Desulfovibrio vulgaris defenses against oxidative and nitrosative stresses

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biochemistry, Microbial Biochemistry

Functional and structural studies of two enzymes: membrane bound kinase and Z-DNA/Z-RNA-binding protein

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Sistemas de Bioengenharia

Arte em Construção: Análise Documental Sobre o Projecto “DNA – District of New Art”, Lisboa

Trabalho de Projecto realizado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Comunicação – Cinema e Televisão

DNA-Protein interaction: a response regulatory protein associated with Mo homeostasis in Desulfovibrio alaskensis G20.

Dissertation for a degree in Doctor in Sustainable Chemistry

Estudo da ação danificadora do 2,2'-Bipyridyl no DNA na presença de radiação UV

Em 2008, foram estimados no mundo, cerca de 12.7 milhões de novos casos de cancro e 7,6 milhões de mortes por cancro, sendo que 56% dos casos e 64% das mortes ocorreram nos países em desenvolvimento. Estes números indicam que é necessário se encontrar novos meios de combater este flagelo. Uma das possibilidades é encontrar moléculas intercalantes do ácido desoxirribonucleico (DNA) que se degradem na presença de radiação ou partículas carregadas de baixa energia que criem condições de induzir lesões no DNA, inibidoras da replicação e que portanto contribuam para a não proliferação de células cancerígenas. Assim, nesta dissertação analisou-se a influência do agente intercalante 2,2'-Bipyridyl do DNA em presença de radiação UV, 254 nm, na degradação do DNA. Os danos criados no DNA foram analisados pelas técnicas de espectroscopia de ultravioleta-visível e de infravermelho. Os resultados obtidos permitiram inferir que a cinética de degradação do DNA é mais eficiente na presença do composto 2,2'-Bipyridyl e que o ataque pelos produtos da decomposição do 2,2'-Bipyridyl é feito a todas as bases, embora com constantes características diferentes, sendo a ataque à guanina com uma constante de tempo maior. Estes resultados permitem concluir que este composto pode ser um possível candidato a indutor de lesões no DNA.

Alteração da metilação do DNA após exposição prolongada a fitoquímicos

Parte do trabalho efetuado durante este projeto de dissertação foi publicado na revista Chemico-Biological Interactions. E apresentado no “50th Congress of the European Societies of Toxicology 7th - 10th September 2014 Edinburgh International Conference Centre, Edinburgh, Scotland” em forma de poster.

Biological effects of acrylic engineered particulate-systems

Polymeric particulate-systems are of great relevance due to their possible biomedical applications, among them as carriers for the nano- or microencapsulation of drugs. However, due to their unique specific properties, namely small size range, toxicity issues must be discarded before allowing its use on health-related applications. Several polymers, as poly(methyl methacrylate) (PMMA), have proved to be suitable for the preparation of particulate-systems. However, a major drawback of its use refers to incomplete drug release from particles matrix. Recent strategies to improve PMMA release properties mention the inclusion of other acrylic polymers as Eudragit (EUD) on particles formulation. Though PMMA and EUD are accepted by the FDA as biocompatible, their safety on particle composition lacks sufficient toxicological data. The main objective of this thesis was to evaluate the biological effects of engineered acrylic particulate-systems. Preparation, physicochemical characterization and in vitro toxicity evaluation were assessed on PMMA and PMMA-EUD (50:50) particles. The emulsification-solvent evaporation methodology allowed the preparation of particles with spherical and smooth surfaces within the micrometer range (±500 nm), opposing surface charges and different levels of hydrophobicity. It was observed that particles physicochemical properties (size and charge) were influenced by biological media composition, such as serum concentration, ionic strength or pH. In what concerns to the in vitro toxicological studies, particle cellular uptake was observed on different cell lines (macrophages, osteoblasts and fibroblasts). Cytotoxicity effects were only found after 72 h of cells exposure to the particles, while no oxidative damage was observed neither on osteoblasts nor fibroblasts. Also, no genotoxicity was found in fibroblast using the comet assay to assess DNA damage. This observation should be further confirmed with other validated genotoxicity assays (e.g. Micronucleus Assay). The present study suggests that the evaluated acrylic particles are biocompatible, showing promising biological properties for potential use as carriers in drug-delivery systems.

A descoberta da Dupla Hélice do DNA: contributo para possíveis narrativas

Até ao final dos anos 40, o DNA não era reconhecido como portador da informação genética. Era uma molécula demasiado simples, difícil de isolar e incompatível com os métodos de análise da química orgânica e da biologia. Quando alguns cientistas começam a acreditar na importância do DNA, percebem que são incapazes, tecnicamente, de determinar a sua estrutura. É nesse espírito que James Watson vai para a Europa e, na primavera de 1951, ao assistir à conferência de Maurice Wilkins, da King’s College, onde vê uma fotografia do padrão de difração de raios X, percebe que será esta a técnica chave para a determinação da estrutura do DNA e, subsequentemente, dos segredos da vida. É este o início de uma das possíveis narrativas sobre uma das principais descobertas científicas do séc. XX que muitas vezes se reduz a: “A dupla hélice do DNA foi descoberta em 1953 por Watson e Crick”. Esta dissertação propõe-se a demonstrar que, apesar de em termos estritos, se tratar de uma afirmação verdadeira, não é suficiente para garantir uma experiência pedagógica significativa, nem fazer jus ao que é o funcionamento da ciência, com todas as implicações humanas, contextuais, éticas, consequências e impacto.

Nanomateriais manufaturados : avaliação de segurança através da caracterização dos seus efeitos genéticos

RESUMO - Os nanomateriais manufaturados (NMs), isto é, fabricados deliberadamente para fins específicos, apresentam propriedades físico-químicas únicas como a dimensão, área superficial ou funcionalização, que lhes conferem caraterísticas mecânicas, óticas, elétricas e magnéticas muito vantajosas para aplicações industriais e biomédicas. Efetivamente, a tecnologia baseada nos NMs, ou nanotecnologia, foi identificada como uma key enabling technology, impulsionadora do crescimento económico dos países industrializados, devido ao seu potencial para melhorar a qualidade e desempenho de muitos tipos de produtos e de processos. Contudo, a expansão da utilização de NMs contrasta com a insuficiente avaliação de risco para a saúde humana e para o ambiente, sendo considerados como um risco emergente para a saúde pública. As incertezas sobre a segurança dos NMs para a saúde pública advêm sobretudo de estudos epidemiológicos em humanos expostos a nanomateriais produzidos como consequência dos processos e atividades humanas e da poluição. Uma das principais preocupações relativamente aos efeitos adversos dos NMs na saúde humana é o seu potencial efeito carcinogénico, que é sugerido por alguns estudos experimentais, como no caso dos nanomateriais de dióxido de titânio ou dos nanotubos de carbono. Para avaliar em curto termo as propriedades carcinogénicas de um composto, utilizam-se frequentemente ensaios de genotoxicidade em linhas celulares de mamífero ou ensaios em modelos animais, em que se analisa uma variedade de lesões genéticas potencialmente relacionados com o processo de carcinogénese. No entanto, a investigação sobre as propriedades genotóxicas dos NMs não foi, até hoje, conclusiva. O presente estudo tem por objectivo principal caracterizar os efeitos genotóxicos associados à exposição a nanomateriais manufaturados, de forma a contribuir para a avaliação da sua segurança. Constituíram objectivos específicos deste estudo: i) avaliar a genotoxicidade dos NMs em três tipos de células humanas expostas in vitro: linfócitos humanos primários, linha celular de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) e linha celular de adenocarcinoma epitelial de pulmão humano (A549); ii) avaliar a sua genotoxicidade num modelo de ratinho transgénico; iii) investigar alguns mecanismos de acção que poderão contribuir para a genotoxicidade dos nanomateriais, como a contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade induzida pelos NMs in vitro, e a investigação da sua bioacumulação e localização celular in vivo. Foram analisados os efeitos genotóxicos associados à exposição a duas classes de NMs, dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla, bem como a um NM de óxido de zinco, candidato a ser utlilizado como controlo positivo de dimensão nanométrica. Os xx NMs utilizados foram previamente caracterizados com detalhe relativamente às suas características físico-químicas e também relativamente à sua dispersão em meio aquoso e no meio de cultura. A metodologia incluiu ensaios de citotoxicidade e de genotoxicidade in vitro, designadamente, ensaios de quebras no DNA (ensaio do cometa) e nos cromossomas (ensaio do micronúcleo) em células humanas expostas a várias concentrações de NMs, por comparação com células não expostas. Também foram realizados ensaios in vivo de quebras no DNA, quebras cromossómicas e ainda um ensaio de mutações em vários órgãos de grupos de ratinhos transgénicos LacZ, expostos por via intravenosa a duas doses de dióxido de titânio. Foi investigada a existência de uma relação dose-resposta após exposição das células humanas ou dos animais a NMs. A contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade após exposição das células aos NMs in vitro foi explorada através do ensaio do cometa modificado com enzima. Realizaram-se estudos histológicos e citológicos para deteção e localização celular dos NMs nos órgãos-alvo dos ratinhos expostos in vivo. Os resultados demonstraram efeitos genotóxicos em alguns dos NMs analisados em células humanas. No entanto, os efeitos genotóxicos, quando positivos, foram em níveis reduzidos, ainda que superiores aos valores dos controlos, e a sua reprodutibilidade era dependente do sistema experimental utilizado. Para outros NMs, a evidência de genotoxicidade revelou-se equívoca, conduzindo à necessidade de esclarecimento através de ensaios in vivo. Para esse fim, recorreu-se a uma análise integrada de múltiplos parâmetros num modelo animal, o ratinho transgénico baseado em plasmídeo contendo o gene LacZ exposto a um NM de dióxido de titânio, NM-102. Embora tenha sido demonstrada a exposição e a acumulação do NM no fígado, não se observaram efeitos genotóxicos nem no fígado, nem no baço nem no sangue dos ratinhos expostos a esse NM. Neste estudo concluiu-se que algumas formas de dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla produzem efeitos genotóxicos em células humanas, contribuindo para o conjunto de evidências sobre o efeito genotóxico desses NMs. As diferenças observadas relativamente à genotoxicidade entre NMs do mesmo tipo, mas distintos em algumas das suas características físico-quimicas, aparentemente não são negligenciáveis, pelo que os resultados obtidos para um NM não devem ser generalizados ao grupo correspondente. Para além disso, a genotoxicidade equívoca verificada para o NM-102 em células humanas expostas in vitro, não foi confirmada no modelo in vivo, pelo que o valor preditivo da utilização dos ensaios in vitro para a identificação de NMs com efeitos genotóxicos (e portanto potencialmente carcinogénicos) ainda tem de ser esclarecido antes de ser possível extrapolar as conclusões para a saúde humana. Por sua vez, como a informação aqui produzida pelas metodologias in vitro e in vivo não reflete os efeitos de exposição continua ou prolongada, que poderá conduzir a efeitos genotóxicos distintos, esta xxi deverá ser complementada com outras linhas de evidência relativamente à segurança dos NMs. Perante a incerteza dos níveis de exposição real do organismo humano e do ambiente, a segurança da utilização dos NMs não pode ser garantida a longo prazo e, tendo em conta a elevada produção e utilização destes NMs, são prementes futuros estudos de monitorização ambiental e humana.