转基因海带配子体的制备与高效增殖

海带具有很高的营养价值和经济社会价值。自20世纪90年代以来，本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上，根据海带自身特点，建立了海带遗传转化体系（海带孢子体表达系统），它的基本原理是利用基因枪法转化海带配子体，经孤雌或受精途径再生幼孢子体后，用氯霉素筛选幼孢子体获得转基因海带，然后进行海上安全栽培和转基因产品的检测与提取。目前该表达系统已成功实现报告基因（β-半乳糖苷酶基因，lacZ）和功能基因（乙肝表面抗原基因，HBsAg）的稳定表达。 由于海带孢子体表达系统需经孢子体再生和海上栽培等阶段，周期较长，而且转基因安全性问题也在一定程度上制约其研究与应用。因此，我们在海带孢子体表达系统的基础上又建立和优化了海带配子体表达系统，并成功实现了报告基因（绿色荧光蛋白基因，GFP）的瞬间表达和功能基因（瑞替普酶基因，rt-PA）的稳定表达。虽然海带配子体表达系统能避免转基因安全性问题，周期较短，但在表达量和生物量积累方面，与孢子体表达系统相比还有较大差距。 本文首先在海带配子体表达系统中成功实现了人酸性成纤维细胞生长因子基因（hafgf）和鲎素基因（tac）的稳定表达，制备了转基因海带配子体，然后将光生物反应器培养技术应用于转基因海带配子体的高效增殖，以期解决阻碍海带配子体表达系统发展的量的问题，并为转基因海带配子体的大规模培养提供试验依据和技术支持。 本文的研究结果为： 1、人酸性成纤维细胞生长因子基因和鲎素基因可以稳定整合到海带配子体基因组中，实现转基因产物的表达。 2、根据转基因海带配子体的生长特点，研制开发了一套培养体积为300 ml的鼓泡式光生物反应器，它具有操作简便、成本低廉、适合海带配子体生长等特点。随后将培养体系扩大到2.5 L，并研究了光对转基因海带配子体生长的影响，试验结果显示，转基因海带配子体在光强为30 μE m-2 s-1时即可达到光饱和生长，最优光周期为14:10 LD，而且蓝光可促进转基因海带配子体的生长。 3、在前期研究工作的基础上，为改善反应器内的传质条件，我们又设计研制了2.5 L气升式光生物反应器用于转基因海带配子体的高效增殖。研究发现，气升式光生物反应器较鼓泡式光生物反应器能明显地改善反应器内的传质状态，实现转基因海带配子体更高密度的培养（生物量可达到1,990 mg L-1），是一套高密度悬浮培养转基因海带配子体的有效装置和设备。