Identification and assessing the cultivars of Laminaria Lamx. (phaeophyceae) with molecular markers

Molecular markers were used to identify and assess cultivars of Laminaria Lamx. and to delineate their phylogenetic relationships. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was used for detection. After screening, 11 primers were selected and they yielded 133 bands in all, of which approximately 99.2% were polymorphic. The genetic distances between gametophytes ranged from 0.412 to 0.956. Two clusters were formed with the unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) dendrogram based on the simple matching coefficient. All cultivars of Laminaria japonica Aresch. used for breeding in China fell into one cluster. L. japonica from Japan, L. saccharina (L.) Lam., and L. angustata Kjellm. formed the other cluster and showed higher genetic variation than L. japonica from China. Nuclear ribosomal DNA (rDNA) sequences, including internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) were studied and aligned. The nucleotides of the sequences ranged from 634 to 668, with a total of 692 positions including TTS1, ITS2, and the 5.8S coding region. The phylogenetic tree obtained by the neighbor-joining method favored, to some extent, the results revealed by RAPD analysis. The present study indicates that RAPD and ITS analyses could be used to identify and assess Laminaria germplasm and to distinguish some species and, even intraspecies, in Laminaria.

栉孔扇贝C型凝集素-2(CfLec-2)基因的克隆和分析

栉孔扇贝是我国北方一种重要的贝类养殖品种。自1997年以来爆发的栉孔扇贝大规模死亡，给地区经济造成了重大损失并且已经严重威胁着扇贝养殖业的健康发展。然而，到目前为止，对扇贝免疫防御分子机理的了解还很少，深入研究扇贝免疫应答的分子机制是认识和了解病害发生和实现病害控制的重要途径。本研究采用了EST大规模测序和3’RACE的方法，从栉孔扇贝cDNA文库中克隆到一个凝集素基因CfLec-2，并对功能进行了研究。 CfLec-2 cDNA全长708bp，5’非翻译区(Untranslated Region, UTR)含有59bp，3’非翻译区含有163bp，具有典型的多聚腺苷酸加尾信号序列AATAAA和多聚腺苷酸尾巴，开放阅读框(Open Reading Frame, ORF )含有486bp，编码162个氨基酸残基，该多肽的理论分子量为16.8 kDa，等电点为4.54。利用SignalP分析，发现其信号肽的剪切位置在VEA-QSL之间。经BLASTP比对分析可知，CfLec-2基因编码的蛋白与人的Brevican，Anguilla japonica的C-type lectin-1和C-type lectin-2， Rattus norvegicus的CD23有较高的相似性，其中与Brevican的一致性有37%。Clustal W多序列比对发现该多肽具有标准长型C型凝集素所必须的6个保守半胱氨酸和相对保守的糖识别位点。用SMART(Small Modular Architecture Research Tool)软件分析发现其具有一个保守的糖识别结构域(Carbohydrate-recognition Domain, CRD)，氨基酸序列上第49、125、141、149位置上的半胱氨酸参与形成糖识别结构域，而位于N末端的第21和32位上的两个半胱胺酸形成额外的一个二硫键，位于115、116和117上的Glu、Pro、Asp则构成了糖识别位点。 将编码CfLec-2成熟肽段的cDNA序列克隆进pET32a(+)载体中，并在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中重组表达CfLec-2。重组蛋白利用其具有的His tag纯化并复性后发现CfLec-2可以凝集溶血葡萄球菌，且凝集过程不需要钙离子的参与。并且，CfLec-2对大肠杆菌TOP10F’有微弱的抑菌活性，对溶壁微球菌、溶血葡萄球菌和鳗弧菌则没有抑菌活性。这一结果说明，CfLec-2可能不仅参与对入侵微生物的识别过程，而且可能作为效应分子起到了直接杀灭入侵微生物的作用。 本研究发现CfLec-2具有和以前在栉孔扇贝报道的CFLec-1完全不同的功 能，说明栉孔扇贝利用不同的凝集素来识别不同的病原，同时也暗示栉孔扇贝中可能有更多不同功能的凝集素有待发现。研究结果丰富和发展了海水无脊椎动物免疫学的内容，对进一步了解扇贝固有免疫的机制，实现养殖扇贝疾病防治具有重要参考价值。

贝藻混养系统中贝类食物来源的定量分析

应用稳定碳、氮同位素比值法和脂肪酸标志分析法，较为系统地研究了贝藻混养系统中滤食性贝类的食物来源，评估了大型藻类对混养系统及滤食性贝类的物质贡献。主要研究结果如下： 1.综述了典型生态系统中大型藻类和滤食性贝类各自的生态学地位和作用，大型藻类与滤食性贝类不仅在水体营养盐方面存在互利关系，二者在物质循环与收支方面同样具有耦合性，大型藻类提供的颗粒态有机质可以为滤食性贝类提供饵料来源。 2.总结了稳定同位素比值法和脂肪酸标志法在海洋生态系统食物来源及食物网分析中的应用，并建立了两种方法的具体操作规程。 3.分析了栉孔扇贝Chlamys farreri和海带Laminaria japonica混养系统中海带碎屑形成及释放不同阶段的生态学特征，评估了碎屑对扇贝的饵料贡献。海带在6周内释放了自身约27％的碳；碎屑形成及释放过程中C:N比值显著下降，同时伴随着旺盛的细菌降解，碎屑中也发现有大量硅藻类和原生动物存在。稳定同位素分析证实海带碎屑是混养期间扇贝的主要食物来源。 4.查明了春季胶州湾潮间带自然分布的长牡蛎Crassostrea gigas、紫贻贝Mytilus galloprovincialis和湾内浅海筏式养殖栉孔扇贝的可能食物来源。湾内栉孔扇贝饵料组成中浮游硅藻类为最主要部分，同时混杂有陆源有机质和细菌类物质；潮间带自然生长的牡蛎和贻贝饵料组成中，浮游植物占86.2-89.0％，种类组成中除硅藻外还包括一定比例的金藻和甲藻类；潮间带繁盛的孔石莼Ulva pertusa藻床为两种贝类提供了8.7-11.0％的补充食物来源。 5.揭示了桑沟湾贝藻混养海区春、夏季栉孔扇贝饵料来源组成情况及其季节变化，评估了海带养殖区碎屑碳量季节变化及海带来源碳对扇贝组织碳的贡献。结果表明，湾内贝藻混养区碎屑碳量为75.52-265.19 μg l-1，其在水体总颗粒态有机碳中的比例为25.6-73.8％。海带来源碎屑碳对栉孔扇贝组织碳的贡献比例为14.1-42.8％，且与水体碎屑碳比例的季节变化存在极显著相关性(F=0.992, P=0.004)。5月份湾外海带养殖区水体碎屑碳量为110.12-144.71 μg l-1，显著高于湾内无海带区（75.52 μg l-1），湾外养殖的扇贝组织中海带来源碳比例为22.0-24.1％，显著高于湾内单养区扇贝（9.6％）。估算结果表明，桑沟湾每年收获的6967吨（总湿重）栉孔扇贝中，海带提供了约57.1吨碳，换算为海带干物质为219.6吨。脂肪酸标志分析结果表明，2月份至8月份硅藻类在扇贝饵料组成中比例逐渐下降，而细菌类比例逐渐升高。整个采样期间，EPA/DHA比例较低，说明扇贝饵料组成中可能包括高DHA含量的组分。

褐藻多酚羟基测定及抗氧化性质研究

羟基是褐藻多酚结构特征，以往只以间苯三酚为标准物对褐 藻多酚中总羟基用FD法进行测量，核磁共振研究表明褐藻多酚中除间三羟基外还含有连三羟基（Ragan, et al, 1986），连三羟基的测量与它所占总羟基工比例是探讨褐藻多酚构效关系的基础，此类研究未有报道；关于褐藻多酚的抗氧化性，只有增重法和过氧化值法对其进行研究的报道，而关于抗氧化机理未有报道。采用FAS法、FD法对鼠尾藻（Sargassum. thunbergii)、海黍子(Sargassum. kjellmanianum)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、海带(Laminaria japonica)中褐藻多酚连三羟基与总羟基含蓄量的比例进行了研究，结果依次为24.4%、25.6%、1.7%和2.6%;采用DPPH体系、羟基自由基体系、烷基自由基引发的亚油酸氧化体系、超氧阴离子自由基体系对海黍子高分子量褐藻多酚抗击氧化性质进行了研究，发现其清除DPPH活性、清除羟基自由基活性、抑制烷基自由基引发的亚油酸氧化的活性分别为77%、27%和21%，但它不具有清除超氧阴离子自由基的能力。褐藻多酚具有供氢能力且其连三羟基的供氢能力大于间三羟基，清除羟基自由基与其苯环提供的羟基自由基加成位点的数量有关。对褐藻多酚抑制A_3钢腐蚀进行了电化学研究，发现褐藻多酚可使海水中A_3钢腐蚀电位转正并与工作电极附近的溶解氧反应减缓腐蚀。本研究表明褐藻多酚的抗击氧化性与其羟基结构的苯环提供的羟基自由基加成位点的数量有直接关系。

海带根中α-glucosidase 和PTP-1B 靶向生物活性物质的分离纯化及其抗糖尿病作用研究

海带根是一种治疗糖尿病的民间中药，在沿海地区有很长的民间用药历史。食用海带根能够有效降低糖尿病患者的血糖，起到治疗作用。本文目的在于发现海带根中抗糖尿病的天然活性物质并分析它们在糖尿病治疗中的靶点；进一步开发一种低价且无毒副作用的化学类新药或中药新药。 α-glucosidase和 PTP-1B是II型糖尿病的两个重要靶点，海带根提取物能同时作用于这两个靶点。通过抑制这两种酶，降低血糖水平，85%乙醇粗提物对两种酶的IC50分别为1589ug/ml、IC50 1271ug/ml。乙酸乙酯相和石油醚相分别抑制α-glucosidase和 PTP-1B，IC50分别为380ug/ml和220ug/ml。因此以α-glucosidase和 PTP-1B的抑制活性为导向，用天然产物化学的方法对活性成分进行追踪分离，寻找单体活性物质进而鉴定其结构。由于乙酸乙酯相具有α-glucosidase抑制活性，用硅胶柱层析（石油醚：丙酮5：1、1：1），（二氯甲烷：甲醇60：1、20：1、5：1），凝胶柱层析Sephadex LH20（二氯甲烷：甲醇1：1），HPLC （80% 甲醇-水），对α-glucosidase抑制剂进行分离，得到组分IC50 为3.6ug/ml。用质谱仪和核磁共振确定结构。 生物活性测定结果表明α-glucosidase和 PTP-1B是两种不同的物质，分别位于乙酸乙酯相和石油醚相。光照实验和高温实验表明抑制α-glucosidase的活性成分对光照和温度敏感。光照48h或者50℃ 12h而且对α-glucosidase的抑制活性显著降低，TLC检测并用FeCl3显色初步表明抑制α-glucosidase的活性成分可能是多数酚类物质。动物实验显示在1450ug/kg剂量下，乙酸乙酯相能够显著降低糖尿病小鼠血糖，与阴性对照组差异极显著（P<0.01）。表明，海带根提取物在体内和体外均呈现出抗糖尿病活性，是一种潜在的抗糖尿病药物。

转基因海带配子体的制备与高效增殖

海带具有很高的营养价值和经济社会价值。自20世纪90年代以来，本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上，根据海带自身特点，建立了海带遗传转化体系（海带孢子体表达系统），它的基本原理是利用基因枪法转化海带配子体，经孤雌或受精途径再生幼孢子体后，用氯霉素筛选幼孢子体获得转基因海带，然后进行海上安全栽培和转基因产品的检测与提取。目前该表达系统已成功实现报告基因（β-半乳糖苷酶基因，lacZ）和功能基因（乙肝表面抗原基因，HBsAg）的稳定表达。 由于海带孢子体表达系统需经孢子体再生和海上栽培等阶段，周期较长，而且转基因安全性问题也在一定程度上制约其研究与应用。因此，我们在海带孢子体表达系统的基础上又建立和优化了海带配子体表达系统，并成功实现了报告基因（绿色荧光蛋白基因，GFP）的瞬间表达和功能基因（瑞替普酶基因，rt-PA）的稳定表达。虽然海带配子体表达系统能避免转基因安全性问题，周期较短，但在表达量和生物量积累方面，与孢子体表达系统相比还有较大差距。 本文首先在海带配子体表达系统中成功实现了人酸性成纤维细胞生长因子基因（hafgf）和鲎素基因（tac）的稳定表达，制备了转基因海带配子体，然后将光生物反应器培养技术应用于转基因海带配子体的高效增殖，以期解决阻碍海带配子体表达系统发展的量的问题，并为转基因海带配子体的大规模培养提供试验依据和技术支持。 本文的研究结果为： 1、人酸性成纤维细胞生长因子基因和鲎素基因可以稳定整合到海带配子体基因组中，实现转基因产物的表达。 2、根据转基因海带配子体的生长特点，研制开发了一套培养体积为300 ml的鼓泡式光生物反应器，它具有操作简便、成本低廉、适合海带配子体生长等特点。随后将培养体系扩大到2.5 L，并研究了光对转基因海带配子体生长的影响，试验结果显示，转基因海带配子体在光强为30 μE m-2 s-1时即可达到光饱和生长，最优光周期为14:10 LD，而且蓝光可促进转基因海带配子体的生长。 3、在前期研究工作的基础上，为改善反应器内的传质条件，我们又设计研制了2.5 L气升式光生物反应器用于转基因海带配子体的高效增殖。研究发现，气升式光生物反应器较鼓泡式光生物反应器能明显地改善反应器内的传质状态，实现转基因海带配子体更高密度的培养（生物量可达到1,990 mg L-1），是一套高密度悬浮培养转基因海带配子体的有效装置和设备。

海藻表面附着弧菌多样性分析及方法研究

对四种大型海藻：江篱(Gracilaria textorii)、孔石莼（Ulva pertusa）、海带苗（Laminaria japonica）和多管藻（Polysiphonia urceolata）表面附着弧菌的多样性进行了分析，同时对多样性分析中采用的不同方法进行了比较。 利用TCBS培养基从四种海藻表面总共分离到12株细菌：G1、G2分离自江篱，U3分离自孔石莼，L4、L5、L6分离自海带苗，P7、P8、P9、P10、P11、P12分离自多管藻。菌株G1，G2属于盐单胞菌(Halomonas)，其余10株细菌都属于弧菌(Vibrio)。 对12株细菌的酶学活性、抗生素抗性进行了研究。发现除G1、G2外，其余菌株都可产生淀粉酶和明胶酶。菌株G1、G2和U3对氨苄青霉素、链霉素和四环素有很强抗性。 采用多种分子生物学方法（16S rDNA、gyrB、RFLP、DGGE ）分析了上述12株菌的系统发育关系，对不同方法获得的结果进行了比较。 12株菌的16S rDNA系统发生树可分为4个明显分支。G1、G2与细菌H. meridiana构成一个分支。U3与V. lentus构成一个分支。L4、L5、L6、P9、P10、P11、P12与V. tasmaniesis形成一个分支。P7、P8与V. splendidus形成一个分支。 以gyrB基因序列为基础构建的系统发生树将G1、G2以外的10株弧菌分成4个较大分支，L4、P9属于同一分支，L6、P8、P10、P11和P12属于一个大的分支， U3、L5各自构成一个分支。菌株G1、G2没有得到gyrB基因序列扩增带。表明试验设计的引物是弧菌特异性引物。相对16S rDNA，不同菌株间gyrB基因序列差异性更大。 RFLP分析结果显示，12株细菌HinfI酶切后得到6种带型，SmaI酶切后得到4种带型。结合16S rDNA、gyrB基因的分析结果可知，RFLP可以在种的水平上有效进行细菌多样性分析。 12株细菌的DGGE分析结果显示，G1、G2与其它菌株电泳图谱有明显不同。菌株U3独自构成一种带型，L5、L6构成一种带型。表明DGGE技术在属的水平上分析细菌多样性效果较好，在种的水平上分析细菌多样性有一定的局限性。

紫菜壳孢子萌发过程及其世代差异研究

紫菜是一类海洋藻类研究的模式系统，具有重要的经济价值和理论研究意义。本研究基于紫菜的世代交替生活史，对其壳孢子萌发过程进行了研究，并对丝状孢子体与叶状配子体的世代差异进行了分析，主要包括以下三部分： 1） 对紫菜丝状孢子体与叶状配子体的连接枢纽——壳孢子的发育过程及其光影响进行了研究与讨论，发现壳孢子只有在附着后才能形成细胞壁并发育，说明壳孢子的附着是触发了壳孢子细胞壁的形成以及后期发育的开关，亦即附着是触发紫菜世代交替过程中配子体转录组表达的开关；纤维素酶和果胶酶均能抑制壳孢子附着，但影响机制各不相同，推测果胶质主要介导壳孢子的初始附着，而纤维素则与永久附着相关；波长≥580 nm的高强度（200 μmol•m-2•s-1）可见光有利于壳孢子早期发育。 2） 结合现有藻类数据，对坛紫菜丝状孢子体阶段11000 EST数据进行了大规模的生物信息学分析，结果首次发现坛紫菜丝状孢子体中可能存在PCK型C4光合固碳途径，并筛选出44条在紫菜孢子体中表达上调的代表基因。 3） 结合坛紫菜、条斑紫菜、海带和红毛菜，对红藻和褐藻等大型海藻孢子体与配子体阶段代表基因Rubisco的表达与羧化酶活性差异进行了研究分析，结果表明Rubisco的表达量和初始羧化酶活在其配子体中均显著高于其孢子体世代，即与藻体不同世代的相对复杂度无关，而与染色体倍性相关，说明Rubisco的世代差异极有可能与染色体倍性相连锁，因而可能是海藻世代交替过程中的重要功能基因。

褐藻两个光系统的色素-蛋白质复合物的分离及特性研究

以褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida)、萱藻(Scytosiphon lomentarius)、海蒿子(Sargassum confusum)、叉开网地藻(Dictyopteris divaricata)、海带(Laminaria japonica)、囊藻(Colpomenia sinuosa)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、水云(Ectocarpus confervoides)为材料，对其色素-蛋白质复合物的分离技术及其特性进行了系统研究。通过对裙带菜色素-蛋白质复合物分离技术及其影响因素的研究，确立了褐藻的PAGE分离方法。采用Tris-Gly电泳分离系统，以非离子去污剂DMG或DIG为增溶剂(DMG: Chl=20: 1, DIG: Chl=50: 1, 4 ℃增溶1 h)，10%的分离胶浓度，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为30: 0.8,从裙带菜中成功地分离出8条含色素的蛋白质复合物带。采用Anderson命名系统，以高等植物菠菜为参照，将其命名为CPIa, CPI, CPa, LHC_1, LHC_2, LHC_3, LHC_4和LHC_5。游离色素较少。通过对三种褐藻的色素-蛋白质复合物的表观分子量测定、光谱学研究以及对裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽组成分析，揭示了褐藻各种色素-蛋白质复合物的特征。CPIa是褐藻分子量较大的PSI复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。CPI是褐藻的PSI核心复合物，为P700-叶绿素 a-蛋白质复合物。CPa是褐藻的PSII复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。其余5条为捕光色素-蛋白质复合物，LHC_1和LHC_3是墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物，LHC_2, LHC_4和LHC_5是叶绿素 a/c-蛋白质复合物。根据裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽分析结果并与高等植物比较，提出褐藻PSI和PSII的结构模型。褐藻PSI和PSII的反应中心多肽与高等植物相同，捕光复合物明显区别。褐藻LHCI和LHCII的多肽组成相同，都是由单一的20 kDa多肽组成。褐藻叶状体、叶绿体、类囊体膜和PSI复合物的77 K 荧光发射光谱具有特异性，缺少高等植物PSI特征的730 nm 荧光峰。叶状体的77 K 荧光发射光谱按荧光主峰的波长分为两种类型，一种类型的荧光主峰在690 nm，另一种类型的在705-720 nm。三种褐藻PSI复合物的77 K 荧光发射光谱相同，有两个分别们于680 nm和715 nm 的发射峰。褐藻的77 K 荧光特异是由PSI的结构决定的。根据褐藻PSI复合物的荧光特性以及去污剂增溶动力学分析结果，推动F715来自褐藻核心色素-蛋白质复合物，F680来源于PSI复合物中的捕光复合物。褐藻PSI复合物中缺少高等植物发射730 nm 荧光的LHCIb复合物的能量传递模型。

海带蓝光受体及相关基因的研究

本研究中运用四种不用的方法提取海带孢子体RNA，通过对比分析，确定了采用CTAB提取液[2% (w/v) CTAB,100 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 50 mM EDTA, pH 7.5, 2 M NaCl, 50 mM DTT]提取RNA的方法，该方法的主要改进之处： (1) 高浓度（50 mM）的 DTT作为防止多酚氧化的还原剂加入提取液中；(2) 1/4 体积的乙醇和 1/9 体积的3 M 醋酸钾（pH 4.8）用来沉淀去除多糖；(3) 1/10倍体积的3 mol/L醋酸钠（pH 5.0）和两倍体积的乙醇选择性沉淀RNA；(4) -80℃沉淀30 min沉淀RNA。CTAB改进法提取的海带孢子体RNA质量好（A260/280 =1.96±0.05)，产量高（68 μg/g），分离的RNA可用于RT-PCR反应，扩增相关基因片段。该方法提取海带配子体RNA效果也很好。 根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)、 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 、铁线蕨(Adiantum capillus-veneris)、转板藻(Mougeotia scalaris)和无隔藻(Vaucheria frigida)等的蓝光受体蛋白保守序列，设计一系列简并引物，进行RT-PCR扩增，筛选并克隆测序了4条序列片段，通过比对分析，所得序列与已知的蓝光受体基因序列不一致。在所获得的序列中，一条783 bp的序列与肌醇-1-磷酸合成酶基因的片段有较高的相似性，通过RACE法克隆出该基因的3’末端，5’末端克隆没有成功，全长序列有待深入分析。

褐藻胶的化学结构与吸附二价金属离子功能关系的研究

本文在测定由中国产海带（Laminaria japonica）、海蒿子（Sargassum pallidum）、海黍子（S.kjellmanianum)和鼠尾藻（s.thunbergii）提取的无损褐藻胶的糖醛酸组成和嵌段结构的基础上，较系统地研究了褐藻酸及其钠盐钙盐对二价金属离子的静态交换平衡特性与褐藻胶结构的关系，初步制成了具有离子交换性能的粒状褐藻酸钙树脂，开对干燥过的褐藻酸、褐藻酸钠和褐藻酸钙在水溶液中的吸附机理进行了探讨和比较。其结果如下：1. 海带、海蒿子、海黍子和鼠尾藻提取的褐藻胶具有不同的组成和嵌段结构，其M/G比值分别为1.86、1.50、1.22和1.27。文中引入结构参数η不胜数= (F_MG))/(F_M * F_G)，η值分别为0.62、0.13、0.36和0.41。后三种马尾藻褐藻胶与海带的结构和性质有差异，而海黍子和鼠尾藻胶在结构与性质方面比较接近。2. 褐藻胶的结构对吸附二坐金属离子具有很大影响，褐藻酸钠Cd-Sr交换反应的分离因子随着M/G比值的增大而增大；褐藻酸钙对Cu~(2+)离子的交换容量随着MG-嵌段比例（或η值）的增大而增大；褐藻酸对Sr~(2+)、Ba~(2+)、Cd~(2+)混合离子的总交换量随着M-嵌段比例的增大而增大。3. 干燥进的褐藻酸、褐藻酸钙以及褐藻酸钠在水溶液中具有不同的吸附机理。褐藻酸钠在溶液中，主要是二价离子诱导G-分子链协同聚合——“蛋箱模型”~(26)，褐藻酸吸附Cu~(2+)、Sr~(2+)时，除了离子交换外，还有使分子链聚合的螯合作作，分子链上未交换的 -COOH可能参与Sr~(2+)的配位，而Cu~(2+)无此现象。褐藻酸钙吸附Cu~(2+)时，可能有部分Cu~(2+)离子进入“蛋箱”内部替代Ca~(2+)离子而重新配位，但“蛋箱”的骨架不变，而吸附Sr~(2+)时，则表现出与离子交换剂截然不同的分子吸附行为。4. 不溶性的褐藻酸和褐藻酸钙具有较高的吸附选择性，尤其是粒状褐藻酸钙树脂的选择性高、稳定性好，可能应用于贵金属的回收、分离与废水处理等。

两种海藻提取物的化学成分和生物活性的研究及其应用

本论文的研究工作由两部分组成，第一部分研究了海带（Laminaria japonica）水提取物中的活性物质，并研究了提取物对蔬菜促生长的影响及其作用机制。第二部分对三列凹顶藻(Laurencia tristicha)乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选和化学成分研究，并对其中分离得到的单体化合物进行了生物活性筛选。 第一部分主要以中国人工养殖的海带为原料，使用与海藻多糖生产相结合的提取技术并浓缩其中的有效成分。对浓缩提取物进行了蔬菜的农田效果实验，并对作物抗旱性能的增加、作物硝酸盐积累的减少、作物品质的改善、以及作物抵抗病毒病的能力等影响进行了作用机制方面的研究。海藻浓缩提取物进行的农田效果实验表明：作物抗旱型相对含水量RWC值在92%~94%之间；病毒病的防治效果最高可达到91%；作物的品质有明显的改善，最重要的是首次发现海藻提取物有降低蔬菜中硝酸盐的含量（硝酸盐的含量是与有机蔬菜区别的重要指标之一）的作用。该部分研究工作的创新性主要体现在：（1）首次在国内外提出和采用与海藻多糖生产相结合的提取技术。该技术的应用不但减少了提取成本，使工业化生产成为可能,更重要的是使我国的海藻工业生产可能实现高值化和开辟综合利用的新途径。（2）首次发现海藻中的小分子海藻多糖具有和细胞激动素、甜菜碱、植物生长素等活性物质同样的生物活性。 第二部分的研究是在查阅了大量的近20年来国内外有关红藻凹顶藻中化学成分研究的相关文献的基础上，对凹顶藻中的次生代谢产物进行了综述。该论文主要是通过对红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行化学成分分析和生物活性筛选以期能够发现具有药用前景的活性先导化合物。 为了寻找具有生物活性的化合物，我们对采自我国南海硇洲岛海域的红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选。采用MTT法对其在KB细胞株、Bel-7402细胞株、PC-3M细胞株、MCF-7细胞株、Ketr-3细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用酶模型对其进行了Na+,K+-ATPase的抑制活性测试；采用MTT法对其在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相对Na+,K+-ATPase和犬血管平滑肌细胞增殖具有一定的抑制活性。 利用正相和反相色谱、Sephadex LH-20色谱以及反相HPLC等手段进行分离纯化，从我国南海海域的红藻三列凹顶藻中分离得到33种化学成分，通过波谱学方法（IR、MS、NMR）以及X-ray单晶衍射试验对其化学结构进行了确证，其中化合物L1~L8为新结构化合物，化合物L5为具有新骨架的全新结构化合物，化合物L9~L13为新天然产物，化合物L18和L22系首次从海洋生物中获得，所有化合物均为首次从该属海藻中得到。新化合物L1~L8均为倍半萜类化合物，命名分别为：(1R,3R)-(-)-3-(3-hydroxy-4-methylphenyl)- 1,3-dimethyl–2-methylidene cyclopentanol (L1), (1R,3R)-(-)-3-(4-methylphenyl)-1,3-dimethyl-2-methylidenecyclopentanol (L2)， (1R, 3R)-(-)-3-(2-hydroxy-4-methylphenyl)-1,3-dimethyl–2–methylidenecyclopentanol (L3)，(+)-(1S,2R)–2-(3–hydroxy–4–methylphenyl)-1,2-[3.1.0]bicy-clohexane (L4)，()-(1S,2R) -5-hydroxy–6–methyl-spiro-dihydrobenzofuran-2(3H),2-{1-methyl-[3.1.0]bicyclohexane} (L5), (+)-6-methyl-2-(p-tolyl)hept-4-en-2,6-diol (L6)，(3R,3aS,8bS)-(-)-2,3,3a,8b–tetrahydro–7-bromo – 3 a– hydroxymethyl - 3, 6, 8b - trimethyl-1H- cyclopenta[b] benzofuran (L7 )，(3R, 3aS, 8bS) - (-) - 2,3,3a,8b–tetrahydro–3 a–hydroxymethyl-3,6,8b -trimethyl -1H – cyclopenta [b] benzofuran (L8)。25个已知结构化合物确定为：(+)-(1R,2R)-4-bromo-1,5, 9–trimethyl–12– methylidene–8–oxa-tricyclo[7.2.1.02]dodeca-2,4,6-triene (L9)，(3S,3aR,8bS)-(-)-2,3,3a, 8b– tetra -hydro–7-bromo–3–hydroxy-3,3a,6,8b-tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofu- ran (L10 )，(3R, 3aR, 8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro – 7 - bromo – 3 – hydroxy - 3,3a,6,8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta [b] benzofuran (L11 )，(3S,3aR,8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro –3–hydroxy -3, 3a, 6, 8b - tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofuran (L12 )， ( 3aR, 8bS) - (-) - 3a,8b –dihydro–7 - bromo – 3, 3a, 6, 8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta[b]benzofuran (L13 )，aplysinol (L14 ) ，aplysin (L15)，laurebiphenyl (L16)，johnstonol (L17)，gossonorol (L18)，7,10-epoxy-ar- bisabol-11-ol (L19)，10-epi-7,10-epoxyarbisabol-11-ol (L20) 3β-hydroxy- 5α, 6α-epoxy- β- ionone (L21 )，3β-hydroxy-5β,6β-epoxy-β-ionone (L22 )，胆甾醇 (L23 )，胆甾-5-烯-3β,7α二醇胆甾-5-烯-3β,7α二醇 (L24)，β-谷甾醇 (L25)，叶绿醇 (L26 )，玉米黄素 (L27 )，对羟基苯甲醛 (L28 )，3-吲哚甲醛 (L29 )，1-O-十六烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇(L30 )，1-O-十八烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇 (L31 )，丙三醇-1-软脂酸单酯 (L32 )，正十六碳酸 (L33 )。 采用MTT法对其中23个单体化合物在Bel-7402细胞株、BGC-823细胞株、A549细胞株、A2780细胞株、HCT-8细胞株和HELL细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用MTT法对其中13个单体化合物在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，部分单体化合物显示出一定的生物活性。

利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达

1993年以来，本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上，利用海带世代交替生活史，建立了海带遗传转化体系,并申请国家专利PCT/CN03/00534（Trends in Biotechnology, 2005, 23,264-268.）。海带遗传转化体系是建立在基因枪转化海带配子体，经孤雌或受精途径再生幼孢子体后用氯霉素筛选以及海上安全栽培等一系列技术平台上的新型体系。目前该体系已经成功实现报告基因（β-半乳糖甘酶基因，LacZ）和目的基因（乙肝表面抗原基因，HBsAg）在孢子体阶段的稳定表达。由于应用该体系表达目的基因须经过孢子体再生以及海上栽培等阶段，周期较长，因此本论文拟通过以下5方面工作初步建立以配子体营养增殖为基础的新型海带表达体系，并尝试在配子体阶段实现转化、筛选、增殖及产物检测等操作。1)确立针对配子体的选择标记。2)利用光生物反应器增殖配子体。3)拓展新的报告基因种类。4)克隆内源高效启动子。5)利用该体系表达rt-PA基因（编码价格昂贵的特效溶栓药，瑞替普酶）。本论文研究结果为1)升高温度能够显著增强草丁膦的筛选效果，根据敏感性实验统计结果确定了草丁膦作为海带配子体遗传转化选择压力的筛选方案为40mg/l连续处理7d×3次。2)利用室内光生物反应器营养增殖海带配子体技术，经草丁膦筛选，实现了SV40启动子驱动草丁膦抗性基因bar在配子体细胞中的稳定表达。3)采用调整配子体营养生长状态的方法减低背景荧光，从而首次观察到增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）在海带配子体细胞中的瞬间表达。4)克隆了海带肌动蛋白基因（actin）的基因组序列，这是褐藻肌动蛋白基因组序列克隆的首次报道，通过染色体步移获得海带actin基因上游约450bp的片段。5)在上述工作基础上，与中国药科大学合作构建了瑞替普酶基因（rt-PA）的海带表达载体，并实现该基因在海带配子体细胞中的稳定表达，产物具有正确的生物学活性，平均表达量达到0.159μg/mg可溶蛋白。这是该基因在植物中表达的首次报道。研究结果提示在光生物反应器营养增殖体系基础上构建海带配子体表达系统的方案是可行的。

海带根中alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的提取及其酶抑制作用动力学研究

alpha-葡萄糖苷酶是一类能够催化碳水化合物alpha-1,4-糖苷键水解的酶，是动物体内许多代谢途径中的关键酶，具有多方面的靶向药理活性。研究表明，alpha-葡萄糖苷酶与糖尿病，艾滋病，恶性肿瘤、溶酶体贮积症等疾病的发生机制有重要关系，已经成为治疗这些疾病的重要靶点。 海带（Laminaria japonica） 属褐藻门、海带属植物。自二十世纪四十年代从日本引入中国以来，已成为中国沿海重要的海洋经济作物。海带藻体叶片部分大都用来提炼碘、甘露醇和藻酸盐，但其假根部分一直被当作化工工业和食品工业的废料，而未得到有效的利用。在中国的沿海一带，海带根作为一种抗糖尿病的民间药物，有很长的历史。因此从海带根中提取分离降血糖成分并研究其作用机制将具有重要的意义。 本论文第一部分进行了海带根中具有alpha-葡萄糖苷酶抑制作用的活性组分的筛选。首先我们按照海带根中所含成分的极性不同进行了提取分离，即将海带根乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。结果乙醇粗体物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位与水部位的酶抑制IC50分别为1589µg/L、970µg/L、 380µg/L、1616µg/L、1106µg/L。乙酸乙酯部位的酶抑制活性最强。 本论文第二部分对海带根乙酸乙酯部位的提取物的体内降糖活性进行了研究，结果表明乙酸乙酯部位可以降低糖尿病大鼠餐后血糖，与阴性对照差异极显著（P<0.01）。小鼠服药后表现出的生命体征与伺服拜糖平后表现出的生命体征类似。 在以上工作基础上我们以alpha-葡萄糖苷酶的抑制活性为导向，用天然产物化学的方法对活性成分进行追踪，通过光谱、波谱与理化性质鉴定出了具有显著alpha-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物：丁基-异丁基-邻苯酸二甲酯，并对其进行了酶抑制动力学研究。研究表明丁基-异丁基-邻苯酸二甲酯对alpha-葡萄糖苷酶表现为非竞争性抑制类型，IC50达到13.6μg/mL，且Km=2.39 g/L 本研究工作为进一步研究海带根降血糖成分的作用机理提供了研究基础。

海带中碘的含量、分布以及化学形态的研究

本文验证了碘离子选择电极法作为准确测定新鲜海带碘含量的方法。第一次系统地测定了新鲜海带中碘的含量、分布以及有机碘和无机碘的比例，测定了新鲜海带中的游离氨基酸、结合氨基酸以及总氨基酸的含量，并首次利用单向纸色谱和红外光谱，纯化并检测了新鲜海带中的含碘氨基酸。结果表明，海带中碘的平均含量占鲜重的0.133％。同时发现海带中不同部位碘的含量不同，分布特点与海带的生命活动有关，代谢较旺盛的部位，富集碘的能力越强，但是有机碘的含量反而下降。