Interac����o Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a f��rmacos

RESUMO As leishmanioses s��o doen��as causadas por um protozo��rio intracelular pertencente �� ordem Kinetoplastida, da fam��lia Trypanosomatidae, do g��nero Leishmania. Os parasitas s��o transmitidos aos hospedeiros vertebrados por d��pteros pertencentes �� sub-fam��lia Phlebotominae. Devido �� inexist��ncia de vacinas a quimioterap��utica continua a representar o ��nico mecanismo de preven����o e controlo. Os f��rmacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB liposs��mica est�� a ser cada vez mais utilizada como 1�� linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, respons��veis pela resist��ncia, �� fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos f��rmacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os f��rmacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resist��ncia. Espera-se do modelo animal a reprodu����o da infec����o na Natureza. Os modelos canino e murino t��m ajudado na compreens��o dos mecanismos respons��veis pela patog��nese e pela resposta imunit��ria �� infec����o por Leishmania. Sendo o c��o o principal hospedeiro da infec����o por L. infantum e o principal reservat��rio dom��stico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se �� caracteriza����o da evolu����o da infec����o experimental em can��deos de ra��a Beagle atrav��s da an��lise cl��nica, hematol��gica, histopatol��gica, parasit��ria, assim com atrav��s da resposta imunit��ria desenvolvida. As altera����es hematol��gicas observadas foram as associadas �� leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das prote��nas totais e da frac����o gama-globulina, e diminui����o da albumina. Histologicamente observou-se nos ��rg��os viscerais uma reac����o inflamat��ria cr��nica, acompanhada por vezes da forma����o de granulomas ricos em macr��fagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presen��a do parasita nos v��rios tecidos e ��rg��os recolhidos na necr��psia), os ��nicos sinais cl��nicos observados transitoriamente foram adenopatia e alop��cia. As t��cnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detec����o do parasita do que os m��todos parasitol��gicos convencionais. As amostras n��o invasivas (sangue perif��rico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detec����o de leishmanias. No nosso modelo experimental n��o se observou a supress��o da resposta celular ao antig��nio parasit��rio e confirmou-se que, apesar de n��o protectora, a resposta humoral espec��fica �� pronunciada e precoce. A bipolariza����o da resposta imunit��ria Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infec����es experimentais por L. major no modelo murino, n��o foram observadas neste estudo. O facto dos animais n��o evidenciarem doen��a apesar do elevado parasitismo nos ��rg��os viscerais poder�� estar relacionado com a express��o simult��nea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no ba��o, fígado, g��nglio, medula ��ssea e sangue perif��rico. Neste estudo tamb��m se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infec����o experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intrad��rmica. A visceraliza����o da infec����o ocorreu ap��s a utiliza����o da via de administra����o do in��culo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da dissemina����o dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma gl��ndula salivar ter sido anterior �� do grupo inoculado apenas com parasitas, n��o se detectaram diferen��as significativas na carga parasit��ria, entre os tr��s grupos, ao longo do per��odo de observa����o pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como respons��vel pela exacerba����o da infec����o, tal n��o foi observado no nosso estudo. O aumento de express��o de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, n��o se observou bipolariza����o da resposta imunit��ria. Os animais dos tr��s grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes ��rg��os uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predomin��ncia da express��o Th1 (TNF-��), no fim do per��odo de observa����o, o que pode estar relacionado com a resolu����o da infec����o. Por outro lado, a presen��a de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hip��tese da exist��ncia de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Ap��s se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmiss��o das estirpes resistentes a este f��rmaco, pelo que o tratamento com AMB poder�� ser favor��vel �� preven����o e controlo atrav��s da interrup����o do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes f��rmacos utilizados na terap��utica da leishmaniose humana e canina (Glucantime��, Fungizone��, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas ax��nicos com o sistema amatigota-macr��fago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas n��o apresentavam diferen��as significativas sendo a utiliza����o do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais f��cil execu����o. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposi����o prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os n��o tratados �� ac����o dos f��rmacos estudados, com excep����o do alopurinol. A diminui����o da susceptibilidade das estirpes aos f��rmacos utilizados poder�� facilitar a dispers��o de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indu����o de uma resposta imune por ac����o de compostos anti- Leishmania, determinou-se o n��mero de amastigotas apopt��ticos assim como a produ����o de TNF-�� e IL-10 pelos macr��fagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produ����o de IL-10, inibidora da activa����o dos macr��fagos, contudo nem a produ����o da citocina pro-inflamat��ria TNF- �� nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos respons��veis �� sobreviv��ncia dos parasitas ao contacto com os f��rmacos.

Caracteriza����o da fun����o do mon��xido de azoto e glutationo hep��ticos na sensabilidade perif��rica �� insulina

xi RESUMO A ac����o da insulina no m��sculo esquel��tico depende de um reflexo parassimp��tico hep��tico que conduz �� liberta����o de uma subst��ncia hep��tica sensibilizadora da insulina, designada por HISS, respons��vel por cerca de 55% do efeito hipoglicemiante da insulina. A ac����o da HISS �� finamente regulada pelo mon��xido de azoto (NO) hep��tico e pelo estado prandial, aumentando no per��odo p��s-prandial imediato e diminuindo progressivamente com as horas de jejum. A secre����o da HISS pode ser inibida cir��rgica ou farmacologicamente, quer por desnerva����o selectiva do plexo anterior hep��tico, quer por administra����o de atropina, quer por inibi����o do sintase do NO (NOS) hep��tico. O objectivo geral do trabalho apresentado nesta disserta����o foi a caracteriza����o da via de transdu����o de sinal que conduz �� liberta����o da HISS. O modelo utilizado neste estudo foi o rato Wistar. A sensibilidade �� insulina foi avaliada atrav��s do teste r��pido de sensibilidade �� insulina (RIST). A primeira hip��tese de trabalho testada foi que a sequ��ncia de eventos que conduzem �� secre����o da HISS inicia-se com a activa����o do sistema parassimp��tico hep��tico seguida de activa����o do NOS hep��tico com subsequente produ����o de NO e activa����o do guanilato ciclase (GC). Observou-se que a administra����o de um dador de NO reverteu a resist��ncia �� insulina induzida, quer por inibi����o do NOS hep��tico, quer por antagonismo dos receptores muscar��nicos com atropina. Em contraste, a resist��ncia �� insulina produzida por inibi����o do NOS hep��tico n��o foi revertida por administra����o intraportal de acetilcolina (ACh). Constatou-se que a inibi����o do GC hep��tico diminuiu a sensibilidade �� insulina. Estes resultados sugerem que: a ACh libertada no fígado induz a s��ntese de NO hep��tico que conduz �� liberta����o da HISS, que por sua vez �� modulada pelo GC hep��tico. A liberta����o da HISS em resposta �� insulina �� regulada pelo estado prandial. Uma vez que os n��veis hep��ticos de glutationo (GSH) se encontram, tal como a HISS, diminu��dos no estado de jejum e aumentados ap��s a ingest��o de uma refei����o, testou-se a hip��tese de que o GSH hep��tico est�� envolvido na secre����o da HISS. Observou-se que a deple����o do GSH hep��tico induziu resist��ncia �� insulina, compar��vel �� obtida ap��s inibi����o do NOS hep��tico. Estes resultados suportam a hip��tese de que o GSH hep��tico desempenha um papel cr��tico na ac����o perif��rica da insulina. Considerando que, no estado de jejum, tanto os n��veis de GSH hep��tico como os n��veis de NO hep��tico s��o baixos, testou-se a hip��tese de que a co-administra����o intraportal de um dador de GSH e de um dador de NO promove um aumento da sensibilidade �� insulina no estado de jejum, devido ao restabelecimento do mecanismo da HISS. Observou-se que a administra����o sequencial de dadores de GSH e de NO no fígado provocou um aumento na sensibilidade �� insulina, dependente da dose de dador de GSH administrada. Concluiu-se portanto que ambos, GSH e NO, s��o essenciais para que o mecanismo da HISS esteja completamente funcional. O GSH e o NO reagem para formar um S-nitrosotiol, o S-nitrosoglutationo (GSNO). Os resultados supra-mencionados conduziram �� formula����o da hip��tese de que a secre����o/ac����o da HISS depende da forma����o de GSNO. Observou-se que a administra����o intravenosa de S-nitrosoti��is (RSNOs) aumentou a sensibilidade �� insulina, em animais submetidos a um per��odo de jejum, ao contr��rio da administra����o intraportal destes f��rmacos, o que RSNOs t��m uma ac����o perif��rica, mas n��o hep��tica, na sensibilidade �� insulina. Os resultados obtidos conduziram �� reformula����o da hip��tese da HISS, sugerindo que a ingest��o de uma refei����o activa os nervos parassimp��ticos hep��ticos levando �� liberta����o de ACh no fígado que, por sua vez activa o NOS. Simultaneamente, ocorre um aumento dos n��veis de GSH hep��tico que reage com o NO hep��tico para formar um composto nitrosado, o GSNO. Este composto mimetiza a ac����o hipoglicemiante da HISS no m��sculo esquel��tico. SUMMARY Insulin action at the skeletal muscle depends on a hepatic parasympathetic reflex that promotes the release of a hepatic insulin sensitizing substance (HISS) from the liver, which contributes 55% to total insulin action. HISS action is modulated by hepatic nitric oxide (NO) and also by the prandial status so as to, in the immediate ostprandial state, HISS action is maximal, decreasing with the duration of fasting. HISS secretion may be inhibited by interruption of the hepatic parasympathetic reflex, achieved either by surgical denervation of the liver or by cholinergic blockade with atropine, or by prevention of hepatic NO release, using NO synthase (NOS) antagonists. The main objective of this work was to characterize the signal transduction pathways that lead to HISS secretion by the liver. Wistar rats were used and insulin sensitivity was evaluated using the rapid insulin sensitivity test (RIST). The first hypothesis tested was that the sequence of events that lead to HISS secretion starts with an increase in the hepatic parasympathetic tone, followed by the activation of hepatic NOS and subsequent triggering of guanylate cyclase (GC). We observed that insulin resistance produced either by muscarinic receptor antagonism with atropine or by hepatic NOS inhibition was reversed by the intraportal administration of an NO donor. In contrast, intraportal acetylcholine (ACh) did not restore insulin sensitivity after NOS inhibition. We also observed that GC inhibition lead to a decrease in insulin sensitivity.These results suggest that the release of ACh in the liver activates hepatic NO synthesis in order to allow HISS secretion, through a signaling pathway modulated by GC. HISS release in response to insulin is controlled by the prandial status. The second hypothesis tested was that glutathione (GSH) is involved in HISS secretion since the hepatic levels of GSH are, like HISS action, decreased in the fasted state and increased after ingestion of a meal. We observed that hepatic GSH depletion led to insulin resistance of the same magnitude of that observed after inhibition of hepatic NOS. These results support the hypothesis that hepatic GSH is crucial in peripheral insulin action. Since, in the fasted state, both hepatic GSH and NO levels are low, we tested the hypothesis that intraportal o-administration of a GSH donor and an NO donor enhances insulin sensitivity in fasted Wistar rats, by restoring HISS secretion. We observed that GSH and NO increased insulin sensitivity in a GSH dose-dependent manner. We concluded that HISS secretion requires elevated levels of both GSH and NO in the liver. GSH and NO react to form a S-nitrosothiol, S-nitrosoglutathione (GSNO). The last hypothesis tested in this work was that HISS secretion/ action depends on the formation of GSNO. We observed that intravenous administration of -nitrosothiols (RSNOs) increased insulin sensitivity in animals fasted for 24 h, in contrast with the intraportal administration of the drug. This result suggests that RSNOs enhanced insulin sensitivity through a peripheral, and not hepatic, mechanism. The results obtained led to a restructuring of the HISS hypothesis, suggesting that the ingestion of a meal triggers the hepatic parasympathetic nerves, leading to the release of Ach in the liver, which in turn activates NOS. Simultaneously, hepatic GSH levels increase and react with NO to form a nitrosated compound, GSNO. S-nitrosoglutathione mimics HISS hypoglycaemic action at the skeletal muscle.

Desindustrializa����o. Reindustrializa����o. Terciariza����o

pp. 75-88

Schistosomose em modelo murino: estudo sobre granuloma hep��tico causado por ovos de Schistosoma mansoni

A schistosomose �� uma doen��a parasit��ria que afecta cerca de 200 milh��es de pessoas, com alta preval��ncia nos tr��picos e que origina um grave problema de sa��de p��blica. Ao longo da infec����o, o sistema imunit��rio tenta de v��rias formas combater a presen��a do parasita. Inicialmente ocorre uma resposta imune mediada por c��lulas do tipo Th1, com o progresso da infec����o, a resposta �� substitu��da por uma resposta do tipo Th2 induzida durante a forma����o de granulomas. Este surge como resposta �� presen��a de produtos t��xicos libertados pelos ovos do parasita retido nos tecidos. O fígado �� o principal alvo do dep��sito de ovos, sofrendo altera����es fisiopatol��gicas, e histol��gicas. O Mus musculus tem sido muito utilizados na infec����o experimental por Schistosoma mansoni, para melhor se conhecer o papel da resposta imunit��ria na forma����o de granulomas hep��ticos. No decorrer da infec����o o granuloma sofre altera����es desencadeadas pelas citocinas que o sistema imunit��rio produz. Estas altera����es dividem-se em cinco fases: reac����o inicial, exsudativa, exsudativa-produtiva, produtiva e involutiva granuloma. O presente trabalho, estudou as altera����es sofridas pelo granuloma hep��tico (quantidade, dimens��o e fase do granuloma), em tr��s diferentes per��odos de infec����o (55, 90 e 125 dias) no modelo animal Mus musculus infectado com Schistosoma. mansoni, estirpe SmBh distribu��dos por tr��s grupos experimentais com diferente n��mero de cerc��rias (50, 80, e 100). Verificou-se que ao longo da infec����o a quantidade de granulomas aumenta, as dimens��es t��m uma tend��ncia inicial para aumentar mas a partir dos 90 dias ap��s a exposi����o sofrem uma diminui����o. No grupo experimental com maior intensidade de infec����o inicial a diminui����o deu-se mais cedo. Em rela����o ��s fases de desenvolvimento do granuloma este sofre altera����es ao longo de toda a infec����o. Assim, aos 55 dias predomina a fase exsudativa, aos 90 todos os grupos apresentam maior percentagem de granulomas na fase produtiva e por fim aos 125 dias prevalece a fase involutiva. Todos estes resultados sugerem que a caracteriza����o do granuloma nas diferentes fases de infec����o pode depender do n��mero de cerc��rias da exposi����o.

Post-transcriptional regulation of HFE gene expression

Thesis presented to obtain the Ph.D. degree in Biology (Molecular Genetics), by the Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia.

Solea senegalensis como bioindicador da qualidade sedimentar estuarina

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obten����o do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICA����O E PATOG��NESE DO V��RUS DA HEPATITE DELTA

O v��rus da hepatite delta (HDV) �� o agente etiol��gico de uma das formas mais graves de hepatite viral e �� ainda end��mico em diversas regi��es do globo, nomeadamente em ��frica, na Amaz��nia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepat��citos infectados com o v��rus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associa����o cl��nica entre os dois v��rus deve-se ao facto do inv��lucro do HDV ser constitu��do pelos antig��nios de superf��cie do HBV (HBsAgs) que s��o necess��rios para a propaga����o da infec����o. O genoma do HDV �� constitu��do por uma mol��cula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma ��nica grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antig��nio delta (HDAg). A ocorr��ncia de um mecanismo de editing do RNA, resulta na express��o de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). V��rias fun����es essenciais para a replica����o do HDV t��m sido atribu��das a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumula����o de RNA viral e a L-HDAg respons��vel pela interac����o com os HBsAgs para formar part��culas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replica����o viral depende das interac����es estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do n��mero consider��vel de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a import��ncia de muitas destas interac����es n��o foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replica����o do HDV permanecem pouco claras. Para al��m disso, dado o n��mero limitado de factores do hospedeiro que est��o envolvidos na sua replica����o, �� muito prov��vel que um n��mero elevado de interactores do HDV permane��a por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identifica����o de prote��nas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta prote��nas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas prote��nas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas caracter��sticas funcionais, foram seleccionadas tr��s destas prote��nas e as suas interac����es com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As tr��s prote��nas seleccionadas foram a ribonucleoprote��na nuclear heterog��nea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a prote��na 2 de liga����o a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras s��o prote��nas de liga����o a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replica����es de outros v��rus com genoma RNA, enquanto a EBP2, �� uma prote��na de localiza����o preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interac����es foram analisadas recorrendo a v��rios ensaios bioqu��micos. No caso da hnRNPC e da HuR, ap��s valida����o no sistema YTH, a capacidade de interac����o com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipita����o em c��lulas de hepatoma humano. Nas mesmas c��lulas, observou-se uma co-localiza����o consider��vel entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribui����o das prote��nas hnRNPC e HuR na replica����o do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas prote��nas pela utiliza����o de short hairpin RNAs (shRNAs) espec��ficos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as prote��nas hnRNPC e HuR end��genas, individualmente resultou numa diminui����o acentuada nos n��veis de express��o dos HDAgs. No que respeita �� EBP2, a interac����o com a S-HDAg foi confirmada em condi����es in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A an��lise por imunofluoresc��ncia indirecta e microscopia confocal revelou co-localiza����o elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucl��olos de c��lulas de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importa����o dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o prop��sito de identificar prote��nas celulares capazes de interagir com um dom��nio espec��fico dos HDAgs, o sinal de localiza����o nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina ��4 (KPNA4). A interac����o da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condi����es in vitro atrav��s de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas prote��nas. Este trabalho permitiu identificar v��rias prote��nas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evid��ncias sugestivas de que algumas das prote��nas identificadas podem desempenhar fun����es importantes no ciclo de replica����o do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replica����o do v��rus.

Marca����o da Anexina V para imagem funcional da apoptose celular

Disserta����o para obten����o do Grau de Mestre em Gen��tica Molecular e Biomedicina

O Partido Comunista Portugu��s e a Guerra Fria: ���sectarismo���, ���desvio de direita���, ���Rumo �� vit��ria��� (1949-1965)

Disserta����o apresentada para cumprimento dos requisitos necess��rios �� obten����o do grau de Doutor em Hist��ria Institucional e Pol��tica Contempor��nea

Regula����o integrada do metabolismo da glucose no estado p��s-prandial : fisiologia e revers��o de processos patol��gicos

Resumo: Os mecanismos que regulam a homeostase da glucose no p��s-prandial s��o distintos dos mecanismos desencadeados em situa����es de jejum. Desta forma o fígado parece desempenhar um papel fundamental na ac����o perif��rica da insulina ap��s a refei����o atrav��s de um mecanismo que envolve os nervos parassimp��ticos hep��ticos e o ��xido n��trico (NO). Esta disserta����o procura evidenciar a import��ncia de ambos na fi siologia de manuten����o da glic��mia p��s-prandial e na fi siopatologia da resist��ncia �� insulina. Dos resultados obtidos observou-se que ap��s a administra����o de uma refei����o mista o perfi l glic��mico foi distinto em animais com ou sem abla����o dos nervos parassimp��ticos hep��ticos. A desnerva����o parassimp��tica hep��tica aumentou as excurs��es de glucose imediatamente ap��s a refei����o. Estas diferen��as nas excurs��es de glucose dependentes do parassimp��tico ocorreram devido a uma diminui����o da clearance de glucose, sem que fosse afectada a taxa de aparecimento de glucose no sangue, a produ����o end��gena de glucose e secre����o de insulina ou p��ptido-C. Este aumento das excurs��es de glucose revelou-se ser devida �� diminui����o da clearance de glucose p��s-prandial exclusivamente no m��sculo-esquel��tico, cora����o e o rim. Concluiu-se que o fígado teria uma fun����o end��crina nestes tr��s ��rg��os. Surgiu assim a hip��tese dos S-nitrosotiois (RSNOs) poderem mimetizar essa resposta end��crina. Testou-se o seu efeito in vivo na sensibilidade �� insulina. Para n��veis baixos de sensibilidade �� insulina, como jejum, desnerva����o no estado p��s-prandial e resist��ncia �� insulina os RSNOs potenciaram a sensibilidade �� insulina para valores semelhantes ao p��s-prandial indicando-os como potenciais f��rmacos no tratamento da resist��ncia �� insulina. O NO e seus derivados ganharam assim uma evid��ncia cada vez maior na ac����o perif��rica da insulina e portanto fez-se uma caracteriza����o dos seus n��veis desde a fi siologia �� fi siopatologia. Os resultados obtidos nesta disserta����o permitiram correlacionar a sintetase de ��xido n��trico (NOS), enzima respons��vel pela s��ntese de NO como um poss��vel marcador da resist��ncia �� insulina. Os resultados obtidos contribu��ram substancialmente para compreender os mecanismos fi siol��gicos e fi siopatol��gicos de manuten����o da glic��mia ap��s a refei����o, colocando o fígado como ��rg��o primordial na regula����o perif��rica (extra-hep��tica) da capta����o de glucose.-------- ABSTRACT: The mechanisms responsible for the postprandial response are different from the ones in the fasted state. Therefore the liver seems to play a fundamental role in postprandial insulin action through a mechanism that evolves the hepatic parasympathetic nerves (HPN) and nitric oxide (NO). This work focused on the importance of both, HPN and NO, on postprandial glycemic control and on the pathophysiology of insulin resistance. We observed that after administration of a mixed meal the glycemic profi les with or without the parasympathetic nerves were distinct, increasing glucose excursions after ablation of HPN.This increase in glucose excursions was due to a decrease on the rate of glucose disappearance in extra-hepatic tissues. Glucose appearance rate, endogenous glucose production and insulin secretion were not related to this mechanism. The increase on glucose excursions after the ablation of hepatic parasympathetic system was due to a decrease on glucose clearance on extra-hepatic tissues, namely skeletal-muscle, heart and kidney. We concluded that the liver has an endocrine function on those tissues increasing their glucose uptake.This mechanism led to propose the hypothesis that S-nitrosothiols (RSNOs) could mimic this mechanism. Therefore RSNOs effects on insulin sensitivity were tested. For low insulin sensitivity levels, i.e. fasted state, ablation of the HPN or insulin resistance state induced by a high sucrose diet RSNOs increased insulin sensitivity to levels normally observed in the postprandial state. These results indicated these drugs as potential pharmacological tools in the treatment of insulin resistance. NO and their derivates emerged as fundamental parts of insulin action. A characterization of nitric oxide and nitric oxide synthase (NOS), the enzyme responsible for NO synthesis was part of the work performed. We concluded that NO could be used as a biomarker for insulin resistance states. This work contributed for understanding the mechanism underlying postprandial glycemic control indicating the liver as a key organ in the regulation of peripheral (extra-hepatic) insulin action.

A investiga����o do Instituto de Estudos sobre o romanceiro velho e tradicional: projectos desenvolvidos e projectos em curso

N��o �� o momento de percorrer a hist��ria do Instituto de Estudos sobre o Romanceiro Velho e Tradicional, a qual, de resto, �� descrita pela m��o de Pedro Ferre, num estudo que brevemente ser�� estampado, O Instituto de Estudos sobre o Romanceiro Velho e Tradicional. Hist��ria de um passado e de um presente. Contudo, a vida deste centro representa, por um lado, uma investiga����o pouco comum nas Universidades portuguesas (o estudo e a sistematiza����o dos romances medievais conservados pela mem��ria tradicional portuguesa) e, por outro, um entendimento sobre a inser����o da actividade cient��fica na sociedade e na Universidade como espa��o interinstitucional de investiga����o e doc��ncia. Neste sentido, desde a sua funda����o, foi estabelecendo conv��nios com outras institui����es cient��ficas e governamentais, colaborou na doc��ncia de Cursos ministrados nesta e noutras Faculdades e apoiou a prepara����o de teses de Mestrado e Doutoramento em v��rias institui����es universit��rias. Como �� p��blico, a sua cria����o remonta h�� mais de uma d��cada, na Faculdade de Ci��ncias Sociais e Humanas da Universidade Nova de Lisboa, mas a sua g��nese antecede esse ano de 1989 e encontra-se na investiga����o que vinha sendo realizada pelo seu fundador, Pedro Ferre, desde os finais dos anos setenta. Referimos este facto anterior �� institucionaliza����o dos estudos sobre o Romanceiro, nesta Faculdade, porque sem ele, o estado actual da investiga����o deste centro n��o seria o que descreveremos.

Portugal em poema pela pena de Lord George Nugent Grenville. A��hist��ria da hist��ria colhida no campo de batalha

A efem��ride suscita a curiosidade de p��blicos muito diferenciados o que �� sempre estimulante. A��produ����o escrita d�� conta de um assinal��vel recrudescimento em volta do tema, como algumas das imagens agora recuperadas para a nossa comunica����o ilustram . Contudo, alguns anos antes, o CETAPS, Centre for English, Translation and Anglo���Portuguese Studies, �� ��poca, CEAP, Centro de Estudos Anglo���Portugueses, fora pioneiro na divulga����o de temas e obras relacionando o que a Hist��ria e a Literatura haviam dado a conhecer, no respeitante aos Estudos Anglo���Portugueses e �� tem��tica em ep��grafe. Saliente���se, em especial, o mestrado desenvolvido em torno das campanhas napole��nicas visando colmatar lacunas sobre o conhecimento relativo �� presen��a brit��nica no nosso pa��s e �� imagem que os relatos dos militares nelas envolvidas haviam dado conta. V��rios foram os documentos cient��ficos produzidos (nomeadamente teses e comunica����es), alguns dos quais foram depois editados. A��obra assinada por Gabriela G��ndara Terenas, O��Portugal da Guerra Peninsular ��� A��Vis��o dos Militares Brit��nicos (1808���1812), dada ao prelo em Junho de 2000, em muito veio suprir essa lacuna, pois a um s�� tempo se prop��s conciliar tem��ticas complementares, reunindo os aspectos que a literatura de viagem e os testemunhos de guerra oferecem.

Avalia����o das altera����es fisiol��gicas dos m��sculos da perna por IRM atrav��s de T2

Disserta����o para obten����o do Grau de Mestre em Engenharia Biom��dica

Transplante hep��tico sequencial com preserva����o da veia cava inferior (t��cnica de "Duplo Piggyback") : uma t��cnica original

RESUMO:Desde a declara����o de Bethesda em 1983, a transplanta����o hep��tica �� considerada um processo v��lido e aceite na pr��tica cl��nica para muitos doentes com doen��a hep��tica terminal, relativamente aos quais n��o houvesse outra alternativa terap��utica. Em 1991, por proposta de Holmgren, professor de gen��tica, o cirurgi��o sueco Bo Ericzon realizou em Huntingdon (Estocolmo) o primeiro transplante hep��tico num doente PAF (Polineuropatia Amilloid��tica Familiar), esperando que a substitui����o do fígado pudesse frenar a evolu����o da doen��a. Nesta doen��a heredit��ria autoss��mica dominante, o fígado, apesar de estrutural e funcionalmente normal, produz uma prote��na anormal (TTR Met30) respons��vel pela doen��a. A partir de ent��o, a transplanta����o hep��tica passou a ser a ��nica terap��utica eficaz para estes doentes. Portugal �� o pa��s do mundo com mais doentes PAF, tendo sido o m��dico neurologista portugu��s Corino de Andrade quem, em 1951, identificou e descreveu este tipo particular de polineuropatia heredit��ria, tamb��m conhecida por doen��a de Andrade. Com o in��cio da transplanta����o hep��tica programada em Setembro de 1992, o primeiro doente transplantado hep��tico em Portugal, no Hospital Curry Cabral, foi um doente PAF. Desde logo se percebeu que a competi����o nas listas de espera em Portugal, entre doentes hep��ticos cr��nicos e doentes PAF viria a ser um problema cl��nico e ��tico dif��cil de compatibilizar. Em 1995, Linhares Furtado, em Coimbra, realizou o primeiro transplante dum fígado dum doente PAF num doente com doen��a hep��tica metast��tica, ficando este tipo de transplante conhecido como transplante sequencial ou ���em domin�����. F��-lo no pressuposto de que o fígado PAF, funcional e estruturalmente normal, apesar de produzir a prote��na mutada causadora da doen��a neurol��gica, pudesse garantir ao receptor um per��odo razo��vel de vida livre de sintomas, tal como acontece na hist��ria natural desta doen��a cong��nita, cujas manifesta����es cl��nicas apenas se observam na idade adulta. A t��cnica cir��rgica mais adequada para transplantar o doente PAF �� a t��cnica de ���piggyback���, na qual a hepatectomia �� feita mantendo a veia cava do doente, podendo o transplante ser feito sem recorrer a bypass extracorporal. Antes de 2001, para fazerem o transplante sequencial, os diferentes centros alteraram a t��cnica de hepatectomia no doente PAF, ressecando a cava com o fígado conforme a t��cnica cl��ssica, recorrendo ao bypass extracorporal. No nosso centro imagin��mos e concebemos uma t��cnica original, com recurso a enxertos venosos, que permitisse ao doente PAF submeter-se �� mesma t��cnica de hepatectomia no transplante, quer ele viesse a ser ou n��o dador. Essa t��cnica, por n��s utilizada pela primeira vez a n��vel mundial em 2001, ficou conhecida por Transplante Sequencial em Duplo Piggyback. Este trabalho teve como objectivo procurar saber se a t��cnica por n��s imaginada, concebida e utilizada era reprodut��vel, se n��o prejudicava o doente PAF dador e se oferecia ao receptor hep��tico as mesmas garantias do fígado de cad��ver. A nossa s��rie de transplantes realizados em doentes PAF �� a maior a n��vel mundial, assim como o �� o n��mero de transplantes sequenciais de fígado. Recorrendo �� nossa base de dados desde Setembro de 1992 at�� Novembro de 2008 procedeu-se �� verifica����o das hip��teses anteriormente enunciadas. Com base na experi��ncia por n��s introduzida, a t��cnica foi reproduzida com ��xito em v��rios centros internacionais de refer��ncia, que por si provaram a sua reprodutibilidade. Este sucesso encontra-se publicado por diversos grupos de transplanta����o hep��tica a n��vel mundial. Observ��mos na nossa s��rie que a sobreviv��ncia dos doentes PAF que foram dadores �� ligeiramente superior ��queles que o n��o foram, embora sem atingir signific��ncia estat��stica. Contudo, quando se analisaram, apenas, estes doentes ap��s a introdu����o do transplante sequencial no nosso centro, observa-se que existe uma melhor sobrevida nos doentes PAF dadores (sobrevida aos 5 anos de 87% versus 71%, p=0,047).Relativamente aos receptores observ��mos que existe um benef��cio a curto prazo em termos de morbi-mortalidade (menor hemorragia peri-operat��ria) e a longo prazo alguns grupos de doentes apresentaram diferen��as de sobrevida, embora sem atingir signific��ncia estat��stica, facto este que pode estar relacionado com a dimens��o das amostras parcelares analisadas. Estes grupos s��o os doentes com cirrose a v��rus da hepatite C e os doentes com doen��a hep��tica maligna primitiva dentro dos crit��rios de Mil��o. Fora do ��mbito deste trabalho ficou um aspecto relevante que �� a recidiva da doen��a PAF nos receptores de fígado sequencial e o seu impacto no longo prazo. Em conclus��o, o presente trabalho permite afirmar que a t��cnica por n��s introduzida pela primeira vez a n��vel mundial �� exequ��vel e reprodut��vel e �� segura para os doentes dadores de fígado PAF, que n��o v��em a sua t��cnica cir��rgica alterada pelo facto de o serem. Os receptores n��o s��o, por sua vez, prejudicados por receberem um fígado PAF, havendo mesmo benef��cios no p��s-operat��rio imediato e, eventualmente, alguns grupos espec��ficos de doentes podem mesmo ser beneficiados.---------ABSTRACT: Ever since Bethesda statement in 1983, Liver Transplantation has been accepted as a clinical therapeutic procedure for many patients with advanced hepatic failure Holmgren, professor of genetics, suggested that one could expect that transplanting a new liver could lead to improve progressive neurological symptoms of Familial Amyloidotic Polyneuropathy (PAF). Bo Ericzon, the transplant surgeon at Huddinge Hospital in Stockholm, Sweden, did in 1991 the first Liver Transplant on a FAP patient. FAP is an inherited autosomal dominant neurologic disease in which the liver, otherwise structural an functionally normal, produces more than 90% of an abnormal protein (TTR Met30) whose deposits are responsible for symptoms. Liver Transplantation is currently the only efficient therapy available for FAP patients. Portugal is the country in the world where FAP is most prevalent. The Portuguese neurologist Corino de Andrade was the first to recognize in 1951 this particular form of inherited polyneuropathy, which is also known by the name of Andrade disease. Liver Transplantation started as a program in Portugal in September 1992. The first patient transplanted in Lisbon, Hospital Curry Cabral, was a FAP patient. From the beginning we did realize that competition among waiting lists of FAP and Hepatic patients would come to be a complex problem we had to deal with, on clinical and ethical grounds. There was one possible way-out. FAP livers could be of some utility themselves as liver grafts. Anatomically and functionally normal, except for the inherited abnormal trace, those livers could possibly be transplanted in selected hepatic patients. Nevertheless the FAP liver carried with it the ability to produce the mutant TTR protein. One could expect, considering the natural history of the disease that several decades would lapse before the recipient could suffer symptomatic neurologic disease, if at all. In Coimbra, Portugal, Linhares Furtado performed in 1995 the first transplant of a FAP liver to a patient with metastatic malignant disease, as a sequential or ���domino��� transplant. FAP Liver Transplant patients, because of some dysautonomic labiality and unexpected reactions when they are subjected to surgery, take special advantage when piggyback technique is used for hepatectomy. This technique leaves the vena cava of the patient undisturbed, so that return of blood to the heart is affected minimally, so that veno-venous extracorporeal bypass will not be necessary. The advantages of piggyback technique could not be afforded to FAP patients who became donors for sequential liver transplantation, before we did introduce our liver reconstruction technique in 2001. The hepatectomy took the vena cava together with the liver, which is the classical technique, and the use of extracorporeal veno-venous bypass was of necessity in most cases. The reconstruction technique we developed in our center and used for the first time in the world in 2001 consists in applying venous grafts to the supra-hepatic ostia of piggyback resected FAP livers so that the organ could be grafted to a hepatic patient whose liver was itself resected with preservation of the vena cava. This is the double piggyback sequential transplant of the liver. It is the objective of this thesis to evaluate the results of this technique that we did introduce, first of all that it is reliable and reproducible, secondly that the FAP donor is not subjected to any additional harm during the procedure, and finally that the recipient has the same prospects of a successful transplant as if the liver was collected from a cadaver donor. Our series of liver transplantation on FAP patients and sequential liver transplants represent both the largest experience in the world. To achieve the analysis of the questions mentioned above, we did refer to our data-base from September 1992 to November 2008. The reconstructive technique that we did introduce is feasible: it could be done with success in every case ion our series. It is also reproducible. It has been adopted by many international centers of reference that did mention it in their own publications. We do refer to our data-base in what concerns the safety for the FAP donor.Five years survival of FAP transplanted patients that have been donors (n=190) has been slightly superior to those who were not (n=77), with no statistical significance. However, if we consider five year survival of FAP transplanted patients after the beginning of sequential transplant program in our center, survival is better among those patients whose liver was used as a transplant (87% survival versus 71%, p=0.047). In what concerns recipients of FAP livers: Some short-term benefit of less perioperative morbi-mortality mainly less hemorrhage. In some groups of particular pathologies, there is a strong suggestion of better survival, however the scarcity of numbers make the differences not statistically significant. Patients with cirrhosis HVC (83% versus73%) and patients with primitive hepatic cancer within Milan criteria (survival of 70% versus 58%) are good examples. There is one relevant problem we left beyond discussion in the present work: this is the long-term impact of possible recurrence of FAP symptoms among recipients of sequential transplants. In Conclusion: The reconstruction technique that we did develop and introduce is consistently workable and reproducible. It is safe for FAP donors with the advantage that removal of vena cava can be avoided. Hepatic patients transplanted with those livers suffer no disadvantages and have the benefit of less hemorrhage. There is also a suggestion that survival could be better in cirrhosis HVC and primary liver cancer patients.

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