Nanomateriais manufaturados : avaliação de segurança através da caracterização dos seus efeitos genéticos

RESUMO - Os nanomateriais manufaturados (NMs), isto é, fabricados deliberadamente para fins específicos, apresentam propriedades físico-químicas únicas como a dimensão, área superficial ou funcionalização, que lhes conferem caraterísticas mecânicas, óticas, elétricas e magnéticas muito vantajosas para aplicações industriais e biomédicas. Efetivamente, a tecnologia baseada nos NMs, ou nanotecnologia, foi identificada como uma key enabling technology, impulsionadora do crescimento económico dos países industrializados, devido ao seu potencial para melhorar a qualidade e desempenho de muitos tipos de produtos e de processos. Contudo, a expansão da utilização de NMs contrasta com a insuficiente avaliação de risco para a saúde humana e para o ambiente, sendo considerados como um risco emergente para a saúde pública. As incertezas sobre a segurança dos NMs para a saúde pública advêm sobretudo de estudos epidemiológicos em humanos expostos a nanomateriais produzidos como consequência dos processos e atividades humanas e da poluição. Uma das principais preocupações relativamente aos efeitos adversos dos NMs na saúde humana é o seu potencial efeito carcinogénico, que é sugerido por alguns estudos experimentais, como no caso dos nanomateriais de dióxido de titânio ou dos nanotubos de carbono. Para avaliar em curto termo as propriedades carcinogénicas de um composto, utilizam-se frequentemente ensaios de genotoxicidade em linhas celulares de mamífero ou ensaios em modelos animais, em que se analisa uma variedade de lesões genéticas potencialmente relacionados com o processo de carcinogénese. No entanto, a investigação sobre as propriedades genotóxicas dos NMs não foi, até hoje, conclusiva. O presente estudo tem por objectivo principal caracterizar os efeitos genotóxicos associados à exposição a nanomateriais manufaturados, de forma a contribuir para a avaliação da sua segurança. Constituíram objectivos específicos deste estudo: i) avaliar a genotoxicidade dos NMs em três tipos de células humanas expostas in vitro: linfócitos humanos primários, linha celular de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) e linha celular de adenocarcinoma epitelial de pulmão humano (A549); ii) avaliar a sua genotoxicidade num modelo de ratinho transgénico; iii) investigar alguns mecanismos de acção que poderão contribuir para a genotoxicidade dos nanomateriais, como a contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade induzida pelos NMs in vitro, e a investigação da sua bioacumulação e localização celular in vivo. Foram analisados os efeitos genotóxicos associados à exposição a duas classes de NMs, dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla, bem como a um NM de óxido de zinco, candidato a ser utlilizado como controlo positivo de dimensão nanométrica. Os xx NMs utilizados foram previamente caracterizados com detalhe relativamente às suas características físico-químicas e também relativamente à sua dispersão em meio aquoso e no meio de cultura. A metodologia incluiu ensaios de citotoxicidade e de genotoxicidade in vitro, designadamente, ensaios de quebras no DNA (ensaio do cometa) e nos cromossomas (ensaio do micronúcleo) em células humanas expostas a várias concentrações de NMs, por comparação com células não expostas. Também foram realizados ensaios in vivo de quebras no DNA, quebras cromossómicas e ainda um ensaio de mutações em vários órgãos de grupos de ratinhos transgénicos LacZ, expostos por via intravenosa a duas doses de dióxido de titânio. Foi investigada a existência de uma relação dose-resposta após exposição das células humanas ou dos animais a NMs. A contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade após exposição das células aos NMs in vitro foi explorada através do ensaio do cometa modificado com enzima. Realizaram-se estudos histológicos e citológicos para deteção e localização celular dos NMs nos órgãos-alvo dos ratinhos expostos in vivo. Os resultados demonstraram efeitos genotóxicos em alguns dos NMs analisados em células humanas. No entanto, os efeitos genotóxicos, quando positivos, foram em níveis reduzidos, ainda que superiores aos valores dos controlos, e a sua reprodutibilidade era dependente do sistema experimental utilizado. Para outros NMs, a evidência de genotoxicidade revelou-se equívoca, conduzindo à necessidade de esclarecimento através de ensaios in vivo. Para esse fim, recorreu-se a uma análise integrada de múltiplos parâmetros num modelo animal, o ratinho transgénico baseado em plasmídeo contendo o gene LacZ exposto a um NM de dióxido de titânio, NM-102. Embora tenha sido demonstrada a exposição e a acumulação do NM no fígado, não se observaram efeitos genotóxicos nem no fígado, nem no baço nem no sangue dos ratinhos expostos a esse NM. Neste estudo concluiu-se que algumas formas de dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla produzem efeitos genotóxicos em células humanas, contribuindo para o conjunto de evidências sobre o efeito genotóxico desses NMs. As diferenças observadas relativamente à genotoxicidade entre NMs do mesmo tipo, mas distintos em algumas das suas características físico-quimicas, aparentemente não são negligenciáveis, pelo que os resultados obtidos para um NM não devem ser generalizados ao grupo correspondente. Para além disso, a genotoxicidade equívoca verificada para o NM-102 em células humanas expostas in vitro, não foi confirmada no modelo in vivo, pelo que o valor preditivo da utilização dos ensaios in vitro para a identificação de NMs com efeitos genotóxicos (e portanto potencialmente carcinogénicos) ainda tem de ser esclarecido antes de ser possível extrapolar as conclusões para a saúde humana. Por sua vez, como a informação aqui produzida pelas metodologias in vitro e in vivo não reflete os efeitos de exposição continua ou prolongada, que poderá conduzir a efeitos genotóxicos distintos, esta xxi deverá ser complementada com outras linhas de evidência relativamente à segurança dos NMs. Perante a incerteza dos níveis de exposição real do organismo humano e do ambiente, a segurança da utilização dos NMs não pode ser garantida a longo prazo e, tendo em conta a elevada produção e utilização destes NMs, são prementes futuros estudos de monitorização ambiental e humana.

ABSTRACT - The manufactured nanomaterials (NMs) have specific physicochemical properties that confer unique mechanical, optical, electrical and magnetic characteristics that are beneficial for biomedical and industrial applications. However, the exponential developments of nanotechnologies contrast with the still insufficient risk assessment for human health and the environment, leading to uncertainities in terms of public health. The concerns about the potential risks of NMs for public health arise mainly from epidemiologic studies in humans exposed to nanomaterials generated as by-products from human activity and pollution. One of the major concerns about NMs is the potential to induce cancer, suggested by some experimental studies, as seen for titanium dioxide or carbon nanotubes. To analyse in a short term the carcinogenic properties of a compound, genotoxicity assays in mammalian cell lines or animal models are frequently used. However, the investigation of the genotoxic properties of NMs has been inconclusive, up to date. The present work aimed at evaluating the genotoxic effects associated with the exposure to NMs, in order to contribute to the identification of adverse effects and safety evaluation of the NMs. The specific objectives were to: i) evaluate the in vitro genotoxicity of NMs using three cell types: human lymphocytes, human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (A549); ii) evaluate the genotoxicity in a transgenic mousse model exposed in vivo; iii) investigate some of the mechanisms of action that may underlie NMs genotoxicity in vitro, such as oxidative lesions, and analyse the NMs‘ bioaccumulation and cellular localization in mouse tissue. Two classes of NMs were analysed in the presente study, namely, titanium dioxide nanomaterials and multiwalled carbon nanotubes, as well as a zinc oxide nanomaterial as a potential candidate to be used as nanosized positive control. The morphology and size of those NMs were previously characterized, as well as their dispersion in aqueous medium and cell culture medium. The methodology included citotoxicty and genotoxicity assays in vitro and in vivo, namely, assays for detection of DNA strand breaks and chromosome breakage/loss in human and mouse cells exposed to NMs that have been characterized in respect to their physic-chemical properties. An assay for gene mutations in a LacZ-based transgenic mouse model was also performed. The results show the genotoxic effects of some of the NMs analysed, in human cells. However, even with those forms of NMs that were positive in our study, the observed genotoxicty was low, though higher then the negative control values, and their reprodutibility was dependent on the experimental system that was used. For some NMs, the equivocal xxiv genotoxic effects observed in vitro prompted further investigation using in vivo assays. The LacZ-based transgenic mouse model was used in an integrated approach in which several endpoints were analysed following exposure to a titanium dioxide nanomaterial, NM-102. Although the bioaccumulation of the NM in liver was demonstrated, no genotoxic effects were observed in liver, spleen or blood (thus bone marrow) from mice exposed to two doses of NM- 102. In conclusion, the findings described in this study show that some forms of titanium dioxide and multiwalled carbon nanotubes yield genotoxic effects in human cells, increasing the weight of evidence towards a genotoxic effect of some of the forms of titanium dioxide and multiwalled carbon nanotubes analysed in human cells in vitro. Regarding safety assessment, the different genotoxicity observed in closely related NMs, but that differs in some physicochemical characteristics, highlights the importance of investigating the toxic potential of each NM individually, instead of assuming a common mechanism and equal genotoxic effects for a set of similar NMs. Furthemore, the equivocal genotoxicity of NM-102 in human cells in vitro was not confirmed in vivo, and therefore the predictive value of these in vitro tests for identifying genotoxic (and potentially carcinogenic) NMs in vivo should be clarified before extrapolating the conclusions for human health. Furthemore, the data hereby presented using in vitro and in vivo approaches does not reflect continuous exposure and data on prolonged exposure and accumulation of NMs in vivo may lead to different genotoxic consequences. Thus, it should be complemented with other lines of evidence related to the levels and duration of individual‘s exposure, both in environment and occupational settings.