Vc二步发酵新菌系B529-V6的构建及其分子生物学特性

从芽抱杆菌属、酵母属二十株菌中筛选到一株优良伴生菌B529，与新选育出的产酸菌V6构成一新菌系B529-V6。新菌系B529-V6表现出了较强的高浓度L-山梨糖耐受能力、较高的底物代谢速率和较高的2-KGA转化能力，在8％山梨糖浓度的发酵培养基中培养48h，糖酸转化率较对照菌系提高了5.94％；山梨糖浓度提高至10％，其生长代谢受影响程度较小，且能不同程度地利用葡萄糖和山梨醇为底物，合成维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸（2-KGA），其发酵产物2-KGA经反相高效液相色谱分析其质量符合工业化生产要求。对新菌系生长代谢规律及调控进行了研究，4M3罐和300M3罐发酵实验表明：种子培养基的碳源、葡萄糖／山梨糖浓度比、氮源、生长因子、接种种液质量及环境因子，均可影响新菌系的生长代谢。4M3罐发酵，新菌系具有周期短、糖酸转化率高等特点，连续4批发酵平均转化率较对照菌系提高10.18％，周期缩短23.7％。在300M3罐发酵试运行期间，新菌系糖酸转化率达到90.10％，较原生产菌系提高3.95％，发酵周期平均缩短1.3小时，显示出了较高的应用价值，在东北制药总厂进行了推广应用。研究了新产酸菌V6的基本生物学特性，分析了GC moL％含量，165rDNA同源性，鉴定其在系统发育学上应归入Ketoguloigenium 属，暂命名为Ketogulonigenium sp．V6。选用限制性内切酶Hind IH对新产酸菌V6染色体DNA进行了部分消化，应用载体pGEM-3zf（+）构建了v6的基因文库。结合阳性转化子在以L－山梨糖为唯一碳源培养基上的生长特性，利用PCR技术从该基因文库中，筛选到一株含有L-山梨糖还原酶（sR）基因的阳性克隆，并利用pET-32a（+）表达载体，实现了sR酶基因在大肠杆菌AD494（DE3）中的表达。SDS-PAGE电泳分析测定SR融合蛋白分子量大约在65kD左右，除去硫氧化还原蛋白、S-Tag和His-Tag蛋白，可推测出天然sR酶蛋白分子量约53 kD左右，与从SR基因推测出的分子量大小相符。另外，SR酶学特性研究表明，还原型辅酶II（NADPH）是sR酶蛋白的最适电子供体，其最适反应pH为7.0，pH6.5时保持稳定，酶活力较高；最适反应温度为50 ℃，30 ℃时热稳定性较好；lmM的Cu~(2+)，Fe~(3+)和Mn~(2+)对该酶活抑制作用较大。

Vc生产用菌中2-酮基-L-古龙酸还原酶的研究

从Vc“二步发酵法”生产用菌[系一株氧化葡萄糖杆菌（小菌）和一株巨大芽孢杆菌（大菌）的混合菌株]的无细胞抽提液中分离纯化了 2-酮基-L-古龙酸还原酶（KGR），测得其分子量为90,000道尔顿；对其动力学性质的研究表明它是一个典型的米-孟氏酶，它对2-KLG作用的K_m为3.42*10~(-3)Mol，最适作用pH和最适作用温度分别为6.5和30℃；其温度敏感程度中等，受40℃温度作用时开始失活，45℃温度作用则立即失活。该酶为混合菌株中小菌的酶。研究了发酵过程中KGR活性和比活的变化情况，发现在发酵开始进行时其活性和比活呈增长趋势，进行一段时间（12小时）之后则保持恒定不变，其变化趋势和发酵液中小菌的浓度变化呈同步关系；它的生物合成不受2-KLG和L-山梨糖的诱导，系小菌的组成酶。

KGR的理化和酶学性质及提高Vc二步发酵转化率的研究

本文对Vc二步发酵Gluconobacter oxydans胞内2—酮基—L—古龙酸还原酶的分离纯化过程的第3步进行了改进，提高了酶的提取收率和提纯倍数。分析表明KGR由两个分子量分别为32,000道尔顿和53,000道尔顿的亚基组成，等电点为3.6，酸性氨基酸占22%。本文还对稀土元素化合物对KGR酶活的抑制作用进行了研究。发现稀土元素化合物和路易士酸组成的添加剂能缩短Vc二步发酵的时间6hr，发酵转化率可提高10%以上。

Vc“二步发酵法”最佳组合生产菌系的选育及其“工程菌”的构建

对24株不同组合的Vc“二步发酵法”生产菌系中筛选出了最佳组合生产菌系H_(19)S_(19)。对该菌系的形态学及生理生化特性的研究表明，H_(19)为地衣芽孢杆菌，S_(19)的分类地位目前还难以确定，但与尹光琳等报道的氧化葡萄糖酸杆菌相比，具有许多新的不同特点。用单亲本灭活的原生质体融合技术进行了H_(19)和S_(19)以及132及S_(19)的原生质体融合，共获得400株重组子，其中有2株产生2--酮基--L--古龙酸产量高且稳定性好的重组子。其中一株是由H_(19)和S_(19)原生质体以H_(19)为背景融合产生的，另一侏是132和S_(19)原生质体以S_(19)为背景产生的。

Vc二步发酵伴生菌巨大芽孢杆菌的选育

巨大芽孢杆菌经紫外线诱变，获得2株耐低pH、抗KGA的菌株：Bn，B5。在pH6.7～7．0的发酵培养基中与氧化葡萄糖酸杆菌发酵，Bn和B5的平均糖酸转化率分别提高3.5％，3．3％.在pH6．2的发酵培养基中，平均糖酸转化率提高11．4％，12．3％。在pH6．2和pH7．0含3％KGA的培养基中，2菌提前3～6h到达对数生长期，稳定期延长3～6h.经连续30代转接，特性稳定。

Vc二步发酵离体实验系统的建立

以氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合培养物的无细胞抽提液为基本反应液 ,在试管中建立了Vc二步发酵离体实验系统 .将底物山梨糖加入反应体系后在pH 7.0 ,35℃下保温 2 4h,2 酮基 L 古龙酸生成 .加入巨大芽孢杆菌胞外活性物质对离体系统的产酸没有影响 ,一定量的L 山梨糖脱氢酶可促进产酸 .试验了pH、θ/℃、金属离子、电子受体、去污剂等对该系统产酸的影响 ,并就其作用机理进行了探讨 ,结果表明离体系统产酸的最适pH和θ/℃分别是 8和 40℃ ,Fe3+促进产酸 ,Co2 +抑制产酸 ,2 ,6 二氯酚定酚作为电子受体促进细胞膜组分产酸 ,但对细胞质组分没有影响 ,TritonX 10 0和Tween 80抑制产酸 .图 8参 7

Vc二步发酵新菌系生长代谢的调节

研究了培养基和培养条件对新菌系大、小菌生长地代谢的影响 .结果表明 :培养基的碳源、葡萄糖 /山梨糖浓度比、氮源、生长因子以及起始 pH值、通气量等 ,可以有效地调节 2 酮基 L 古龙酸的代谢产生数量 ,规范新菌系B5 2 9-Go .V .6的行为、生理状态 ,促进大小菌之间的协调 ,使其达到最佳状态 .图 2表 6参 5

Vc二步发酵新菌种单因素发酵条件的研究

用测定发酵液糖酸转化率的方法,对Vc二步发酵新菌种的最适单因素发酵条件进行了研究。结果表明,装液量为20ml/250ml,培养温度为29℃,种龄为18～20h,接种量为15%,底糖浓度为8%是最适发酵条件。

Vc二步发酵新组合菌系B_(15-14)的筛选及其条件优化

筛选出了一组Vc二步发酵的新组合菌系(命名为B15-14),研究了环境因子对新菌系产酸的影响。结果显示:新组合菌系的最适底糖浓度为7%;温度为29~33℃,31℃为最适;适当增加通气量(20~30 mL装液量,250 mL三角瓶)有利于产酸;起始pH值范围为6.0~7.5;以B t菌做伴生菌时,发酵40 h就已达到终点,明显缩短了发酵时间。

VC二步发酵新组合菌系的研究

选用苏云金芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成一新组合菌系 ,其摇瓶发酵转化率较原菌系提高 4 .83% ,且具有耐受高浓度 (10 % )山梨糖的特性。在 4m3 发酵罐中 ,连续 4批发酵平均转化率较对照菌系提高 8.16 % ,周期缩短 2 3.7%。新菌组合系的发酵转化率与玉米浆浓度成正相关性 ,尿素浓度x2 =1.4 5 % (g/ 10 0mL)时 ,转化率达最大。

Vc二步发酵一株新产酸菌的分子生物学特性

对最近分离到的一株能合成维生素C前体 - 2 -酮基 -L -古龙酸 (2 -KGA)的新产酸菌V6生物学和分子生物学特性进行了初步研究。该菌株为革兰氏阴性菌 ,细胞为短杆状 ,菌体大小为 0 .8- 1.0× 0 .4 - 0 .6 μm ,菌落为淡黄色 ,好氧 ,最适生长温度为 2 8～ 30℃ ,最适pH为 7.0～ 7.8,GCmol%含量为 5 3.1% ,不含质粒 ,能氧化葡萄糖、山梨醇和山梨糖合成 2 -KGA。 16SrDNA同源性分析发现 ,该产酸菌与以前报道的能合成 2 -KGA的三个属Ketogulonigenium属、Gluconobacter属和Acetobacter属的同源性分别是 98.9～ 99.3%、82～ 83%和 81～ 82 %。基于以上特性分析 ,该产酸菌在分类发育学上宜归为Ketogulonigenium属。

Vc二步发酵中Na~+、Ca~(++)及pH对巨大芽孢杆菌生长作用的影响

200mmol/LNa＋可导致对数生长期末期巨大芽孢杆菌的自溶，而这种自溶作用能被Ca＋＋抑制；在对数生长期后期，200mmol/LNa＋＋可使菌体提前到达稳定期；在衰亡期，200mmol/LNa＋能抑制菌体的衰亡。pH6.0可导致对数生长期末期菌体的自溶，pH6.0或pH6.4能明显的抑制衰亡期菌体的衰亡。

Vc二步发酵中伴生菌的作用机制

应用细胞培养和膜分离技术研究了Vc两步发酵中伴生菌巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)对氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)产酸作用机制。结果表明 :巨大芽孢杆菌培养液中分子量在 30～ 5 0kD及大于 1 0 0kD组分明显促进产酸 :其组分通过凝胶层析分离纯化 ,自动紫外检测仪检测 ( 2 80nm) ,聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮兰G2 5 0特异染色 ,初步证实为蛋白质 ,且至少是两种以上蛋白质 ,它们在低温下稳定性较好

Vc二步发酵中的微生物生态调控

研究了Vc二步混合菌发酵中氧化葡萄糖酸杆菌与巨大芽孢杆菌的生长和相互作用 .结果表明 ,2株混合菌在发酵中可形成一种协同共生 ,促进 2 酮基 L 古龙酸产生 ;二菌协同共生的过程及条件不同 ,促进产酸能力亦不同 .环境因子影响二菌协同共生 .优化环境因子可显著改善二菌协同共生效率 ,并提高醇酸发酵转化率 .