Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Mark Rothko : Da origem mítica à refundação artística do mundo

Fenómeno assinalável no nosso século foi a emergência da chamada “arte global” (Belting), dando conta da crise do “mundo da arte” e a disseminação generalizada das práticas artísticas. Neste contexto a obra de Rothko ganha uma força inesperada. Sendo usualmente inscrito no “modernismo” com os seu valores de pureza e especificidade do meio, neste caso a pintura, a nossa investigação revela que o gesto Rothkoniano excede largamente esta representação, que levaria a distinguir radicalmente entre uma fase mítica e surrealista, uma fase abstracionista dos “colour field” e finalmente uma fase sublime das pinturas da Capela Ecuménica de Rothko. Existe uma continuidade evidente que remete para uma geoestética, onde a terra e a sua habitabilidade desempenham um papel crucial. Daí a necessidade de inscrever a obra de Rothko na geofilosofia contemporânea, tal com foi delineada por Gilles Deleuze e Félix Guattari. Procedeu-se, assim, a uma análise crítica da obra e da estética de Rothko, que profeticamente, mas inconscientemente, parece abrir o caminho para o pensamento de uma arte da terra. Trata-se de uma linha de continuidade que atravessa toda a obra de Rothko, refletindo uma picturação do mundo e a vontade de criar de um mundo pictórico e poético, reduzido a elementos mínimos, pós-figurativos mas onde se reconhece a incidência dos motivos como frame e abertura, linha de horizonte e pórticos e passagens. Num segundo momento, explora-se essa dimensão “inconsciente” num projeto artístico pessoal, que se desdobra em abordagens picturais, de pintura, de instalação e de vídeo, que denominamos por “A Terra como Acontecimento”. Este projeto prolonga o esforço Rothkoniano, ao mesmo tempo que o altera profundamente, nomeadamente pelo uso dos materiais, pela mutação no uso da cor, bem como pela maneira como os elementos figurativos são radicalmente alterados pela mera transposição da perspetiva usada. Se a ressonância rothkoniana está bem presente, não menos presente está a intenção de um confronto dialogante com a Obra de Mark Rothko. Aquilo que neste importante artista, era o inconsciente, marcado pelo mito e teologia, pela delimitação da linha de horizonte, bem clássica, e, acima de tudo, pela sua verticalidade marcadamente teológica, “A Terra como Acontecimento” é a matéria que é profundamente radicalizada, bem como a lógica concetual, a qual é preferentemente circular, sem orientação absoluta, e incompleta, o que implica uma outra visão da “abertura”/”fecho”, tão essencial na obra de Rothko. Desta investigação espera-se um contributo significativo para os debates atuais sobre a arte na contemporaneidade.

Therapeutics bioconjugates: evaluation of iminoboronates as payload delivery system for cancer

The advent of bioconjugation impacted deeply the world of sciences and technology. New biomolecules were found, biological processes were understood, and novel methodologies were formed due to the fast expansion of this area. The possibility of creating new effective therapies for diseases like cancer is one of big applications of this now big area of study. Off target toxicity was always the problem of potent small molecules with high activity towards specific tumour targets. However, chemotherapy is now selective due to powerful linkers that connect targeting molecules with affinity to interesting biological receptors and cytotoxic drugs. This linkers must have very specific properties, such as high stability in plasma, no toxicity, no interference with ligand affinity nor drug potency, and at the same time, be able to lyse once inside the target molecule to release the therapeutic warhead. Bipolar environments between tumour intracellular and extracellular medias are usually exploited by this linkers in order to complete this goal. The work done in this thesis explores a new model for that same task, specific cancer drug delivery. Iminoboronates were studied due to its remarkable selective stability towards a wide pH range and endogenous molecules. A fluorescence probe was design to validate this model by creating an Off/On system and determine the payload release location in situ. A process was optimized to synthetize the probe 8-(1-aminoethyl)-7-hydroxy-coumarin (1) through a reductive amination reaction in a microwave reactor with 61 % yield. A method to conjugate this probe to ABBA was also optimized, obtaining the iminoboronate in good yields in mild conditions. The iminoboronate model was studied regarding its stability in several simulated biological environments and each half-life time was determined, showing the conjugate is stable most of the cases except in tumour intracellular systems. The construction of folate-ABBA-coumarin bioconjugate have been made to complete this evaluation. The ability to be uptaken by a cancer cell through endocytosis process and the conjugation delivery of coumarin fluorescence payload are two features to hope for in this construct.

Sistema de segurança interna : a unificação do sistema em Portugal

A aceleração do ritmo de mudança verificado nas sociedades atuais, tem sido impulsionado pela globalização, fenómeno decorrente da evolução das tecnologias da informação, das telecomunicações, das comunicações e transportes e do desaparecimento de fronteiras. Viver na “aldeia global” ou à escala global como o previu Marshall McLuhan (1964) no livro Understanding Media, é hoje uma realidade inquestionável. As consequências desta transformação foram múltiplas quer do ponto de vista dos benefícios, quer do ponto de vista dos problemas gerados. No plano da segurança, face ao multiculturalismo envolvido e ao aumento crescente do crime transfronteiriço, tornou-se essencial a partilha de informação a nível internacional tendo em vista o seu combate não só olhando a situação dos cidadãos como a defesa dos princípios democráticos. Realça-se que os progressos tecnológicos e as facilidades que criam aos seus utilizadores, neste caso os criminosos, fazem com que as ações por estes praticadas sejam cada vez mais meticulosas, imprevisíveis, sofisticadas e complexas o que impõe uma resposta correspondente e adequada. Por essa razão, as políticas de segurança existentes mostraram-se insuficientes e esgotadas requerendo novas respostas capazes de produzir os efeitos desejáveis para uma efetiva prevenção da criminalidade. Pelas dimensões que tem vindo a tomar, a criminalidade tornou-se uma preocupação que ultrapassou o domínio da segurança interna de cada país para ser encarada a nível internacional ou mesmo mundial. Para o efeito urge concertar processos e procedimentos securitários agregando vontades que convirjam e defendam a unificação dos sistemas dos países a nível mundial. A verificar-se tal intento, daí resultariam significativas melhorias da segurança a todos os níveis (nacional, internacional e mundial). Além disso também resultariam ganhos em termos de tempo, redução de custos, impacto na qualidade dos serviços prestados, na gestão das pessoas e na eficiência das organizações. Realça-se que a democracia ao promover a dignidade do homem densificando os seus direitos, liberdades e garantias, criou indiretamente condições para que fosse gerada instabilidade e o desenvolvimento de comportamentos criminosos. Importa, portanto, face à situação existente e à previsível complexidade do crime no futuro, estudar profundamente a nova realidade neste domínio, para tomar as medidas preventivas tendentes a reporem a estabilidade e a promoverem a paz social. Foi neste contexto que a presente investigação, desenvolvida no âmbito académico, mas também suportado na realidade profissional, pretendeu refletir sobre o estado da segurança global e dar o seu contributo nesta matéria.

O estatuto disciplinar da literatura angolana : contributo para uma epistemologia dos estudos literários africanos

A presente investigação procura inscrever-se no domínio da epistemologia dos estudos literários, fazendo apelo a uma abordagem interdisciplinar que aponta para a necessidade de um comparatismo literário africano e, ao mesmo tempo, mundial. O conceito-chave com que operamos neste trabalho é o de disciplinarização, tendo em conta o seu potencial explicativo para entender o processo que nos irá conduzir à integração dos Estudos Literários Africanos no sistema disciplinar actual. Por disciplinarização entendemos o processo de definição que consiste na demarcação de uma determinada disciplina, por força de dinâmicas endógenas e exógenas, durante o qual se transita de uma fase pré-disciplinar para outra disciplinar, admitindo-se a existência de uma compatibilidade entre os fundamentos epistemológicos e metodológicos da produção e transmissão de conhecimentos e, por outro lado, a consagração da institucionalidade da disciplina como objecto de estudo. A profissionalização disciplinar será uma consequência desse processo e da formação de comunidades de agentes epistémicos que, conhecendo profundamente a história e os universos de referência da disciplina, sejam capazes de aplicar as metodologias mais adequadas no domínio da investigação e do ensino. Para compreender os fundamentos epistemológicos dos Estudos Literários Africanos, importa refletir sobre o momento a partir do qual se constituem como campo disciplinar na história da produção do conhecimento sobre o continente africano. Por outro lado, com o presente trabalho pretende-se avaliar o estatuto disciplinar da Literatura Angolana, num exercício que procura justificar as determinações da epistemologia disciplinar, operacionalizando os sentidos em que se pode analisar o conceito de disciplina. Deste modo, a atribuição do referido estatuto pressupõe o domínio de um instrumental teórico que implica a descrição dos tipos de conhecimento veiculados através dos processos de transmissão que caracterizam as disciplinas escolares e as disciplinas académicas.

The role of information systems in business process redesign : a case of Turkish electricity market

This study is specifically concerned with the effect of the Enterprise Resource Planning (ERP) on the Business Process Redesign (BPR). Researcher’s experience and the investigation on previous researches imply that BPR and ERP are deeply related to each other and a study to found the mentioned relation further is necessary. In order to elaborate the hypothesis, a case study, in particular Turkish electricity distribution market and the phase of privatization are investigated. Eight companies that have taken part in privatization process and executed BPR serve as cases in this study. During the research, the cases are evaluated through critical success factors on both BPR and ERP. It was seen that combining the ERP Solution features with business processes lead the companies to be successful in ERP and BPR implementation. When the companies’ success and efficiency were compared before and after the ERP implementation, a considerable change was observed in organizational structure. It was spotted that the team composition is important in the success of ERP projects. Additionally, when the ERP is in driver or enabler role, the companies can be considered successful. On the contrary, when the ERP has a neutral role of business processes, the project fails. In conclusion, it can be said that the companies, which have implemented the ERP successfully, have accomplished the goals of the BPR.