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Resumo:
ABSTRACT: Carotid bodies (CB) are peripheral chemoreceptor organs sensing changes in arterial blood O2, CO2 and pH levels. Hypoxia and acidosis or hypercapnia activates CB chemoreceptor cells, which respond by releasing neurotransmitters in order to increase the action potential frequency in their sensory nerve, the carotid sinus nerve (CSN). CSN activity is integrated in the brainstem to induce a fan of cardiorespiratory reflex responses, aimed at normalising the altered blood gases. Exogenously applied adenosine (Ado) increases CSN chemosensory activity inducing hyperventilation through activation of A2 receptors. The importance of the effects of adenosine in chemoreception was reinforced by data obtained in humans, in which the intravenous infusion of Ado causes hyperventilation and dyspnoea, an effect that has been attributed to the activation of CB because Ado does not cross blood-brain barrier and because the ventilatory effects are higher the closer to the CB it is injected. The present work was performed in order to establish the functional significance of adenosine in chemoreception at the carotid body in control and chronically hypoxic rats. To achieve this objective we investigated: 1) The release of adenosine from a rat carotid body in vitro preparation in response to moderate hypoxia and the specificity of this release. We also investigated the metabolic pathways of adenosine production and release in the organ in normoxia and hypoxia; 2) The modulation of adenosine/ATP release from rat carotid body chemoreceptor cells by nicotinic ACh receptors; 3) The effects of caffeine on peripheral control of breathing and the identity of the adenosine receptors involved in adenosine and caffeine effects on carotid body chemoreceptors; 4) The interactions between dopamine D2 receptors and adenosine A2B receptors that modulate the release of catecholamines (CA) from the rat carotid body; 5) The effect of chronic caffeine intake i.e. the continuous blockage of adenosine receptors thereby simulating a caffeine dependence, on the carotid body function in control and chronically hypoxic rats. The methodologies used in this work included: molecular biology techniques (e.g. immunocytochemistry and western-blot), biochemical techniques (e.g. neurotransmitter quantification by HPLC, bioluminescence and radioisotopic methods), electrophysiological techniques (e.g. action potential recordings) and ventilatory recordings using whole-body plethysmography. It was observed that: 1) CB chemoreceptor sensitivity to hypoxia could be related to its low threshold for the release of adenosine because moderate acute hypoxia (10% O2) increased adenosine concentrations released from the CB by 44% but was not a strong enough stimulus to evoke adenosine release from superior cervical ganglia and arterial tissue; 2) Acetylcholine (ACh) modulates the release of adenosine/5-adenosine triphosphate (ATP) from CB in moderate hypoxia through the activation of nicotinic receptors with 4 and 2 receptor subunits, suggesting that the excitatory role of ACh in chemosensory activity includes indirect activation of purinergic receptors by adenosine and ATP, which strongly supports the hypothesis that ATP/adenosine are important mediators in chemotransduction; 3) adenosine increases the release of CA from rat CB chemoreceptor cells via A2B receptors; 4) the inhibitory effects of caffeine on CB chemoreceptors are mediated by antagonism of postsynaptic A2A and presynaptic A2B adenosine receptors indicating that chemosensory activity elicited by hypoxia is controlled by adenosine; 5) The release of CA from rat CB chemoreceptor cells is modulated by adenosine through an antagonistic interaction between A2B and D2 receptors, for the first time herein described; 6) chronic caffeine treatment did not significantly alter the basal function of CB in normoxic rats assessed as the dynamics of their neurotransmitters, dopamine, ATP and adenosine, and the CSN chemosensory activity. In contrast, the responses to hypoxia in these animals were facilitated by chronic caffeine intake because it increased the ventilatory response, slightly increased CSN chemosensory activity and increased dopamine (DA) and ATP release; 7) In comparison with normoxic rats, chronically hypoxic rats exhibited an increase in several parameters: ventilatory hypoxic response; basal and hypoxic CSN activity; tyrosine hydroxylase expression, CA content, synthesis and release; basal and hypoxic adenosine release; and in contrast a normal basal release and diminished hypoxia-induced ATP release; 8) Finally, in contrast to chronically hypoxic rats, chronic caffeine treatment did not alter the basal CSN chemosensory activity. Nevertheless, the responses to mild and intense hypoxia, and hypercapnia, were diminished. This inhibitory effect of chronic caffeine in CB output is compensated by central mechanisms, as the minute ventilation parameter in basal conditions and in response to acute hypoxic challenges remained unaltered in rats exposed to chronic hypoxia. We can conclude that adenosine both in acute and chronically hypoxic conditions have an excitatory role in the CB chemosensory activity, acting directly on adenosine A2A receptors present postsynaptically in CSN, and acting presynaptically via A2B receptors controlling the release of dopamine in chemoreceptor cells. We suggest that A2B -D2 adenosine / dopamine interactions at the CB could explain the increase in CA metabolism caused by chronic ingestion of caffeine during chronic hypoxia. It was also concluded that adenosine facilitates CB sensitisation to chronic hypoxia although this effect is further compensated at the central nervous system.-------- RESUMO: Os corpos carotdeos (CB) so pequenos orgos emparelhados localizados na bifurcao da artria cartida comum. Estes rgos so sensveis a variaes na PaO2, PaCO2, pH e temperatura sendo responsveis pela hiperventilao que ocorre em resposta hipxia, contribuindo tambm para a hiperventilao que acompanha a acidose metablica e respiratria. As clulas quimiorreceptoras (tipo I ou glmicas) do corpo carotdeo respondem s variaes de gases arteriais libertando neurotransmissores que activam as terminaes sensitivas do nervo do seio carotdeo (CSN) conduzindo a informao ao centro respiratrio central. Est ainda por esclarecer qual o neurotransmissor (ou os neurotransmissores) responsvel pela sinalizao hipxica no corpo carotdeo. A adenosina um neurotransmissor excitatrio no CB que aumenta a actividade elctrica do CSN induzindo a hiperventilao atravs da activao de receptores A2. A importncia destes efeitos da adenosina na quimiorrecepo, descritos em ratos e gatos, foi reforada por resultados obtidos em voluntrios saudveis onde a infuso intravenosa de adenosina em induz hiperventilao e dispneia, efeito atribudo a uma activao do CB uma vez que a adenosina no atravessa a barreira hemato-enceflica e o efeito quanto maior quanto mais perto do CB for a administrao de adenosina. O presente trabalho foi realizado com o objectivo de esclarecer qual o significado funcional da adenosina na quimiorrecepo no CB em animais controlo e em animais submetidos a hipoxia crnica mantida. Para alcanar este objectivo investigou-se: 1) o efeito da hipxia moderada sobre a libertao de adenosina numa preparao in vitro de CB e a especificidade desta mesma libertao comparativamente com outros tecidos no quimiossensitivos, assim como as vias metablicas de produo e libertao de adenosina no CB em normoxia e hipxia; 2) a modulao da libertao de adenosina/ATP das clulas quimiorreceptoras do CB por receptores nicotnicos de ACh; 3) os efeitos da cafena no controlo perifrico da ventilao e a identidade dos receptores de adenosina envolvidos nos efeitos da adenosina e da cafena nos quimiorreceptores do CB; 4) as interaces entre os receptores D2 de dopamina e os receptores A2B de adenosina que modulam a libertao de catecolaminas (CA) no CB de rato e; 5) o efeito da ingesto crnica de cafena, isto , o contnuo bloqueio e dos receptores de adenosina, simulando assim o consumo crnico da cafena, tal como ocorre na populao humana mundial e principalmente no ocidente, na funo do corpo carotdeo em ratos controlo e em ratos submetidos a hipoxia crnica. Os mtodos utilizados neste trabalho incluram: tcnicas de biologia molecular como imunocitoqumica e western-blot; tcnicas bioqumicas, tais como a quantificao de neurotransmissores por HPLC, bioluminescncia e mtodos radioisotpicos; tcnicas electrofisiolgicas como o registro de potenciais elctricos do nervo do seio carotdeo in vitro; e registros ventilatrios in vivo em animais no anestesiados e em livre movimento (pletismografia). Observou-se que: 1) a especificidade dos quimiorreceptores do CB como sensores de O2 est correlacionada com o baixo limiar de libertao de adenosina em resposta hipxia dado que a libertao de adenosina do CB aumenta 44% em resposta a uma hipxia moderada (10% O2), que no entanto no um estmulo suficientemente intenso para evocar a libertao de adenosina do gnglio cervical superior ou do tecido arterial. Observou-se tambm que aproximadamente 40% da adenosina libertada pelo CB provm do catabolismo extracelular do ATP quer em normxia quer em hipxia moderada, sendo que PO2 reduzidas induzem a libertao de adenosina via activao do sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) a ACh modula a libertao de adenosina /ATP do CB em resposta hipoxia moderada sugerindo que o papel excitatrio da ACh na actividade quimiossensora inclui a activao indirecta de receptores purinrgicos pela adenosina e ATP, indicando que a adenosina e o ATP poderiam actuar como mediadores importantes no processo de quimiotransduco uma vez que: a) a activao dos receptores nicotnicos de ACh no CB em normxia estimula a libertao de adenosina (max 36%) provindo aparentemente da degradao extracelular do ATP. b) a caracterizao farmacolgica dos receptores nicotnicos de ACh envolvidos na estimulao da libertao de adenosina do CB revelou que os receptores nicotnicos de ACh envolvidos so constitudos por subunidades 42. 3) a adenosina modula a libertao de catecolaminas das clulas quimiorreceptoras do CB atravs de receptores de adenosina A2B dado que: a)a cafena, um antagonista no selectivo dos receptores de adenosina, inibiu a libertao de CA quer em normxia quer em resposta a estmulos de baixa intensidade sendo ineficaz na libertao induzida por estmulos de intensidade superior; b) o DPCPX e do MRS1754 mimetizaram os efeitos da cafena no CB sendo o SCH58621 incapaz de induzir a libertao de CA indicando que os efeitos da cafena seriam mediados por receptores A2B de adenosina cuja presena nas clulas quimiorreceptoras do CB demonstramos por imunocitoqumica. 4) a aplicao aguda de cafena inibiu em 52% a actividade quimiossensora do CSN induzida pela hipxia sendo este efeito mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A ps-sinpticos e A2B pr-sinpticos indicando que a actividade quimiossensora induzida pela hipxia controlada pela adenosina. 5) existe uma interaco entre os receptores A2B e D2 que controla a libertao de CA do corpo carotdeo de rato uma vez que: a) os antagonistas dos receptores D2, domperidona e haloperidol, aumentaram a libertao basal e evocada de CA das clulas quimiorreceptoras confirmando a presena de autorreceptores D2 no CB de rato que controlam a libertao de CA atravs de um mecanismo de feed-back negativo. b) o sulpiride, um antagonista dos receptores D2, aumentou a libertao de CA das clulas quimiorreceptoras revertendo o efeito inibitrio da cafena sobre esta mesma libertao; c) a propilnorapomorfina, um agonista D2 inibiu a libertao basal e evocada de CA sendo este efeito revertido pela NECA, um agonista dos receptores A2B. O facto de a NECA potenciar o efeito do haloperidol na libertao de CA sugere que a interaco entre os receptores D2 e A2B poderia tambm ocorrer ao nvel de segundos mensageiros, como o cAMP. 6) a ingesto crnica de cafena em ratos controlo (normxicos) no alterou significativamente a funo basal do CB medida como a dinmica dos seus neurotransmissores, dopamina, ATP e adenosina e como actividade quimiossensora do CSN. Contrariamente aos efeitos basais, a ingesto crnica de cafena facilitou a resposta hipxia, dado que aumentou o efeito no volume minuto respiratrioapresentando-se tambm uma clara tendncia para aumentar a actividade quimiossensora do CSN e aumentar a libertao de ATP e dopamina.7) aps um perodo de 15 dias de hipxia crnica era evidente o fenmeno de aclimatizao dado que as respostas ventilatrias hipxia se encontram aumentadas, assim como a actividade quimiossensora do CSN basal e induzida pela hipxia. As alteraes observadas no metabolismo da dopamina, assim como na libertao basal de dopamina e de adenosina poderiam contribuir para a aclimatizao durante a hipoxia crnica. A libertao aumentada de adenosina em resposta hipxia aguda em ratos hipxicos crnicos sugere um papel da adenosina na manuteno/aumento das respostas ventilatrias hipxia aguda durante a hipxia crnica. Observou-se tambm que a libertao de ATP induzida pela hipxia aguda se encontra diminuda em hipxia crnica, contudo a ingesto crnica de cafena reverteu este efeito para valores similares aos valores controlo, sugerindo que a adenosina possa modular a libertao de ATP em hipxia crnica. 8) a ingesto crnica de cafena em ratos hipxicos crnicos induziu o aumento do metabolismo de CA no CB, medido como expresso de tirosina hidroxilase, contedo, sntese e libertao de CA. 9) a ingesto crnica de cafena no provocou quaisquer alteraes na actividade quimiossensora do CSN em ratos hipxicos crnicos no entanto, as respostas do CSN hipxia aguda intensa e moderada e hipercapnia encontram-se diminudas. Este efeito inibitrio que provm da ingesto crnica de cafena parece ser compensado ao nvel dos quimiorreceptores centrais dado que os parmetros ventilatrios em condies basais e em resposta hipoxia aguda no se encontram modificados em ratos expostos durante 15 dias a uma atmosfera hipxica. Resumindo podemos assim concluir que a adenosina quer em situaes de hipoxia aguda quer em condies de hipoxia crnica tem um papel excitatrio na actividade quimiossensora do CB actuando directamente nos receptores A2A presentes ps-sinapticamente no CSN, assim como facilitando a libertao de dopamina pr-sinapticamente via receptores A2B presentes nas clulas quimiorreceptoras. A interaco negativa entre os receptores A2B e D2 observadas nas clulas quimiorreceptoras do CB poderia explicar o aumento do metabolismo de CA observado aps a ingesto crnica de cafena em animais hipxicos. Conclui-se ainda que durante a aclimatizao hipxia a aco inibitria da cafena, em termos de resposta ventilatria, mediada pelos quimiorreceptores perifricos compensada pelos efeitos excitatrios desta xantina ao nvel do quimiorreceptores centrais.------- RESUMEN Los cuerpos carotdeos (CB) son rganos emparejados que estn localizados en la bifurcacin de la arteria cartida comn. Estos rganos son sensibles a variaciones en la PaO2, en la PaCO2, pH y temperatura siendo responsables de la hiperventilacin que ocurre en respuesta a la hipoxia, contribuyendo tambin a la hiperventilacin que acompaa a la acidosis metablica y respiratoria. Las clulas quimiorreceptoras (tipo I o glmicas) del cuerpo carotdeo responden a las variaciones de gases arteriales liberando neurotransmissores que activan las terminaciones sensitivas del nervio del seno carotdeo (CSN) llevando la informacin al centro respiratorio central. Todava esta por clarificar cual el neurotransmisor (o neurotransmisores) responsable por la sealizacin hipxica en el CB. La adenosina es un neurotransmisor excitatrio en el CB ya que aumenta la actividad del CSN e induce la hiperventilacin a travs de la activacin de receptores de adenosina del subtipo A2. La importancia de estos efectos de la adenosina en la quimiorrecepcin, descritos en ratas y gatos, ha sido fuertemente reforzada por resultados obtenidos en voluntarios sanos en los que la infusin intravenosa de adenosina induce hiperventilacin y dispnea, efectos ests que han sido atribuidos a una activacin del CB ya que la adenosina no cruza la barrera hemato-encefalica y el efecto es tanto ms grande cuanto ms cercana del CB es la administracin. Este trabajo ha sido realizado con el objetivo de investigar cual el significado funcional de la adenosina en la quimiorrecepcin en el CB en animales controlo y en animales sometidos a hipoxia crnica sostenida. Para alcanzar este objetivo se ha estudiado: 1) el efecto de la hipoxia moderada en la liberacin de adenosina en una preparacin in vitro de CB y la especificidad de esta liberacin en comparacin con otros tejidos no-quimiosensitivos, as como las vas metablicas de produccin y liberacin de adenosina del rgano en normoxia y hipoxia; 2) la modulacin de la liberacin de adenosina/ATP de las clulas quimiorreceptoras del CB por receptores nicotnicos de ACh; 3) los efectos de la cafena en el controlo perifrico de la ventilacin y la identidad de los receptores de adenosina involucrados en los efectos de la adenosina y cafena en los quimiorreceptores del CB; 4) las interacciones entre los receptores D2 de dopamina y los receptores A2B de adenosina que modulan la liberacin de catecolaminas (CA) en el CB de rata y; 5) el efecto de la ingestin crnica de cafena, es decir, el bloqueo sostenido de los receptores de adenosina, simulando la dependencia de cafena observada en la populacin mundial del occidente, en la funcin del CB en ratas controlo y sometidas a hipoxia crnica sostenida. Los mtodos utilizados en este trabajo incluirn: tcnicas de biologa molecular como imunocitoqumica y western-blot; tcnicas bioqumicas, tales como la cuantificacin de neurotransmissores por HPLC, bioluminescencia y mtodos radioisotpicos; tcnicas electrofisiolgicas como el registro de potenciales elctricos del nervio do seno carotdeo in vitro; y registros ventilatrios in vivo en animales no anestesiados y en libre movimiento (pletismografia). Se observ que: 1) la sensibilidad de los quimiorreceptores de CB esta correlacionada con un bajo umbral de liberacin de adenosina en respuesta a la hipoxia ya que en respuesta a una hipoxia moderada (10% O2) la liberacin de adenosina en el CB aumenta un 44%, sin embargo esta PaO2 no es un estimulo suficientemente fuerte para inducir la liberacin de adenosina del ganglio cervical superior o del tejido arterial; se observ tambin que aproximadamente 40% de la adenosina liberada del CB proviene del catabolismo extracelular del ATP en normoxia y en hipoxia moderada, y que bajas PO2 inducen la liberacin de adenosina va activacin del sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) la ACh modula la liberacin de adenosina /ATP del CB en respuesta a la hipxia moderada lo que sugiere que el papel excitatrio de la ACh en la actividad quimiosensora incluye la activacin indirecta de receptores purinrgicos por la adenosina y el ATP, indicando que la adenosina y el ATP pueden actuar como mediadores importantes en el proceso de quimiotransduccin ya que: a) la activacin de los receptores nicotnicos de ACh en el CB en normoxia estimula la liberacin de adenosina (max 36%) que aparentemente proviene de la degradacin extracelular del ATP. Se observ tambin que este aumento de adenosina en el CB en hipoxia ha sido antagonizado parcialmente por antagonistas de estos mismos receptores; b) la caracterizacin farmacolgica de los receptores nicotnicos de ACh involucrados en la estimulacin de la liberacin de adenosina del CB ha revelado que los receptores nicotnicos de ACh involucrados son constituidos por sub-unidades 42. 3) la adenosina modula la liberacin de CA de las clulas quimiorreceptoras del CB a travs de receptores de adenosina A2B ya que: a) la cafena, un antagonista no selectivo de los receptores de adenosina, ha inhibido la liberacin de CA en normoxia y en respuesta a estmulos de baja intensidad siendo ineficaz en la liberacin inducida por estmulos de intensidad superior; b) el DPCPX y el MRS1754 ha mimetizado los efectos de la cafena en el CB y el SCH58621 ha sido incapaz de inducir la liberacin de CA lo que sugiere que los efectos de la cafena son mediados por receptores A2B de adenosina que estn localizados pr-sinapticamente en las clulas quimiorreceptoras del CB. 4) la aplicacin aguda de cafena ha inhibido en 52% la actividad quimiosensora del CSN inducida por la hipoxia siendo este efecto mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A ps-sinpticos y A2B pr-sinpticos lo que indica que la actividad quimiosensora inducida por la hipoxia es controlada por la adenosina. 5) existe una interaccin entre los receptores A2B y D2 que controla la liberacin de CA del CB de rata ya que: a) el sulpiride, un antagonista de los receptores D2, ha aumentado la liberacin de CA de las clulas quimiorreceptoras revertiendo el efecto inhibitorio de la cafena sobre esta misma liberacin; b) los antagonistas de los receptores D2, domperidona y haloperidol, han aumentado la liberacin basal e evocada de CA de las clulas quimiorreceptoras confirmando la presencia de autorreceptores D2 en el CB de rata que controlan la liberacin de CA a travs de un mecanismo de feed-back negativo; c) la propilnorapomorfina, un agonista D2, ha inhibido la liberacin basal e evocada de CA sendo este efecto revertido por la NECA, un agonista de los receptores A2B. Ya que la NECA potencia el efecto del haloperidol en la liberacin de CA la interaccin entre los D2 y A2B puede tambin ocurrir al nivel de segundos mensajeros, como el cAMP. 6) la ingestin crnica de cafena en ratas controlo (normxicas) no ha cambiado significativamente la funcin basal del CB medida como la dinmica de sus neurotransmisores, dopamina, ATP y adenosina y como actividad quimiosensora del CSN. Al revs de lo que pasa con los efectos bsales, la ingestin crnica de cafena facilit la respuesta a la hipxia, ya que ha aumentado la respuesta ventilatria medida como volumen minuto presentando tambin una clara tendencia para aumentar la actividad quimiosensora del CSN y aumentar la liberacin de ATP y dopamina. 7. Despus de un perodo de 15 das de hipoxia crnica se puede observar el fenmeno de climatizacin ya que las respuestas ventilatrias a la hipoxia estn aumentadas, as como la actividad quimiosensora del CSN basal e inducida por la hipoxia. Los cambios observados en el metabolismo de la dopamina, as como en la liberacin basal de dopamina y de adenosina podran contribuir para la climatizacin en hipoxia crnica. El aumento en la liberacin de adenosina en respuesta a la hipoxia aguda en ratas sometidas a hipoxia crnica sugiere un papel para la adenosina en el mantenimiento/aumento de las respuestas ventilatrias a la hipoxia aguda en hipoxia crnica sostenida. Se ha observado tambin que la liberacin de ATP inducida por la hipoxia aguda est disminuida en hipoxia crnica y que la ingestin crnica de cafena reverte este efecto para valores similares a los valores controlo, sugiriendo que la adenosina podra modular la liberacin de ATP en hipoxia crnica. 8. la ingestin crnica de cafena ha inducido el aumento del metabolismo de CA en el CB en ratas hipxicas crnicas, medido como expresin de la tirosina hidroxilase, contenido, sntesis y liberacin de CA. 9. la ingestin crnica de cafena no ha inducido cambios en la actividad quimiosensora del CSN en ratas hipxicas crnicas sin embargo las respuestas do CSN a una hipoxia intensa y moderada y a la hipercapnia estn disminuidas. Este efecto inhibitorio que es debido a la ingestin crnica de cafena es compensado al nivel de los quimiorreceptores centrales ya que los parmetros ventilatrios en condiciones bsales y en respuesta a la hipoxia aguda no estn modificados en ratas expuestas durante 15 das a una atmsfera hipxica. Resumiendo se puede concluir que la adenosina en situaciones de hipoxia aguda as como en hipoxia crnica tiene un papel excitatrio en la actividad quimiosensora del CB actuando directamente en los receptores A2A localizados ps-sinapticamente en el CSN, as como controlando la liberacin de dopamina pr-sinaptica va receptores A2B localizados en las clulas quimiorreceptoras. Las interacciones entre los receptores A2B y D2 observadas en las clulas quimiorreceptoras del CB podran explicar el aumento del metabolismo de CA observado despus de la ingestin crnica de cafena en animales hipxicos. Por fin, pero no menos importante se puede concluir que durante la climatizacin a la hipoxia la accin inhibitoria de la cafena, medida como respuesta ventilatria, mediada por los quimiorreceptores perifricos es compensada por los efectos excitatrios de esta xantina al nivel de los quimiorreceptores centrales.
Resumo:
RESUMO: O cancro da mama a patologia oncolgica mais frequente nas mulheres sendo o responsvel pela maior taxa de mortalidade por cancro no sexo feminino. Contudo, as causas inerentes a esta patologia permanecem por esclarecer. Nos ltimos anos tem-se verificado que o risco para patologia neoplsica depende de factores ambientais e genticos, estando estes ltimos associados variabilidade gentica inter-individual. Polimorfismos genticos em genes envolvidos no metabolismo de hormonas sexuais, de cancergenos ambientais e na reparao da leso gentica, so potenciais candidatos a estarem associados susceptibilidade individual para esta patologia. Assim, neste trabalho desenvolveram-se estudos de associao caso-controlo na populao Portuguesa, com vista a avaliar-se o papel atribudo aos polimorfismos na susceptibilidade para cancro da mama. Foram seleccionados polimorfismos em genes envolvidos em diferentes vias mecanicistas: destoxificao de cancergenos, metabolismo de estrognios, reparao por exciso de bases, reparao por exciso de nucletidos, reparao mismatch e reparao por recombinao homloga. Os resultados obtidos revelaram associao entre os seguintes polimorfismos e a susceptibilidade individual para cancro da mama: os dois SNPs estudados no gene XRCC1 (Arg194Trp e Arg399Gln) e o SNP no gene XRCC3 (Thr241Met) aps estratificao pelo status menopausico. Mediante estratificao por status de amamentao os SNPs identificados nos genes MnSOD (Val16Ala) e XRCC2 (Arg118His); um SNP no gene MLH3 (Leu844Pro), e por fim como resultado de interaco gene-gene as interaces descritas por MSH3 Ala1045Thr/MSH6 Gly39Glu e MSH4 Ala97Thr/MLH3 Leu844Pro. Os resultados obtidos e apresentados na presente dissertao, revelam que o estudo de polimorfismos pode representar um papel determinante na etiologia do cancro da mama. No entanto, mais estudos envolvendo estes mesmos polimorfismos em populaes casuisticamente superiores sero uma mais-valia nos estudos de associao para esta neoplasia. Adicionalmente, a utilizao da metodologia de Pools de DNA, poder ser uma ferramenta til na pr-seleco dos polimorfismos mais relevantes a estudar, na medida em que permite estimar a frequncia allica de cada SNP numa determinada populao.-----------------------------------ABSTRACT: Breast cancer is the most common form of cancer among women, being the responsible for the highest mortality rate from cancer among the female sex. However, the main causes related to this pathology remain unclear. The risk of neoplasic disease has been connected with genetic and environmental factors. In fact, genes and the environment share the stage for most, if not all, common non-familial cancers, and are related to individual susceptibility. Genetic polymorphisms identified in genes encoding enzymes involved in estrogen metabolism, xenobiotics and DNA repair pathways are believed to be candidates for associations with breast cancer. Therefore, it was our intention to develop case-control studies among the Portuguese population, in order to evaluate the potential role of several genetic polymorphisms in breast cancer susceptibility. We selected polymorphisms in genes involved in different pathways: carcinogenic detoxification, estrogen metabolism, base excision repair, nucleotide excision repair, mismatch repair and double strand break repair by homologous recombination. The results obtained revealed potential associations between some polymorphisms studied and individual susceptibility to breast cancer. Regarding this fact, our results suggest the potential involvement of two XRCC1 gene polymorphisms (Arg194Trp and Arg399Gln) and XRCC3 gene polymorphism (Thr241Met) after stratification to menopausal status and after stratification to breastfeeding status an association of MnSOD gene polymorphism (Val16Ala) and XRCC2 (Arg188His) with the disease. The SNP identified in MLH3 gene (Leu844Pro), and the interaction gene-gene described by MSH3 Ala1045Thr/MSH6 Gly39Glu and MSH4 Ala97Thr/MLH3 Leu844Pro were also related to breast cancer susceptibility. The results shown in the present dissertation have revealed the potential role of polymorphisms in breast cancer etiology. However, further studies will be needed with larger populations to confirm these results. Additionally, the use of DNA pools methodology, as a pre-selection tool, could allow the identification of the most relevant polymorphisms to be studied, estimating the allelic frequency of each SNPs in different populations.
Resumo:
RESUMO - A exposio a formaldedo reconhecidamente um dos mais importantes factores de risco presente nos laboratrios hospitalares de anatomia patolgica. Neste contexto ocupacional, o formaldedo utilizado em soluo, designada comummente por formol. Trata-se de uma soluo comercial de formaldedo, normalmente diluda a 10%, sendo pouco onerosa e, por esse motivo, a eleita para os trabalhos de rotina em anatomia patolgica. A soluo utilizada como fixador e conservante do material biolgico, pelo que as peas anatmicas a serem processadas so previamente impregnadas. No que concerne aos efeitos para a sade do formaldedo, os efeitos locais parecem apresentar um papel mais importante comparativamente com os efeitos sistmicos, devido sua reactividade e rpido metabolismo nas clulas da pele, tracto gastrointestinal e pulmes. Da mesma forma, a localizao das leses correspondem principalmente s zonas expostas s doses mais elevadas deste agente qumico, ou seja, o desenvolvimento dos efeitos txicos depender mais da intensidade da dose externa do que da durao da exposio. O efeito do formaldedo no organismo humano mais facilmente detectvel a aco irritante, transitria e reversvel sobre as mucosas dos olhos e aparelho respiratrio superior (naso e orofaringe), o que acontece em geral para exposies frequentes e superiores a 1 ppm. Doses elevadas so citotxicas e podem conduzir a degenerescncia e necrose das mucosas e epitlios. No que concerne aos efeitos cancergenos, a primeira avaliao efectuada pela International Agency for Research on Cancer data de 1981, actualizada em 1982, 1987, 1995 e 2004, considerando-o como um agente cancergeno do grupo 2A (provavelmente carcinognico). No entanto, a mais recente avaliao, em 2006, considera o formaldedo no Grupo 1 (agente carcinognico) com base na evidncia de que a exposio a este agente susceptvel de causar cancro nasofarngeo em humanos. Constituiu objectivo principal deste estudo caracterizar a exposio profissional a formaldedo nos laboratrios hospitalares de anatomia patolgica Portugueses. Pretendeu-se, ainda, descrever os fenmenos ambientais da contaminao ambiental por formaldedo e explorar eventuais associaes entre variveis. Considerou-se uma amostra de 10 laboratrios hospitalares de anatomia patolgica, avaliada a exposio dos trs grupos profissionais por comparao com os dois referenciais de exposio e, ainda, conhecidos os valores de concentrao mxima em 83 actividades. Foram aplicados simultaneamente dois mtodos distintos de avaliao ambiental: um dos mtodos (Mtodo 1) fez uso de um equipamento de leitura directa com o princpio de medio por Photo Ionization Detection, com uma lmpada de 11,7 eV e, simultaneamente, realizou-se o registo da actividade. Este mtodo disponibilizou dados para o referencial de exposio da concentrao mxima; o outro mtodo (Mtodo 2) traduziu-se na aplicao do mtodo NIOSH 2541, implicando o uso de bombas de amostragem elctricas de baixo caudal e posterior processamento analtico das amostras por cromatografia gasosa. Este mtodo, por sua vez, facultou dados para o referencial de exposio da concentrao mdia ponderada. As estratgias de medio de cada um dos mtodos e a definio dos grupos de exposio existentes neste contexto ocupacional, designadamente os Tcnicos de Anatomia Patolgica, os Mdicos Anatomo-Patologistas e os Auxiliares, foram possveis atravs da informao disponibilizada pelas tcnicas de observao da actividade da anlise (ergonmica) do trabalho. Estudaram-se diversas variveis independentes, nomeadamente a temperatura ambiente e a humidade relativa, a soluo de formaldedo utilizada, as condies de ventilao existentes e o nmero mdio de peas processadas por dia em cada laboratrio. Para a recolha de informao sobre estas variveis foi preenchida, durante a permanncia nos laboratrios estudados, uma Grelha de Observao e Registo. Como variveis dependentes seleccionaram-se trs indicadores de contaminao ambiental, designadamente o valor mdio das concentraes superiores a 0,3 ppm em cada laboratrio, a Concentrao Mdia Ponderada obtida para cada grupo de exposio e o ndice do Tempo de Regenerao de cada laboratrio. Os indicadores foram calculados e definidos atravs dos dados obtidos pelos dois mtodos de avaliao ambiental aplicados. Baseada no delineado pela Universidade de Queensland, foi ainda aplicada uma metodologia de avaliao do risco de cancro nasofarngeo nas 83 actividades estudadas de modo a definir nveis semi-quantitativos de estimao do risco. Para o nvel de Gravidade considerou-se a informao disponvel em literatura cientfica que define eventos biolgicos adversos, relacionados com o modo de aco do agente qumico e os associa com concentraes ambientais de formaldedo. Para o nvel da Probabilidade utilizou-se a informao disponibilizada pela anlise (ergonmica) de trabalho que permitiu conhecer a frequncia de realizao de cada uma das actividades estudadas. A aplicao simultnea dos dois mtodos de avaliao ambiental resultou na obteno de resultados distintos, mas no contraditrios, no que concerne avaliao da exposio profissional a formaldedo. Para as actividades estudadas (n=83) verificou-se que cerca de 93% dos valores so superiores ao valor limite de exposio definido para a concentrao mxima (VLE-CM=0,3 ppm). O exame macroscpico foi a actividade mais estudada e onde se verificou a maior prevalncia de resultados superiores ao valor limite (92,8%). O valor mdio mais elevado da concentrao mxima (2,04 ppm) verificou-se no grupo de exposio dos Tcnicos de Anatomia Patolgica. No entanto, a maior amplitude de resultados observou-se no grupo dos Mdicos Anatomo-Patologistas (0,21 ppm a 5,02 ppm). No que respeita ao referencial da Concentrao Mdia Ponderada, todos os valores obtidos nos 10 laboratrios estudados para os trs grupos de exposio foram inferiores ao valor limite de exposio definido pela Occupational Safety and Health Administration (TLV-TWA=0,75 ppm). Verificou-se associao estatisticamente significativa entre o nmero mdio de peas processadas por laboratrio e dois dos trs indicadores de contaminao ambiental utilizados, designadamente o valor mdio das concentraes superiores a 0,3 ppm (p=0,009) e o ndice do Tempo de Regenerao (p=0,001). Relativamente temperatura ambiente no se observou associao estatisticamente significativa com nenhum dos indicadores de contaminao ambiental utilizados. A humidade relativa apresentou uma associao estatisticamente significativa apenas com o indicador de contaminao ambiental da Concentrao Mdia Ponderada de dois grupos de exposio, nomeadamente com os Mdicos Anatomo-Patologistas (p=0,02) e os Tcnicos de Anatomia Patolgica (p=0,04). A aplicao da metodologia de avaliao do risco nas 83 actividades estudadas permitiu verificar que, em cerca de dois teros (35%), o risco foi classificado como (pelo menos) elevado e, ainda, constatar que 70% dos laboratrios apresentou pelo menos 1 actividade com a classificao de risco elevado. Da aplicao dos dois mtodos de avaliao ambiental e das informaes obtidas para os dois referenciais de exposio pode concluir-se que o referencial mais adequado a Concentrao Mxima por estar associado ao modo de actuao do agente qumico. Acresce, ainda, que um mtodo de avaliao ambiental, como o Mtodo 1, que permite o estudo das concentraes de formaldedo e simultaneamente a realizao do registo da actividade, disponibiliza informaes pertinentes para a interveno preventiva da exposio por permitir identificar as actividades com a exposio mais elevada, bem como as variveis que a condicionam. As peas anatmicas apresentaram-se como a principal fonte de contaminao ambiental por formaldedo neste contexto ocupacional. Aspecto de particular interesse, na medida que a actividade desenvolvida neste contexto ocupacional e, em particular na sala de entradas, centrada no processamento das peas anatmicas. Dado no se perspectivar a curto prazo a eliminao do formaldedo, devido ao grande nmero de actividades que envolvem ainda a utilizao da sua soluo comercial (formol), pode concluir-se que a exposio a este agente neste contexto ocupacional especfico preocupante, carecendo de uma interveno rpida com o objectivo de minimizar a exposio e prevenir os potenciais efeitos para a sade dos trabalhadores expostos. ---------------- ABSTRACT - Exposure to formaldehyde is recognized as one of the most important risk factors present in anatomy and pathology laboratories from hospital settings. In this occupational setting, formaldehyde is used in solution, typically diluted to 10%, and is an inexpensive product. Because of that, is used in routine work in anatomy and pathology laboratories. The solution is applied as a fixative and preservative of biological material. Regarding formaldehyde health effects, local effects appear to have a more important role compared with systemic effects, due to his reactivity and rapid metabolism in skin, gastrointestinal tract and lungs cells. Likewise, lesions location correspond mainly to areas exposed to higher doses and toxic effects development depend more on external dose intensity than exposure duration. Human body formaldehyde effect more easily detectable is the irritating action, transient and reversible on eyes and upper respiratory tract (nasal and throat) membranes, which happen in general for frequent exposure to concentrations higher than 1 ppm. High doses are cytotoxic and can lead to degeneration, and also to mucous membranes and epithelia necrosis. With regard to carcinogenic effects, first assessment performed by International Agency for Research on Cancer in 1981, updated in 1982, 1987, 1995 and 2004, classified formaldehyde in Group 2A (probably carcinogenic). However, most recent evaluation in 2006, classifies formaldehyde carcinogenic (Group 1), based on evidence that exposure to this agent is likely to cause nasopharyngeal cancer in humans. This study principal objective was to characterize occupational exposure to formaldehyde in anatomy and pathology hospital laboratories, as well to describe formaldehyde environmental contamination phenomena and explore possible associations between variables. It was considered a sample of 10 hospital pathology laboratories, assessed exposure of three professional groups for comparison with two exposure metrics, and also knows ceiling concentrations in 83 activities. Were applied, simultaneously, two different environmental assessment methods: one method (Method 1) using direct reading equipment that perform measure by Photo Ionization Detection, with 11,7 eV lamps and, simultaneously, make activity description and film. This method provided data for ceiling concentrations for each activity study (TLV-C). In the other applied method (Method 2), air sampling and formaldehyde analysis were performed according to NIOSH method (2541). This method provided data average exposure concentration (TLV-TWA). Measuring and sampling strategies of each methods and exposure groups definition (Technicians, Pathologists and Assistants) was possible by information provided by activities (ergonomic) analysis. Several independent variables were studied, including temperature and relative humidity, formaldehyde solution used, ventilation conditions, and also anatomic pieces mean value processed per day in each laboratory. To register information about these variables was completed an Observation and Registration Grid. Three environmental contamination indicators were selected has dependent variables namely: mean value from concentrations exceeding 0,3 ppm in each laboratory, weighted average concentration obtained for each exposure group, as well each laboratory Time Regeneration Index. These indicators were calculated and determined through data obtained by the two environmental assessment methods. Based on Queensland University proposal, was also applied a methodology for assessing nasopharyngeal cancer risk in 83 activities studied in order to obtain risk levels (semi-quantitative estimation). For Severity level was considered available information in scientific literature that defines biological adverse events related to the chemical agent action mode, and associated with environment formaldehyde concentrations. For Probability level was used information provided by (ergonomic) work analysis that helped identifies activity frequency. Environmental assessment methods provide different results, but not contradictory, regarding formaldehyde occupational exposure evaluation. In the studied activities (n=83), about 93% of the values were above exposure limit value set for ceiling concentration in Portugal (VLE-CM = 0,3 ppm). "Macroscopic exam" was the most studied activity, and obtained the higher prevalence of results superior than 0,3 ppm (92,8%). The highest ceiling concentration mean value (2,04 ppm) was obtain in Technicians exposure group, but a result wider range was observed in Pathologists group (0,21 ppm to 5,02 ppm). Concerning Method 2, results from the three exposure groups, were all lower than limit value set by Occupational Safety and Health Administration (TLV-TWA=0,75ppm). There was a statistically significant association between anatomic pieces mean value processed by each laboratory per day, and two of the three environmental contamination indicators used, namely average concentrations exceeding 0,3 ppm (p=0,009) and Time Regeneration Index (p=0,001). Temperature was not statistically associated with any environmental contamination used indicators. Relative humidity had a statistically significant association only with one environmental contamination indicator, namely weighted average concentration, particularly with Pathologists group (p=0,02) and Technicians group (p=0,04). Risk assessment performed in the 83 studied activities showed that around two thirds (35%) were classified as (at least) high, and also noted that 70% of laboratories had at least 1 activity with high risk rating. The two environmental assessment methods application, as well information obtained from two exposure metrics, allowed to conclude that most appropriate exposure metric is ceiling concentration, because is associated with formaldehyde action mode. Moreover, an environmental method, like Method 1, which allows study formaldehyde concentrations and relates them with activity, provides relevant information for preventive information, since identifies the activity with higher exposure, as well variables that promote exposure. Anatomic pieces represent formaldehyde contamination main source in this occupational setting, and this is of particular interest because all activities are focused on anatomic pieces processing. Since there is no prospect, in short term, for formaldehyde use elimination due to large number of activities that still involve solution use, it can be concluded that exposure to this agent, in this particular occupational setting, is preoccupant, requiring an rapid intervention in order to minimize exposure and prevent potential health effects in exposed workers.
Resumo:
A multi-resistncia a antibiticos e medicamentos usados em quimioterapia um dos grandes problemas com os quais as instituies de sade se debatem hoje em dia. A aco provocada por bombas de efluxo uma das suas causas. Estas bombas tm uma importncia fundamental, uma vez que, ao expelirem todo o tipo de txicos para o exterior das clulas, tambm expelem medicamentos, fazendo com que estes no tenham o efeito desejado dentro delas. As bombas de efluxo so transportadores que se encontram nas membranas de todo o tipo de clulas. Existem dois grandes tipos de bombas de efluxo: as primrias e as secundrias. As primeiras conferem multi-resistncia principalmente em clulas eucariotas, como as clulas do cancro em humanos, tendo como funo a mediao da repulsa de substncias txicas por intermdio da hidrlise de ATP. A primeira a ser descoberta e mais estudada destas bombas foi a ABCB1 que o gene que codifica a glicoprotena-P (P de permeabilidade). Enquanto as secundrias, que so a maior fonte de multi-resistncia em bactrias, promovem a extruso de substncias txicas atravs da fora motriz de protes. Neste tipo de bombas so conhecidas quatro famlias principais, das quais uma das mais importantes a superfamlia RND, uma vez que inclui a bomba AcrAB-TolC, que muito importante no metabolismo xenobitico de bactrias Gramnegativas, nomeadamente a E.coli. Com o objectivo de reverter a multi-resistncia, tanto em clulas eucariotas como procariotas, tm-se desenvolvido estratgias de combate que envolvem a descoberta de substncias que inibam as bombas de efluxo. Assim sendo, ao longo dos tempos tm sido descobertas variadas substncias que cumprem este objectivo. o caso, por exemplo, dos derivados de fluoroquinolonas usados como inibidores de bombas de efluxo em bactrias ou do Tamoxifen, utilizado na terapia de pacientes com cancro da mama. Um dos grupos de substncias estudados para o desenvolvimento de possveis compostos que actuem como reversores de multi-resistncia so os compostos derivados de hidantonas. Estes, so conhecidos por possurem uma grande variedade de propriedades bioqumicas e farmacolgicas, sendo portanto usados para tratarem algumas doenas em humanos, como a epilepsia. Nestes, esto englobados compostos com actividade anti-convulso que constitui a sua grande mais-valia e, dependente da substituio no anel que os constitui, uma grande variedade de outras propriedades farmacolgicas como a anti-fungica, a anti-arritmica, a anti-viral, a anti-diabtica ou por exemplo a antagonizao de determinados receptores, como os da serotonina. Apesar de pouco usados em estudos experimentais para desenvolver substncias anti-carcinognicas, existem alguns estudos com este efeito. Objectivos: O presente projecto envolve o estudo de bombas de efluxo primrias e secundrias, em clulas eucariotas e procariotas, respectivamente. Em bactrias, foram usados quatro modelos experimentais: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli AG 100 e Salmonella Enteritidis NCTC 13349. Em clulas de cancro foram usadas, clulas T de linfoma de rato parentais e clulas T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1. O principal objectivo deste estudo foi a pesquisa de novos moduladores de bombas de efluxo presentes em bactrias e clulas do cancro, tentando assim contribuir para o desenvolvimento de novos agentes farmacolgicos que consigam reverter a multi-resistncia a medicamentos. Assim sendo foram testados trinta compostos derivados de hidantonas: SZ-2, SZ-7, LL-9, BS-1, JH-63, MN-3, TD-7k, GG-5k, P3, P7, P10, P11, RW-15b, AD-26, RW-13, AD-29, KF-2, PDPH-3, Mor-1, KK-XV, Thioam-1, JHF-1, JHC-2, JHP-1, Fur-2, GL-1, GL-7, GL-14, GL-16, GL-18. Como forma de atingir estes objectivos, a actividade biolgica dos trinta compostos derivados de hidantonas foi avaliada nas quatro estirpes de bactrias da seguinte forma: foram determinadas as concentraes mnimas inibitrias dos trinta compostos como forma de definir as concentraes em que os compostos seriam utilizados. Os compostos foram posteriormente testadas com um mtodo fluoromtrico de acumulao de brometo de etdeo, que um substrato comum em bombas de efluxo bacterianas, desenvolvido por Viveiros et al. A actividade biolgica dos compostos derivados de hidantonas nas clulas de cancro foi demonstrada por diferentes mtodos. O efeito anti-proliferativo e citotxico dos trinta compostos foi avaliado nas clulas T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1 pelo mtodo de thiazolyl de tetrazlio (MTT). Como o brometo de etdeo tambm expelido pelos transportadores ABC, estes compostos foram posteriormente testados com um mtodo fluoromtrico de acumulao de brometo de etdeo desenvolvido por Spengler et al nos dois diferentes tipos de clulas eucariotas. Resultados: A maioria dos compostos derivados de hidantonas foi eficaz na modulao de bombas de efluxo, nas duas estirpes de bactrias Gram-negativas e nos dois diferentes tipos de clulas T de linfoma. Em contraste com estes resultados, nas duas estirpes de clulas Gram-positivas, a maioria dos compostos tiveram pouco efeito na inibio de bombas de efluxo ou at nenhum, em muitos dos casos. De uma maneira geral os melhores compostos nas diferentes estirpes de bactrias foram: Thioam-1, SZ-2, P3, Rw-15b, AD-26, AD-29, GL-18, GL-7, KF-2, SZ-7, MN-3, GL-16 e GL- 14. Foram portanto estes os compostos que provocaram maior acumulao de brometo de etdeo, inibindo assim com maior eficcia as bombas de efluxo. No presente estudo, a maioria dos compostos conseguiu inibir a resistncia provocada pela bomba de efluxo ABCB1, tanto nas clulas parentais bem como nas clulas que sobre-expressam esta bomba, causando a acumulao de brometo de etdeo dentro das clulas. As clulas que sobreexpressam a bomba ABCB1 foram posteriormente testadas com citometria de fluxo que a tcnica padro para pesquisa de inibidores de bombas de efluxo. Os compostos que foram mais efectivos na inibio da bomba ABCB1, causando assim maior acumulao de brometo de etdeo nas clulas que sobre-expressam esta bomba foram: PDPH-3, GL-7, KK-XV, AD-29, Thioam-1, SZ-7, KF-2, MN-3, RW-13, LL-9, P3, AD-26, JH-63 e RW- 15b. Este facto no corroborou totalmente os resultados da citometria de fluxo uma vez que os moduladores que provocaram maior inibio da bomba ABCB1 foram o MN-3, JH-63 e o BS-1, sendo que o ltimo no foi seleccionado como um bom composto usando o mtodo fluoromtrico de acumulao de brometo de etdeo. Concluso: Os compostos derivados de hidantonas testados tiveram maior efeito nas estirpes de bactrias Gram-negativas do que nas Gram-positivas. Relativamente s clulas eucariotas, as estruturas mais activas apresentam substituintes aromticos bem como alguns fragmentos aminicos tercirios.
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente
Resumo:
Dissertao apresentada para obteno do Grau de Doutor em Cincias do Ambiente, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
Resumo:
Dissertao apresentada para a obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
Resumo:
Relatrio de Estgio de Mestrado em Ecologia Humana e Problemas Sociais Contemporneos
Resumo:
O vrus da hepatite delta (HDV) o agente etiolgico de uma das formas mais graves de hepatite viral e ainda endmico em diversas regies do globo, nomeadamente em frica, na Amaznia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatcitos infectados com o vrus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associao clnica entre os dois vrus deve-se ao facto do invlucro do HDV ser constitudo pelos antignios de superfcie do HBV (HBsAgs) que so necessrios para a propagao da infeco. O genoma do HDV constitudo por uma molcula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma nica grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antignio delta (HDAg). A ocorrncia de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expresso de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Vrias funes essenciais para a replicao do HDV tm sido atribudas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulao de RNA viral e a L-HDAg responsvel pela interaco com os HBsAgs para formar partculas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicao viral depende das interaces estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do nmero considervel de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importncia de muitas destas interaces no foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicao do HDV permanecem pouco claras. Para alm disso, dado o nmero limitado de factores do hospedeiro que esto envolvidos na sua replicao, muito provvel que um nmero elevado de interactores do HDV permanea por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificao de protenas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta protenas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas protenas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas caractersticas funcionais, foram seleccionadas trs destas protenas e as suas interaces com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As trs protenas seleccionadas foram a ribonucleoprotena nuclear heterognea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a protena 2 de ligao a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras so protenas de ligao a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicaes de outros vrus com genoma RNA, enquanto a EBP2, uma protena de localizao preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interaces foram analisadas recorrendo a vrios ensaios bioqumicos. No caso da hnRNPC e da HuR, aps validao no sistema YTH, a capacidade de interaco com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitao em clulas de hepatoma humano. Nas mesmas clulas, observou-se uma co-localizao considervel entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuio das protenas hnRNPC e HuR na replicao do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas protenas pela utilizao de short hairpin RNAs (shRNAs) especficos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as protenas hnRNPC e HuR endgenas, individualmente resultou numa diminuio acentuada nos nveis de expresso dos HDAgs. No que respeita EBP2, a interaco com a S-HDAg foi confirmada em condies in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A anlise por imunofluorescncia indirecta e microscopia confocal revelou co-localizao elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nuclolos de clulas de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importao dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propsito de identificar protenas celulares capazes de interagir com um domnio especfico dos HDAgs, o sinal de localizao nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina 4 (KPNA4). A interaco da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condies in vitro atravs de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas protenas. Este trabalho permitiu identificar vrias protenas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidncias sugestivas de que algumas das protenas identificadas podem desempenhar funes importantes no ciclo de replicao do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicao do vrus.
Resumo:
RESUMO: A presente dissertao para tese de doutoramento apresenta o desenvolvimento e a validao de um mtodo simples e original para o diagnstico de calcificaes vasculares em doentes em dilise, utilizando um score semiquantitativo criado por ns e obtido em RX simples da bacia e das mos, denominado score de calcifi cao vascular simples. Demonstramos que este score vascular simples preditor de risco cardiovascular nos doentes em dilise. O score de calcificao vascular simples associou-se ainda baixa densidade mineral ssea avaliada por dual energy X -ray absortiometry (DXA) no colo do fmur. Verifi camos igualmente que, em doentes em dilise, as calcifi caes coronrias quantifi cadas pelo score de Agatston e o score de calcifi cao vascular simples se associaram a um menor volume sseo avaliado em biopsias sseas. Estes trabalhos corroboram a hiptese da existncia de um elo de ligao entre a doena ssea e a doena vascular nos doentes em dilise, e um dos elementos que contribuem para este elo de ligao podem ser as calcificaes vasculares. Este score de calcificao vascular simples avalia calcifi caes em artrias de grande, mdio e pequeno calibre, e inclui os dois padres radiolgicos de calcificao: calcificao linear, associada calcifi cao da camada mdia da parede arterial, e calcificao irregular, associada calcifi cao da camada ntima arterial1. Nos diferentes trabalhos por ns publicados demonstramos que as calcificaes vasculares avaliadas por este mtodo simples e barato permitem a identificao de indivduos com elevado risco cardiovascular. Este score vascular associa -se a maior risco de mortalidade cardiovascular2, de mortalidade de causa global3, de internamentos cardiovasculares2, de doena ardiovascular2, de doena arterial perifrica2,4,de calcifi caes valvulares5 e de rigidez arterial3. As guidelines KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes), publicadas em 2009,sugerem que os doentes renais crnicos nos estadios 3 a 5, com calcificaes vasculares e valvulares, devem ser considerados como apresentando o mais elevado risco cardiovascular6. A elevada mortalidade dos doentes renais crnicos no totalmente explicada pelos fatores de risco tradicionais7. A organizao KDIGO defende, desde 2006, a hiptese da existncia de um elo de ligao entre a doena ssea e a doena vascular8. Esta ligao pode ser explicada pelas alteraes do metabolismo mineral e sseo e pela sua interao com as calcificaes vasculares. Verificamos, nos nossos trabalhos, uma associao entre calcifi caes vasculares e doena ssea. O baixo volume sseo diagnosticado por anlise histomorfomtrica de biopsias sseas foi preditor de maior risco de calcificaes vasculares avaliadas pelo score de calcifi cao vascular simples (dados apresentados nesta dissertao, no captulo 6) e pelo score coronrio de Agatston num grupo de doentes em dilise9. A contribuio original deste artigo9 foi considerada merecedora de um editorial feito pelo Dr. Grard London10, investigador lder na rea da calcificao vascular dos doentes renais crnicos e actual Presidente da EDTA (European Dialysis and Transplantation Association). Fomos tambm os primeiros a descrever uma associao independente e inversa entre a densidade mineral avaliada no colo do fmur por DXA (dual energy X -ray absortiometry) com calcificaes vasculares avaliadas pelo score de calcificao vascular simples, com rigidez arterial avaliada por velocidade de onda de pulsocarotidofemoral e com doena arterial perifrica diagnosticada por critrios clnicos11. Fomos igualmente os primeiros a mostrar uma correlao signifi cativa entre a densidade mineral ssea avaliada por DXA no colo do fmur, mas no na coluna lombar, com a espessura cortical avaliada por anlise histomorfomtrica em biopsia ssea12. O nosso estudo atribui pela primeira vez DXA um papel no diagnstico de porosidade cortical nos doentes em dilise. A utilidade da avaliao diferencial da densidade mineral ssea cortical e trabecular necessita ainda de ser confirmada em estudos prospectivos. Este achado inovador do nosso estudo foi mencionado pela ERBP (European Renal Best Practice) no comentrio feito posio da KDIGO que considera ser reduzida a utilidade da densidade mineral ssea nos doentes em dilise13. Dois dos trabalhos includos nesta dissertao foram referenciados nas guidelines KDIGO 2009 para avaliar a prevalncia das calcificaes vasculares (KDIGO 2009: Tabela suplementar 10, Fig. 3.6) e para validar a associao entre calcificaes vasculares e mortalidade cardiovascular (KDIGO 2009: Tabela suplementar 12, Fig. 3.7)6. A incluso destes nossos dois estudos nas referncias destas guidelines, que utilizaram o exigente sistema GRADE (Grades of recommendation, assessment, development, and evaluation) na classificao e seleco dos estudos, valida o interesse cientfico dos nossos trabalhos. O diagnstico de calcificaes vasculares tem um interesse prtico para os doentes renais crnicos. A presena de calcifi caes vasculares um sinal de alerta para a existncia de um elevado risco cardiovascular, e esta informao pode ser utilizada para modificar a teraputica nestes doentes6. Diferentes mtodos podem ser usados para diagnosticar calcificaes vasculares nos doentes em dilise14,15. O score de calcificao vascular simples tem a vantagem da simplicidade e de poder ser facilmente interpretado pelo nefrologista, sem necessidade de um radiologista. A reprodutibilidade deste score j foi demonstrada por diferentes grupos em estudos nacionais e internacionais16-24. Nestes estudos foi demonstrado que as calcifi caes vasculares avaliadas pelo mtodo criado por ns so preditoras de maior risco de eventos cardiovasculares16, de amputaes dos membros inferiores17, de velocidade de onda de pulso18,19, de calcificaes corneanas e conjuntivais20 e de calcifi caes coronrias21. Tambm foi demonstrada uma associao inversa entre o score de calcificao vascular simples com os nveis sricos de PTH21, com os nveis de 25(OH)vitamina D 22,23 e com os nveis de fetuna A19,24. Todos estes estudos, realizados por diferentes grupos, que utilizaram o score de calcificao vascular simples na sua metodologia, comprovam a facilidade de utilizao deste score e a concordncia de resultados atestam a sua reprodutibilidade e a utilidade na avaliao dos doentes renais crnicos. ---------------------------ABSTRACT: This thesis presents the development and validation of a simple and original method to identify vascular calcifications in dialysis patients, using a semi -quantitative score that we have created and that is obtained in plain X -ray of pelvis and hands. This score was named in different publications as simple vascular calcifi cation score. We have demonstrated that this score is a predictor of higher cardiovascular risk in dialysis patients. The simple vascular calcification score was also associated with lower mineral bone density evaluated by DXA in femoral neck. In hemodialysis patients coronary calcifications evaluated by the coronary Agatston score and by the simple vascular calcification score were associated with lower bone volume analysed in bone biopsies. These studies corroborate the hypothesis of the existence of a link between bone disease and vascular disease in dialysis patients and one of the elements of this link may be vascular calcifications. This simple vascular calcification score identifi es calcifications in large, medium and small calibre arteries and includes the two radiological patterns of arterial calcifi cation: linear calcification which has been associated with the calcifi cation of the media layer of the arterial wall and irregular and patchy calcification which has been associated with the calcifi cation of the intima layer of the arterial wall1. In the several studies that we have published we have demonstrated that vascular calcifications evaluated by this simple and inexpensive method allow the identification of patients with high cardiovascular risk. This simple vascular calcification score is an independent predictor of cardiovascular mortality2, all -cause mortality3, cardiovascular hospitalizations2, cardiovascular disease2, peripheral artery disease2,4, valvular calcifi cations5 and arterial stiffness3.KDIGO (Kidney Disease: Improving Global Outcomes) guidelines published in 2009 suggest that chronic kidney disease patients in stages 3 to 5, with vascular and valvular calcifications should be considered to be at the highest cardiovascular risk6. The high mortality of chronic kidney disease patients is not completely explained by the traditional risk factors7 and KDIGO group supports, since 2006, the hypothesis of the existence of a link between bone disease and vascular disease8.This link may be explained by the alterations of the bone and mineral metabolism and their interaction with development and progression of vascular calcifications. We have also verifi ed in our studies the existence of an association between vascular calcifications and bone disease. Low bone volume diagnosed by histomorphometric analysis of bone biopsies, in a group of dialysis patients, was independently associated with the simple vascular calcification score (data presented in this thesis,chapter 6) and with coronary calcifications evaluated by the Agatston score9. The original contribution of this article published in CJASN9 deserved a commentary in an Editorial written by Prof. Grard London10 leader investigator in this area and current EDTA (European Dialysis and Transplantation Association) President. We were also the fi rst group to describe an independent and inverse association between bone mineral density evaluated in the femoral neck by DXA (dual energy X -ray absortiometry) with vascular calcifications evaluated by the simple vascular calcification score, with arterial stiffness evaluated by carotid-femoral pulse wave velocity and with peripheral artery disease diagnosed by clinical criteria11. We were also the first group to demonstrate a significant correlation between bone mineral density evaluated by DXA in femoral neck but not in lumbar spine, with cortical thickness evaluated by histomorphometric analysis of bone biopsy12. Our study has attributed to DXA, for the first time, a role in the diagnosis of cortical porosity in dialysis patients. The clinical utility of the differential evaluation of bone mineral density in cortical or trabecular bone needs, however, to be confi rmed in prospective studies. This original fi nding of our study was mentioned by ERBP (European Renal Best Practice) commenting the KDIGO position in relation with the reduced utility of bone mineral density evaluation in dialysis patients13. Two of the studies included in this thesis have been integrated in a group of studies selected as references by the KDIGO guidelines published in 2009 to evaluate the prevalence of vascular calcifications in CKD patients (KDIGO 2009: Supplementary Table 10, Fig. 3.6) and to corroborate the association between vascular calcifications and cardiovascular mortality (KDIGO 2009: Supplementary Table 12, Fig. 3.7)6. The inclusion of both studies as references in the KDIGO guidelines that have used the exigent GRADE system (Grades of Recommendation, Assessment, Development, and Evaluation) in the classifi cation and selection of studies, validates the scientifi c value of our studies. The diagnosis of vascular calcifi cations has a practical interest for chronic kidney disease patients. The presence of vascular calcifications is an alert sign to the existence of a high cardiovascular risk and this information may be used to modify the treatment of these patients6. Different methods may be used to detect the presence of vascular calcifications in dialysis patients14,15. The simple vascular calcifi cation score has the advantage of being simple, inexpensive and easily evaluated by the Nephrologist without the need for a Radiologist interpretation. The reproducibility of this method has already been demonstrated by other groups in national and international studies16 -24. It was demonstrated in those studies that vascular calcifi cations evaluated by the method created by us, predict higher risk of cardiovascular events16, higher risk of lower limbs amputations17, higher pulse wave velocity18,19, corneal and conjuntival calcifi cations 20 and coronary calcifi cations21. A negative association between the simple vascular calcification score and PTH levels21, 25(OH) vitamin D levels22,23 and Fetuin A levels19,24 has also been demonstrated. All these studies performed by different groups that have used the simple vascular calcifi cation score in their methods demonstrate that this score is simple, useful and reproducible in the evaluation of chronic kidney disease patients simple, useful and reproducible in the evaluation of chronic kidney disease patients.
Resumo:
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina
Resumo:
RESUMO:Os microrganismos reagem sbita descida de temperatura atravs de uma resposta adaptativa especfica que assegura a sua sobrevivncia em condies desfavorveis. Esta adaptao inclui alteraes na composio da membrana, na maquinaria de traduo e transcrio. A resposta ao choque trmico pelo frio induz uma represso da transcrio. No entanto, a descida de temperatura induz a produo de um grupo de protenas especficas que ajudam a ajustar/re-ajustar o metabolismo celular s novas condies ambientais. Em E. coli o processo de adaptao demora apenas quatro horas, no qual um grupo de protenas especficas so induzidas. Depois desde perodo recomea lentamente a produo de protenas.A ribonuclease R, uma das protenas induzidas durante o choque trmico pelo frio, uma das principais ribonucleases em E. coli envolvidas na degradao do RNA. uma exoribonuclease que degrada RNA de cadeia dupla, possui funes importantes na maturao e turnover do RNA, libertao de ribossomas e controlo de qualidade de protenas e RNAs. O nvel celular desta enzima aumenta at dez vezes aps exposio ao frio e estabiliza em clulas na fase estacionria. A capacidade de degradar RNA de dupla cadeia importante a baixas temperaturas quando as estruturas de RNA esto mais estveis. No entanto, este mecanismo desconhecido. Embora a resposta especfica ao cold shock tenha sido descoberta h mais de duas dcadas e o nmero de protenas envolvidas sugerirem que esta adaptao rpida e simples, continuamos longe de compreender este processo. No nosso trabalho pretendemos descobrir protenas que interactuem com a RNase R em condies ambientais diferentes atravs do mtodo TAP-tag e espectrometria de massa. A informao obtida pode ser utilizada para deduzir algumas das novas funes da RNase R durante a adaptao bacteriana ao frio e durante a fase estacionria. Mais importante ainda, RNase R poder ser recrutada para um complexo de protenas de elevado peso molecular durante o cold-shock.------------ABSTRACT:Microorganisms react to the rapid temperature downshift with a specific adaptative response that ensures their survival in unfavorable conditions. Adaptation includes changes in membrane composition, in translation and transcription machinery. Cold shock response leads to overall repression of translation. However, temperature downshift induces production of a set of specific proteins that help to tune cell metabolism and readjust it to the new environmental conditions. For Escherichia coli the adaptation process takes only about four hours with a relatively small set of specifically induced proteins involved. After this time, protein production resumes, although at a slower rate. One of the cold inducible proteins is RNase R, one of the main E. coli ribonucleases involved in RNA degradation. RNase R is an exoribonuclease that digest double stranded RNA, serves important functions in RNA maturation and turnover, release of stalled ribosomes by trans-translation, and RNA and protein quality control. The level of this enzyme increases about ten-fold after cold induction, and it is also stabilised in cells growing in stationary phase. The RNase R ability to digest structured RNA is important at low temperatures where RNA structures are stabilized but the exact role of this mechanism remains unclear. Although specific bacterial cold shock response was discovered over two decades ago and the number of proteins involved suggests that this adaptation is fast and simple, we are still far from understanding this process. In our work we aimed to discover the proteins interacting with RNase R in different environmental conditions using TAP tag method and mass spectrometry analysis. The information obtained can be used to deduce some of the new functions of RNase R during adaptation of bacteria to cold and in stationary growth phase. Most importantly RNase R can be recruited into a high molecular mass complex of protein in cold shock.
Resumo:
Dissertao para a obteno do grau de mestre em Bioqumica Estrutural e Funcional
O Partido Comunista Portugus e a Guerra Fria: sectarismo, desvio de direita, Rumo vitria (1949-1965)
Resumo:
Dissertao apresentada para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Doutor em Histria Institucional e Poltica Contempornea
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Bioqumica Estrutural e Funcional
