Produção de partículas semelhantes a retrovírus como candidatas a vacina para a Hepatite C

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Vírus da Hepatite C (HCV) infeta mais de 170 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo uma das principais causas de cancro do fígado. Como tal, é extremamente importante e desejável a criação de uma vacina. Recentemente têm vindo a ser desenvolvidas e comercializadas vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLPs) capazes de estimular respostas humorais e celulares eficientes. Os objetivos deste trabalho consistiram no melhoramento de linhas celulares produtoras de VLPs derivadas de retrovírus e no melhoramento da qualidade das partículas virais, com o intuito de produzir VLPs candidatas a vacina para a hepatite C. Para tal, utilizaram-se duas metodologias. Um sistema de troca de cassette (RMCE), que é um sistema versátil e rápido para o desenvolvimento de linhas celulares, permitindo obter uma elevada expressão de um gene de interesse, tendo sido utilizado para expressar os epítopos do HCV. Testaram-se dois sistemas, um mediado pela enzima Cre e outro mediado pela enzima Flipase. Para o melhoramento da qualidade das partículas utilizou-se a metodologia de silenciamento por RNAi para eliminar a incorporação da tetraspanina CD63, uma vez que a presença desta proteína nas VLPs poderá desencadear respostas imunológicas inespecíficas. Verificou-se que o sistema de troca de cassette mediado pela enzima Cre não foi eficiente nas condições experimentais utilizadas, não tendo sido possível produzir VLPs pseudotipadas com os epítopos do HCV. No sistema mediado pela enzima Flipase a troca de cassette foi eficiente obtendo-se clones que expressam as proteínas E1 e E2, para a produção de VLPs pseudotipadas com o envelope do vírus HCV. Em relação ao silenciamento da tetraspanina CD63 apesar de serem testadas diversas condições, a percentagem de silenciamento obtida foi muito reduzida e instável, concluindo-se não ser possível realizar o silenciamento desta proteína através das sequências utilizadas.