CONTRIBUIÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ONICOMICOSES

Onicomicose ou infecção fúngica das unhas das mãos ou dos pés pode ser provocada por fungos que invadem primariamente a lâmina ungueal saudável. Embora existam outros agentes, como por exemplo bactérias, que podem causar infecções ungueais, as infecções causadas por fungos são mais frequentes e são consideradas uma das principais onicopatias do homem. Os efeitos psicológicos e emocionais que resultam dos aspectos clínicos da onicomicose podem ser marcantes e ter um impacto significativo na qualidade de vida dos portadores. É uma doença com grande potencial crónico associada a uma séria dificuldade terapêutica, sendo estes os principais factores agravantes do seu prognóstico. Conforme a extensão do comprometimento e a porção da unha envolvida na onicomicose, a infecção causada por fungos pode ser classificada em 5 tipos: onicomicose subungueal distal e lateral, onicomicose superficial leitosa, onicomicose subungueal proximal, onicomicose com distrofia total e onicomicose por candidose. São causadas por diferentes agentes etiológicos sendo que os mais comuns são os fungos dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras (5 a 17%) e fungos filamentosos não dermatófitos (2 a 12%). Neste trabalho foram estudadas 54 amostras recolhidas de unhas de doentes com hipótese clínica de onicomicose, das quais 25,93% (14/54) pertenciam a indivíduos do sexo masculino e 74,07% (40/54) a indivíduos do sexo feminino. As técnicas convencionais de diagnóstico são morosas e muitas vezes de difícil caracterização a nível fenotipico, o que condiciona grandemente a implementação da terapêutica adequada. O presente trabalho teve como principal objectivo a aquisição de conhecimentos que permitissem um correcto diagnóstico micológico das onicomicoses, através do isolamento e identificação das espécies de fungos causadoras de infecção. De uma forma global, consistiu inicialmente no isolamento e posteriormente na identificação dos agentes etiológicos de onicomicoses, utilizando para tal metodologias convencionais e moleculares. Foi realizado o diagnóstico laboratorial baseado no exame directo e na cultura de fragmentos de unhas provenientes de doentes com infecção. Paralelamente, foi extraído o DNA fúngico das mesmas amostras clínicas que, após amplificação da região ITS dos genes ribossómicos foi utilizado para confirmação e comparação dos resultados. Foi igualmente estudada a ocorrência de fungos não dermatófitos responsáveis por onicomicose. Os métodos moleculares de diagnóstico podem não só constituir uma alternativa mais rápida de diagnóstico micológico como também, por serem mais sensíveis, permitir a detecção de espécies que, por serem de crescimento fastidioso, não se desenvolvem em cultura.

Sentido de coerência : ligação materno-fetal e estilo de vida da mulher durante a gravidez

RESUMO - Um dos grandes desafios actuais enfrentados pela Saúde Pública diz respeito ao fardo representado pelas doenças crónicas não transmissíveis enquanto co-responsáveis pela maioria das mortes que ocorrem no mundo, pela significativa e progressiva redução da qualidade de vida e aumento das incapacidades dos indivíduos afectados e por uma fasquia bastante elevada das despesas em saúde. Entretanto, a complexa dinâmica genética, biológica, psicológica, afectiva, sócio-cultural e ambiental que envolve o comportamento humano, tão amplamente relacionado com algumas destas doenças – doenças cardiovasculares, alguns tipos de cancro, obesidade, hipertensão, diabetes e doenças osteo-articulares – impõe o desafio constante da busca de novas e efectivas intervenções em promoção da saúde que influenciem positivamente os estilos de vida dos indivíduos, dos grupos e das comunidades. Sendo o sentido de coerência um traço da personalidade do indivíduo desenvolvido sob a influência directa ou indirecta dos mesmo factores acima referidos, o estabelecimento de uma relação entre este constructo e os comportamentos humanos pode revelar-se promissor para a elaboração de novas intervenções em promoção da saúde. Por sua vez, a gravidez, talvez por influência da ligação materno-fetal, pode representar um ponto de viragem na vida da mulher no que respeita ao sentido de coerência e aos comportamentos de saúde e um bom começo na vida do bebé que irá nascer sob a influência dos mesmos. Com a finalidade de contribuir para a construção de intervenções efectivas em promoção da saúde, através da descoberta de prováveis potencialidades salutogénicas dos constructos referidos – sentido de coerência e ligação materno-fetal –, foi desenvolvido um estudo quantitativo, observacional que teve por objectivos: ampliar o conhecimento sobre as mudanças do sentido de coerência no decorrer da vida, especificamente durante a gravidez; ampliar o conhecimento acerca das relações de alguns factores de natureza sócio-demográfica, psico-afectiva e obstétrica com o sentido de coerência das mulheres grávidas e com a ligação materno-fetal; e identificar possíveis relações entre o sentido de coerência, a ligação materno-fetal e o estilo de vida das mulheres grávidas, este último representado pelos hábitos alimentares, consumo de cafeína, consumo de álcool, hábitos tabágicos, prática regular de actividade física e ganho de peso durante a gravidez. O presente relatório descreve a concepção e os resultados deste estudo, que envolveu a uma amostra de 61 mulheres grávidas que estavam a ser acompanhadas nos serviços de saúde materna dos Centros de Saúde de Carnaxide extensão Linda-a-Velha e de Oeiras, no Distrito de Lisboa, Portugal, entre os meses de Fevereiro e Julho de 2005. Os resultados demonstram que, para a amostra de 61 mulheres grávidas que responderam ao inquérito por questionário de auto-resposta, foram encontradas associações estatisticamente significativas entre o sentido de coerência e a escolaridade e entre o sentido de coerência e a percepção do próprio estado de saúde. Além disso, foi encontrada alguma evidência das associações entre o sentido de coerência e a faixa etária, estado civil e rendimento mensal familiar e foi observada alguma tendência para que as mulheres grávidas com níveis de sentido de coerência mais elevados consumissem menos álcool do que as mulheres grávidas com níveis de sentido de coerência inferiores. Entretanto, as demais associações testadas não foram confirmadas. Relativamente à ligação materno-fetal, foram encontradas, para a amostra de 41 mulheres grávidas que participaram do segundo momento de colheita de dados do estudo, entre a 20ª e a 24ª semanas de gravidez, associações estatisticamente significativas com a escolaridade e o nível de rendimento familiar das mulheres grávidas, não tendo sido confirmadas as demais associações testadas. Embora não tenham sido estatisticamente evidenciadas as relações entre o sentido de coerência e a ligação materno-fetal e entre estes e os comportamentos de saúde, o carácter preliminar destes resultados, devido à subjectividade do processo de selecção não probabilístico da amostra estudada e à reduzida dimensão desta amostra, e a escassez de estudos descritos na literatura fazem com que seja prudente a realização de estudos de follow-up, com amostras de maiores dimensões, aleatórias e representativas da população, para que sejam estabelecidas quaisquer conclusões acerca destas questões.-----------------------------ABSTRACT - One of the greatest challenges faced by Public Health in nowadays is the burden represented by chronic diseases as co-responsible for the majority of deaths that occurs in the world, for the meaningful and progressive reduction of quality of life and increase of disabilities in affected individuals and for an important part of health expenses. However, the complexity of the genetic, biological, psychological, emotional, social, cultural and environmental dynamics that involves human behaviours related to some of these diseases – cardiovascular diseases, some kind of cancers, obesity, hypertension, diabetes and joint and bone diseases – poses the continuous challenge of searching for new and effective interventions of health promotion that positively influence individuals, groups and community lifestyles. Due to the fact that sense of coherence is an individual personality trace directly or indirectly influenced by the same factors listed above, the discovery of a relationship between this construct and human behaviours might be promising to the creation of new health promotion interventions. On the other hand, pregnancy may represent a turn point to the mother’s life and a good start in the baby’s life in relation to sense of coherence and health behaviours and It might occur because of the influence of maternal-fetal attachment. With the purpose of contributing with the creation of effective health promotion interventions through the discovery of probable salutogenic potentials in the referred constructs – sense of coherence and maternal-fetal attachment – , it was developed a quantitative observational study with the following objectives: to increase knowledge about changes in sense of coherence throughout life, specifically during pregnancy; to increase knowledge about the relationship between sense of coherence and maternal-fetal attachment and some social, demographical, psychological, emotional and obstetric factors of pregnant women; to identify probable relationships between sense of coherence, maternal-fetal attachment and pregnant women’s lifestyles, represented by diet habits, caffeine consumption, alcohol consumption, smoking habits, physical activity habits and weigh gain during pregnancy. This report describes the structure and the findings of this study involving a sample of 61 pregnant women who had been followed by health professionals in the mother health services of Carnaxide (Linda-a-Velha unity) and Oeiras Health Centres, in Lisbon, Portugal, between February and July of 2005. The results show that, for the 61 pregnant women who filled the self-reported questionnaire, it was found a statistically significant association between sense of coherence and education level. It was also found some evidence of the associations between sense of coherence and age, marital status and mensal household income and a trend toward pregnant women with higher levels of sense of coherence to drink less alcoholic beverages than pregnant women with lower levels of sense of coherence. However, the others associations tested were not confirmed. Regarding maternal-fetal attachment, it was found, for the sample of 41 women who participated in the second moment of data collection, between the 20th and the 24th week of pregnancy, statistically significant associations with education level and mensal household income. The others associations tested were not confirmed. Although the associations between sense of coherence and maternal-fetal attachment and between these constructs and health behaviours were not confirmed, all findings presented here are considered preliminary because of small dimension of sample and non-probabilistic criteria used for sample selection. What’s more, there are almost no studies described in the literature which could confirm or contradict these findings. Therefore, it is better to be careful and develop follow-up studies, with bigger and representative of population samples, before draw any conclusions about these theme.

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The role of complex chromosome translocations in leukemia

Resumo A tumorigénese é um processo de transformação celular que se desenrola tipicamente em várias etapas. Os diferentes níveis de evolução tumoral resultam da acumulação sucessiva de mutações genéticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutações podem manifestar-se sob a forma de alterações nucleotídicas pontuais ao nível da sequência de DNA, levando a uma desregulação da função proteíca ou à formação de proteínas não-funcionais, ou através de alterações cromossómicas numéricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes híbridos que resultam de translocações cromossómicas desempenham um importante papel no processo tumorigénico. Estes genes são transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fusão, o qual é traduzido numa proteína híbrida com função oncogénica. Frequentemente, os subtipos de doença leucémica estão associados com translocações cromossómicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e específicos. É disto exemplo a leucemia mielóide crónica, em que uma translocação recíproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz à formação de um gene de fusão BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doença, existe também uma pequena proporção de casos que apresenta translocações cromossómicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizações genómicas além das que estão implicadas na formação dos genes de fusão. Por vezes, os pontos de quebra estão também associados a delecções extensas de material genético que se pensa terem uma função importante na tumorigénese. No entanto, o papel destas regiões genómicas no desenvolvimento tumoral não tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertação foi o de determinar o potencial papel tumorigénico de alterações génicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocações cromossómicas complexas. Para a prossecução do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossómicos distintos associados com diferentes tipos de doença hematológica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblástica aguda de células B (2 casos), leucemia mielóide aguda, neoplasma mieloproliferativo e síndrome mielodisplásico/neoplasma ieloproliferativo, não classificável. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridação fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informação inicial da análise citogenética. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita às funções de controlo da proliferação celular e de regulação transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocações complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocação dicêntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de delecções extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocações estavam associadas com a presença de genes de fusão recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocações t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblástica aguda de células B e a leucemia mielóide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Através da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequência de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocação. Além dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequência de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo à sua haplo-insuficiência nas células com t(9;11;19). Através de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificámos que o gene CCDC94 é expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A análise informática da sequência prevista da proteína CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminoácidos com a proteína cwf16, envolvida na regulação do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Através da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expressão, e após a transfecção destes em culturas de linhas celulares in vitro, observámos que este gene codifica uma proteína de localização exclusivamente nuclear. A expressão ectópica da proteína CCDC94 diminuiu a progressão do ciclo celular e a proliferação das células em cultura. Inversamente, a supressão do transcrito do gene CCDC94 através de interferência de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferação celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferação e a progressão do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocações cromossómicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficiência de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a acção das proteínas de fusão para proporcionar ao clone leucémico uma proliferação celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados não foram identificados genes de fusão. Ao invés, todos aqueles apresentaram delecções de extensão variável associadas com os pontos de quebra cromossómicos. No caso com t(12;6;15), identificámos uma delecção de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminação de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrição que é essencial para a formação das diferentes linhagens hematopoiéticas na medula óssea, enquanto CDKN1B é traduzido numa proteína responsável por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferação celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultânea de ETV6 e de CDKN1B, através de uma translocação cromossómica complexa, constituiu uma acção cooperativa na leucemogénese. A mesma noção pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrição importantes na linhagem hematopoiética, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossómico. Dado que o factor de transcrição PAX5 regula negativamente a expressão do gene FLT3, que desempenha uma função pró-proliferativa, é expectável que a haplo-insuficiência de PAX5 no caso com dic(9;12) terá tido como consequência uma elevação dos níveis de expressão de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferação celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitémia essencial (TE), uma doença que está intimamente relacionada com alterações de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, através da utilização de um array genómico, identificámos a presença de pequenas delecções associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a delecção tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam proteínas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiéticas. Dado que NFATC2 se localiza numa região que constitui um alvo frequente de delecções em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitémia essencial,efectuámos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferação megacariocítica e na regulação da expressão de uma citocina hematopoiética (GM-CSF), implicada na maturação das diferentes linhagens mielóides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitémia essencial, verificámos que a supressão do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferência de RNA, estava associada com um aumento da proliferação celular. Em concordância, o bloqueio da activação da proteína NFATC2 através de um inibidor específico da sua interacção com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferação celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produção do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrição NFATC2 pode regular negativamente a expressão de GM-CSF em células de trombocitémia essencial. No geral, estes resultados mostram que a redução dos níveis fisiológicos do transcrito NFATC2, ou a redução da respectiva actividade proteica, estão relacionados com a proliferação de megacariocitos através do aumento da produção de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificámos que as células dos doentes com TE apresentam níveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a população normal. Dado que o factor de transcrição MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, é plausível que a haplo-insuficiência dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossómico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patogénese da trombocitémia essencial através da alteração do padrão normal de expressão das citocinas hematopoiéticas. Em síntese, efectuámos nesta dissertação um estudo citogenético de 4 translocações cromossómicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocação dicêntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematológicos. Em casos seleccionados efectuámos também um estudo molecular detalhado das regiões dos pontos de quebra. Esta análise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficiência pode promover o aumento da proliferação celular das células leucémicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noções principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocações complexas associadas com a formação de genes de fusão, podem ter como consequência a desregulação de genes controladores da proliferação celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocações complexas caracterizadas pela ausência de genes de fusão recorrentes poderão estar preferencialmente associadas com a presença de delecções, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situações, serão necessários pelo menos 2 genes com funções celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemogénese. Nestes termos, o modelo de alterações genéticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substituído por um modelo em que vários genes-alvo são simultaneamente desregulados pela formação de uma translocação cromossómica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrência de alterações genéticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.