβ /ApoA-I complex and by doing so blocking the protective effect of ApoA-I in AD. We base the hypothesis on the possibility that patients with AD might have anti-ApoA-I antibodies in plasma and that these can interfere with the complex formation in the cerebrospinal fluid (CSF).

Caracterização estrutural de enzimas de molibdénio e suas chaperonas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Proteínas recombinantes de Plasmodium Falciparum para deteção de malária por nanoimunoensaios

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

C-reactive protein in early risk assessment in acute pancreatitis

ABSTRACT:C-reactive protein (CRP) has been widely used in the early risk assessment of patients with acute pancreatitis (AP), but unclear aspects about its prognostic accuracy in this setting persist. This project evaluated first CRP prognostic accuracy for severity, pancreatic necrosis (PNec), and in-hospital mortality (IM) in AP in terms of the best timing for CRP measurement and the optimal CRP cutoff points. Secondly it was evaluated the CRP measured at approximately 24 hours after hospital admission (CRP24) prognostic accuracy for IM in AP individually and in a combined model with a recent developed tool for the early risk assessment of patients with AP, the Bedside Index for Severity in AP (BISAP). Two single-centre retrospective cohort studies were held. The first study included 379 patients and the second study included 134 patients. Statistical methods such as the Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit test, the area under the receiver-operating characteristic curve, the net reclassification improvement, and the integrated discrimination improvement were used. It was found that CRP measured at approximately 48 hours after hospital admission (CRP48) had a prognostic accuracy for severity, PNec, and IM in AP better than CRP measured at any other timing. It was observed that the optimal CRP48 cutoff points for severity, PNec, and IM in AP varied from 170mg/l to 190mg/l, values greater than the one most often recommended in the literature – 150mg/l. It was found that CRP24 had a good prognostic accuracy for IM in AP and that the cutoff point of 60mg/l had a negative predictive value of 100%. Finally it was observed that the prognostic accuracy of a combined model including BISAP and CRP24 for IM in AP could perform better than the BISAP alone model. These results might have a direct impact on the early risk assessment of patients with AP in the daily clinical practice.--------- RESUMO: A proteina c-reactiva (CRP) tem sido largamente usada na avaliação precoce do risco em doentes com pancreatite aguda (AP), mas aspectos duvidosos acerca do seu valor prognóstico neste contexto persistem. Este projecto avaliou primeiro o valor prognóstico da CRP para a gravidade, a necrose pancreática (PNec) e a mortalidade intra-hospitalar (IM) na AP em termos do melhor momento para efectuar a sua medição e dos seus pontos-de-corte óptimos. Em segundo lugar foi avaliado o valor prognóstico da proteína c-reactiva medida aproximadamente às 24 horas após a admissão hospitalar (CRP24) para a IM na AP isoladamente e num modelo combinado, que incluiu uma ferramenta de avaliação precoce do risco em doentes com AP recentemente desenvolvida, o Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis (BISAP). Dois estudos unicêntricos de coorte retrospectivo foram realizados. O primeiro estudo incluiu 379 doentes e o segundo estudo incluiu 134 doentes. Metodologias estatísticas como o teste de Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit, a area under the receiver-operating characteristic curve, o net reclassification improvement e o integrated discrimination improvement foram usadas. Verificou-se que a CRP medida às 48 horas após a admissão hospitalar (CRP48) teve um valor prognóstico para a gravidade, a PNec e a IM na AP melhor do que a CRP medida em qualquer outro momento. Observou-se que os pontos de corte óptimos da CRP48 para a gravidade, a PNec e a IM na AP variaram entre 170mg/l e 190mg/l, valores acima do valor mais frequentemente recomendado na literatura – 150mg/l. Verificou-se que a CRP medida aproximadamente às 24 horas após a admissão hospitalar (CRP24) teve um bom valor prognóstico para a IM na AP e que o ponto de corte 60mg/l teve um valor preditivo negativo de 100%. Finalmente observou-se que o valor prognóstico de um modelo combinado incluindo o BISAP e a CRP24 para a IM na AP pode ter um desempenho melhor do que o do BISAP isoladamente. Estes resultados podem ter um impacto directo na avaliação precoce do risco em doentes com AP na prática clínica diária.

Avaliação da toxicidade do fármaco anti-HIV abacavir: síntese e caracterização estrutural de possíveis biomarcadores

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Bioorgânica

New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

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