牡丹复合体的分子进化和系统学研究---细胞核核糖体基因变异的分析

牡丹复合体(Paeonia suffruticosa Andr. Complex)属芍药属牡丹组，为中国特有的落叶亚灌木，野生类型均为濒危种，仅局限分布于以秦岭为中心的较小区域。由于分布区有限，个体数量少，栽培历史长，育种广泛，种间极易杂交，网状进化的广泛发生，使得该复合体分类混乱。本文选取牡丹复合体6个野生种以及2个近缘类群，采用分别基于核酸印迹杂交和聚合酶链式反应的限制性酶切片段长度多态性分析，对细胞核核糖体基因片段ITS/18s的变异进行了分析，并且结合采用微卫星DNA指纹分析技术。选取18种内切酶对特异片段进行酶切消化。共得149个酶切位点，其中67个为变异位点，占45.0%。其中编码区(2．Okb，含18s，5.8s，26s)有突变位点29个，占该区段长度的1.4%;非编码区(490bp，含ITS-1，ITS-2)有突变位点38个，占该区段长度的7.8%。由此，可明显比较二者进化的保守程度和进化速率。两段间隔区的变异程度也存在差异。ITS-1为6.0%．ITS-2为9.9%。这说明构建系统树时二者的选用应得到综合考虑或加权。在复合体内不存在长度变异，即无缺失或插入发生，暗示了该复合体各种之间亲缘关系的紧密。根据Neighbor-joining法并计算遗传距离构建系统关系图，结果如下：(1)卵叶牡丹（神农架红花类群）与紫斑牡丹分化较早，考虑其与复合体内其它各种之间的遗传距离，支持将其定为新种的观点;(2)神农架白花类群与与卵叶牡丹亲缘关系非常相近，这一结果支持了来自其它分子和表型分析的结果;(3)延安牡丹与紫斑牡丹亲缘关系极近，但与矮牡丹关系较远，是否为上述两个种的杂交种，目前为止尚无充分的证据，作为存疑种处理;(4)川牡丹和矮牡丹进化关系密切，这一结果与ITS序列分析结果完全一致，加之其地理分布式样的不连续性说明了它们的古老和残存性质，这可进而推广至本复合体乃至整个牡丹组。我们认为现存的分布格局可能是地理与气候演化的产物，估计牡丹组的野牡丹复合体从本复合体分化出去的时间约为310 - 750万年前。由于基因间协调进化的不均一作用和该类群杂种的早期起源限制了核糖体基因在追溯其网状进化历程上的作用，这符合基因转换的梯度理论。最后讨论了nrDNA得到的基因树与其它的基因树和种系树之间的关系。

龙胆科蔓龙胆属及其相关类群的系统学研究

本文回顾了龙胆科蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和翼萼蔓属的研究历史，对这些类群的外部形态、花部解剖结构、染色体、花粉形态及胚胎学进行了研究，并结合已有的资料，探讨了这些类群的分类学问题。主要结论如下： 1．外部形态 蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和龙胆属其他组之 间以及蔓龙胆属和翼萼蔓属之间在外部形态上均存在差异。 2．花部解剖结构 蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和龙胆属其他组的花部解剖结构存在较多地相似之处，同时蔓龙胆属和双蝴蝶属的花被维管束和腺体比龙胆属狭蕊组和龙胆属其他组的特化。而翼萼蔓属的花部解剖结构与蔓龙胆属的差异较大，与扁蕾属的花部解剖结构较相似。 3．染色体 本文对蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和翼萼蔓属的7种植物的染色体数目、基数和核型对称性作了研究，其中6种植物的染色体为首次报道，它们是：披针叶蔓龙胆C．delavayi、双蝴蝶T.chnense、峨眉双蝴蝶T．cordatum、锯齿龙胆 G．serra、毛脉龙胆G．souliei、和翼萼蔓P．volubilis。蔓龙胆属、双蝴蝶属和龙胆属狭蕊组的核型不对称性稍强于龙胆属其他组，但在染色体组成上十分相似。翼萼蔓属和蔓龙胆属的染色体差异较大，面与扁蕾属的染色体较相似。 4.花粉形态蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和龙胆属其他组均具有球形或长球形、3孔沟、沟长而宽、外壁纹饰为条纹一无穿孔和条纹一穿孔的花粉类型。而翼萼蔓属的花粉为球形、纹饰为网状纹馋与蔓龙胆属不同，与扁蕾属的花粉较相似。 5．胚胎学 本文对披针叶蔓龙胆C，delavayi、双蝴蝶T．chinense、峨眉双蝴蝶T．cordatum、条纹龙胆G. striata和翼萼蔓P．volubilis作了较详细的胚胎学研究，这些类群在花药壁的分化和形成、胚珠和胎座类型、卵器中的助细胞和反足细胞、种皮以及胚发育等特征上存在差异，并且在胚胎学特征上各自拥有原始和进化的性状。蔓龙胆属、双蝴蝶属和龙胆属之间的胚胎学性状差异较大，龙胆属狭蕊组与双蝴蝶属的胚胎学性状较相似，而与蔓龙胆属和龙胆属其他组的差吴较大。翼萼蔓属的胚胎学性状与扁蕾属的较相似，而与蔓龙胆属的差异较大。 6．综合分析外部形态、花部解剖结构、染色体、花粉形态及胚胎学性状，结果表明，蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和龙胆属其他组是亲缘关系十分相近的类群，在某些特征上已存在明显地演化极向，但在大多数特征上演化极向不明。蔓龙胆属和双蝴蝶属分别作为独立属处理较为合适，而且两属的亲缘关系很近。狭蕊组仍应放在龙胆属，蔓龙胆属比双蝴蝶属与龙胆属的亲缘关系更近一些。翼萼蔓属也应作为一独立属处理，而且该属可能与扁蕾属的亲缘关系较近，而与蔓龙胆属亲缘关系较远。 7．本文还讨论了蔓龙胆属、双蝴蝶属、龙胆属狭蕊组和翼萼蔓属的地理分布。

兰科舌喙兰属的研究

对舌喙兰属的研究表明，该属具下列独特的特征：具一枚着生于茎基部的叶;叶片肉质、几平贴地表;花具硕大而伸出的蕊喙;药室基部延伸成花药管。该属花部器官在发育早期表现为典型的红门兰亚族特点，但在发育后期出现一些特有的性状。尽管舌喙兰属在植物体形态、花部形态和发育等方面表现出许多特化的性状，但染色体水平上与红门兰亚族东亚产的其他属并无明显差异。舌喙兰属植物一般喜欢在石灰岩地区生长，但有些各类也可在其他土壤中生长。野外观察表明扇唇舌喙兰通过食源性欺骗系统来吸引唯一的传粉者：芒康条蜂。其他各类虽亦有类似结构，但未进行观察。 ITS序列数据支持：1）舌喙兰属的6个种为单系类群;2）舌喙兰属、紫斑玉凤花和短距红门兰等植物体形态相似的类群构成关系较为密切的分支;3）主要分布于亚洲的无柱兰属和铣兜被兰属互为关系密切的姐妹群，它们与广布红门兰有较弱的联系。无柱兰－兜被兰类群和舌喙兰－紫斑玉凤花类群构成红门兰亚族中的一个分支;而二叶红门兰、西南手参、滇藏舌唇兰和欧洲产红门兰亚族的代表种类构成另一个分支。 总之，植物体形态，花部形态和发育、传粉模式、生态学特点以及分子数据，都表明舌喙兰属是一个特化的类群。 最后，对舌喙兰属进行了全面修订，确定该属具7个种，主要分布于中国，个别种类向南可达泰国和缅甸南部，向西可达不丹和尼泊尔。

铁线莲属尾叶铁线莲组的修订－兼论铁线莲属基于花粉形态学证据的系统发育

铁线莲属尾叶铁线莲组是该属中记录种类最多的类群，主要分布在亚洲亚热带至温带地区，少数种类分布至亚洲及非洲的热带地区。由于缺乏野外观察和标本不够丰富等原因，有些种类的分类处理尚不能令人满意，应予修订。尾叶铁线莲组的组下分类系统以及与近缘组之间的系统关系也存在争议，还需深入研究。本文作者经过大量的标本馆工作和全面的文献考证，结合野外观察，对该组植物进行了分类学修订，同时通过基于形态性状的分支系统学和花粉形态研究对尾叶铁线莲组及铁线莲属的系统发育进行了探讨，结果如下： 1.分类修订 通过对国内外近20 个标本馆的5000 余份馆藏标本研究，结合全面的文献考证和广泛的野外观察，发现花丝形态、花药毛被状况、药隔是否凸起、萼片外侧附的属物等性状较为稳定，是分亚组的主要依据。而复叶类型、花序形态及花梗毛被状况、萼片颜色等性状为较好的分种性状。 本文在考证了近140 个种及种下等级的分类学名称后，确认尾叶铁线莲组植物共有37 种20 变种，共分为5 个亚组，另有4 种7 变种暂存疑;2 种、2 变种降为新异名;新组合6 个，其中5 个为改级新组合;发表新亚组1 个;发现中国新纪录变种1 个;纠正了以前研究者工作中对C. aethusifolia var. latisecta 的鉴定错误;初步澄清了C. jingdungensis 及C. jinzhaiensis 的一些名实混乱;指出了前人工作中的一些拼写错误;统一了植物的中文名称，并新拟了15 个分类群的中文名称;给出了各个种的形态描述、地理分布图以及分亚组和分种检索表。 2.分支系统学 在分类修订基础上选取了35 个形态性状，对尾叶铁线莲组的37 个种，和尾叶铁线莲组的近缘组Sect. Bebaeanthera 中的2 个种，以C. alternata 为外类群，利用系统发育分系软件PAUP 4.0 beta 10 对数据矩阵进行分析。共得到182 棵最简约树，树长为182 步，一致性指数（CI）=0.385，保持性指数（RI）=0.685。结果显示：尾叶铁线莲组为一并系类群，Sect. Bebaeanthera 中的两个种：C. pseudopogonandra 和C. barbellata 与Subsect. Otophorae 亲缘关系更为接近，应并入尾叶铁线莲组中;Subsect. Otophorae 与Subsect. Grandiflorae 各自聚为两大支，从分支图基部与其他类群分开，为本组早期分化出的类群;Subsect. Acutangulae 与Subsect. Connatae 中具有红色花的C. lasiandra 和C. dasyandra 近缘;分布于东亚北部地区的Subsect. Aethusifoliae 与分布于我国横断山区的C.rehderiana 和分布于印度的C. roylei 近缘;根据分支系统学分析的结果，对尾叶铁线莲组组下分类系统进行了调整，建立了新亚组Subsect. Otophorae。 3.花粉形态 在扫描电镜下研究了铁线莲属148 种12 变种和锡兰莲属3 个种的花粉形态特征，并在透射电镜下研究了部分种类的花粉外壁结构。 结果表明：铁线莲属花粉粒一般为近球形、球形或扁球形。具三沟的花粉赤道面观为椭圆形或近圆形，极面观为三裂圆形，大小为14.8-32.1 μm ×14.2-28.7 μm;具散沟或散孔的花粉（全为球形）直径大小为14.8-36.6 μm。花粉具三沟、散沟或散孔。在三沟类型中常伴有不同比例的散沟花粉。萌发沟狭长或稍宽，有整齐或不整齐下陷的边缘，沟膜上有颗粒状纹饰或刺状纹饰;萌发孔一般圆形或不规则形，分布不规则。外壁由薄到较厚，厚度为0.8-2.5 μm，外层稍厚于内层。在透射电镜下本属花粉外壁具备被子植物花粉典型的外壁层次，即外壁内层和外壁外层。外壁内层为一层均匀的质密的无结构的层次。外壁外层由3 层组成：覆盖层，柱状层，和基层。覆盖层上均匀分布有小刺状纹饰和小穿孔。 锡兰莲属花粉粒为圆球形，其直径大小为14.9-18.8 μm。具散孔。萌发孔一般圆形，分布不规则，孔膜上有颗粒状纹饰或刺状纹饰。外壁厚度为0.8-1.8 μm，外层稍厚于内层。覆盖层上均匀分布有小刺状纹饰和小穿孔。 根据花粉形态在花粉粒大小、萌发孔的类型和外壁纹饰方面的差异将两个属的花粉分为6 个类型，其中类型1 再分为两个亚型。在这些花粉类型中，类型1 为三沟花粉，类型3 为三沟至散沟花粉，其余类型为散孔花粉。类型1 的亚型 1b 在铁线莲属中分布最广，18 个组中有13 个组具有这种类型的花粉，是铁线莲属中最原始的花粉类型，其他类型和亚型均由此亚型直接或间接演化而来。 推测这两属花粉形态特征的演化趋势为：1. 萌发孔. 三沟→（散沟）→散孔。 2. 花粉粒大小. 小（散孔，直径14.9-18.8 μm）←中等（三沟，24.2 μm ×24.8 μm） →大（散孔，直径28.9-36.5 μm）。3. 表面纹饰. 小刺不明显、分布密集→小刺明显、分布稀疏。 铁线莲属及锡兰莲属花粉形态特征对于这两个属植物的区分以及铁线莲属下组间系统发育关系的探讨具有重要意义。锡兰莲属与铁线莲属中的Sect. Naraveliopsis 亲缘关系紧密;铁线莲属内具有散沟、散孔花粉类型的Sect. Naraveliopsis、Sect. Viticella、Sect. Tubulosa、Sect. Viorna (sensu Tamura 1995)为铁线莲属中的进化类群; Sect. Tubulosa 与Sect. Campanella 亲缘关系较远，而与Sect. Clematis 近缘。

陆地植物对环境变化的响应

陆地植物起源以后，地球上的环境发生了巨大的变化。大气CO2浓度自泥盆纪早期的2000-4OOOμml•mol_1下降至石炭一二叠纪的300μml•mol_1左右，02浓度在泥盆纪至石炭一二叠纪时期，由20-30μml•mol_1上升到70-80μml•mol_1，随后又下降到目前的水平。陆地植物登陆后，形态结构也发生了显著的改变，气生部分表而分化出了通气结构--气孔器和保护结构--角质层。泥盆纪首选标志植物刺镰蕨（Drelpanophycus spinaefrmis）在整个泥盆纪，广布全世界。刺镰蕨的气孔器类型一直存在两种观点，一种认为刺镰蕨的气孔器是平列型，即气孔器山两个保卫细胞和两个副卫细胞组成：另一观点认为刺镰蕨的气孔器为不规则型，即气孔器仅有两个保卫细胞构成，不具副卫细胞。我们借助于扫描电镜、石蜡制片技术和叶表皮离析法，细致地研究了现代石松（Lycopodium japonicum）叶的横切而、表皮及气孔器的内外表面结构，并同刺镰蕨的表皮和气孔器进行了对比。认为刺镰蕨的气孔器和所有的化石石松类及现代石松类的气孔器一样，均属于不规则型。从而解决了关于刺镰蕨气孔器类型的长期争论的关键性科学问题。 胡桃科青钱柳属植物起源于晚白垩世的环北太平洋沿岸，化石植物最早发现于北美古新世和早始新世的Motana,，Wyoming，North Dakota，north Colorado地区，欧亚地区仅出现在渐新世至上新世的Kazakhstan、Germany、Romnania、Russia、Japan、中国云南远谋和四川米易地区。我们将采于吉林省珲春组始新世的叶化石鉴定为一青钱柳相似种，该化石成为东亚地区出现最早的青钱柳属植物，这一发现也支持晚白垩至早第三纪时期环北太平洋两岸曾经相连的观点，青钱柳属在晚白垩由北美起源，在始新世经东亚向欧亚大陆扩散，由于环境变迁，第四纪以后，青钱柳属仪剩一种植物分布于中国的亚热带地区。文中还利用共存分析方法估测出始新世吉林省珲春地区属于暖温带至亚热带气候。 统万城遗址位于我国黄土高原向毛乌素沙漠过渡地带的北缘，属于暖温带森林草原向温带干草原、温带荒漠草原过渡的地区，同时又是东部季风区向西北干旱区过渡的生态环境敏感带。今天统万城地区的自然景观属于沙漠，仅存稀疏的次生灌丛和草本群落。但是，通过对统万城城墙内的孢粉和木材进行的综合研究表明，在约1600年前，当地为温带草原，在塬面或山丘上分布有侧柏林，沟谷、河岸边生长喜温湿的乔木，河流、湖泊、沼泽中水生植物繁盛，在丘间低洼处或盐碱土上分布有灌木和草本植物。当时该地区的年均温为7.8 ℃-9.3℃，最热月平均温度23.0℃-24.9℃，最冷月平均温度-12℃-5.6℃，年较差28.5℃-3 8.2℃，年降雨量403.4-550．Omm，最大月降雨量83.8-123.9mm，最少月降雨量4.4-12.2mm，当时气候比现在温暖湿润，年均温比现在高出0.2-0.7℃，年降雨量也高出60--lOOmm。而如此的历史景观今天已经向南迁移，侧柏林或森林草原退缩至延安以南地区。在此近1600年的时间里，毛乌素沙漠分布范围不断扩大，其南部边缘推进了约200 km，推测沙漠扩展的速率达到平均125m/a。

八角科植物系统学研究 — 比较木材解剖学及花被片表皮比较形态学

本文回顾了八角科（Illiciaceae）的分类历史，对其现状进行了介绍，并提出了存在的一些问题，针对这些问题，我们对八角科及其近缘类群 [五味子科（Schisandraceae）和木兰科（Magnoliaceae）] 的木材解剖特征，以及对组成八角目(Illiciales)的八角科和五味子科的花被片表皮形态进行了研究，进一步确定了八角科在离生心皮类中的原始地位，且为其属的次级划分提供了更多的性状支持，更详尽地阐述了它与近缘类群间的系统学关系，确定了八角目的独立地位。 １　比较木材解剖学 在光学显微镜和扫描电子显微镜下，对八角科八角属（Illicium）2组19种1亚种43个材料、五味子科2属4种7个材料和木兰科1属3种4个材料的木材解剖结构进行了比较研究。 因八角科导管单独、多角形、密集、细长且具螺纹加厚，穿孔板梯状且细密，射线异形等特征，本文支持建立单属的八角科。在八角属内，由于八角组（Sect. Illicium）的导管分子密度较高和直径较窄，易损度为0.090，射线较高，而八角茴香组（Sect. Cymbostemon）的导管分子密度较低和直径较宽，易损度为0.194，射线较矮，因而本文支持将八角属分为八角组和八角茴香组，且八角组比八角茴香组原始。根据欧式距离，八角科与五味子科之间的相似性（d=4.690）比八角科与木兰科（d=4.899）之间的相似性大，本文支持建立八角目（Illiciales）。 2　花被片表皮比较形态学 在光学显微镜和扫描电子显微镜下，观察了八角科八角属2组11种20个样品、五味子科南五味子属（Kadsura）2亚属2组8种15个样品和五味子属（Schisandra）2亚属4组6种17个样品的花被片表皮形态特征。 首次报道了八角目2个科（八角科和五味子科）3个属（八角属、南五味子属和五味子属）植物花被片表皮细胞的形状、分泌细胞的形状及分布、气孔器的形状及分布、花被片表面的纹饰，在五味子科中发现2个新的性状（气孔对和环列型气孔）。 通过与八角目2个科3个属植物的叶表皮形态比较，发现花被片表皮气孔器外拱盖均为单层，与叶表皮气孔器外拱盖层数（常绿种类为双层和落叶种类为单层）之间没有相关性。通过对两性花、雌花和雄花花被片表皮观察，发现花被片表皮形态与花的性别之间没有相关性。通过对八角属、南五味子属和五味子属花被片表皮比较，发现五味子属花被片表皮形态比南五味子属花被片表皮形态表现出更多的衍生性状，南五味子属花被片表皮形态比八角属花被片表皮形态表现出更多的衍生性状;南五味子属花被片表皮形态与五味子属花被片表皮形态之间的相似性程度较大，与八角属花被片表皮形态之间的相似性程度较小，支持建立含南五味子属和五味子属的五味子科，支持建立只含八角属的八角科。

钻地风属和冠盖藤属（虎耳草科）的分类学修订

钻地风属（Schizophragma Siebold & Zucc.）和冠盖藤属（Pileostegia Hook. f. & Thomson）隶属于虎耳草科绣球花亚科绣球花族植物，分布于东亚。本论文对钻地风属和冠盖藤属进行了全面的分类学研究：重点分析了钻地风属和冠盖藤属各形态性状的变异式样，确定了二属的性状变异范围;在光学显微镜下，对钻地风属中6种5变种和冠盖藤属中2种共130份材料的叶表皮特征进行了深入、全面的观察和研究;并对二属的叶脉序特征进行了研究。结果显示，苞片存在与否、不育花存在与否、花瓣顶端是否联合、蒴果和种子的形状、叶片质地、生长习性、表皮细胞垂周壁加厚与否、气孔器分布、类型、气孔大小、保卫细胞轮廓、外拱盖是否双层、二级脉、三级脉、高级脉及网眼等特征在属的水平上具有重要的分类学意义，这些性状特征支持将钻地风属和冠盖藤属作为两个独立的属处理。根据形态性状及叶脉序特征推测，冠盖藤属较原始，钻地风属较进化。在钻地风属中，叶片毛被的有无及类型、叶片形状和叶缘的形状等特征可作为可靠的分种依据;叶表皮特征在种及种下等级具有重要的分类学意义;叶脉序多呈现环节曲行羽状脉式样，二级脉具分枝，在种间存在细微差别。根据形态性状及叶脉序特征推测，厚叶钻地风S. crassum Hand.-Mazz.和白背钻地风S. hypoglaucum Rehder可能为钻地风属中较原始的类群，秦榛钻地风S. corylifolium Chun和绣球钻地风S. hydrangeoides Siebold & Zucc.可能较进化。在冠盖藤属中，叶片毛被的有无及类型、叶片形状等特征可作为可靠的分种依据;该属中叶表皮特征相似，2个种间叶表皮特征无差异;叶脉序多呈现环节曲行羽状脉式样，二级脉无分枝，在种间差异极小。 作者在研究了近2000份腊叶标本的基础上，结合叶表皮特征和叶脉序特征，认为钻地风属和冠盖藤属为两个独立的属。首次对钻地风属和冠盖藤属进行了世界性的分类学修订，确认钻地风属含7个种、5个变种，冠盖藤属含2个种。对钻地风属中的5个名称和冠盖藤属中的2个名称进行了归并;为钻地风属中的1个名称和冠盖藤属中的2个名称指定了后选模式;发现被命名为维西钻地风S. crassum Hand.-Mazz. var. hsitaoianum (Chun) C. F. Wei的类群其正确名称为S. crassum Hand.-Mazz. var. ellipticum J. Anthony;恢复了变种小粉绿钻地风S. integrifolium Oliv. var. minus Rehder;重新界定了白背钻地风和小粉绿钻地风的变异范围，澄清了中国文献中记载的粉绿钻地风S. integrifolium Oliv. var. glaucescens Rehder长期存在的名实混乱问题。本论文对各个分类群进行了详细的形态描述，给出了分种检索表，并附分布资料及地理分布图。

海南野生兰科植物保育生物学研究

兰科(Orchidaceae)是高等植物中第二大科，包括石斛属在内的许多种类均具有较高的观赏价值和独特的药用价值。过度采挖和商业利用及原生境丧失致使野生兰科植物资源受到了毁灭性的破坏，许多兰科植物种类日趋濒危。本研究以海南岛野生兰科植物为对象，从生物多样性、群落生态学、菌根体系的建立和重引入实施工程等方面开展工作，研究结果如下： 1）报道了中国兰科植物2个新种，1个中国新记录属，6个中国新记录种及11个海南新记录种。其中，2个新种为长筒天麻Gastrodia longitubularis和芳香白点兰Thrixspermum odoratum；1个中国新记录属为小囊兰属Micropera；6个中国新记录种，分别为疏花羊耳蒜Liparis sparsiflora、三色槌柱兰Malleola insectifera.、红花小囊兰Micropera poilanei、美丽云叶兰Nephelaphyllum pulchrum、腐生齿唇兰Odontochilus saprophyticu和白花曲唇兰Panisea albiflora；11个海南新记录种，分别为密花石豆兰Bulbophyllum odoratissimum、金唇兰Chrysoglossum ornatum、勐海隔距兰Cleisostoma menghaiense、束花石斛Dendrobium chrysanthum、无叶美冠兰Eulophia zollingeri、滇南翻唇兰Hetaeria rubens、心叶球柄兰Mischobulbum cordifolium、毛叶芋兰Nerviliaplicata、平卧曲唇兰Panisea cavalerei、云南曲唇兰Panisea yunnanensisi及台湾白点兰Thrixspermum formosanum。 2）海南琼北火山岩地区调查结果表明，该区有兰科植物10属14种，成斑块状分布；其区系成分单一，生活型不全面；附主植物种类多样，人工种植的经济作物为该地区兰科植物的主要附生宿主。生境特征分析结果显示，琼北火山岩地区独特的地质气候条件及植被类型是影响该地区兰科植物种类数量的主要因素。人工干扰所致的植被破坏、生境破碎化是该地区兰科植物多样性丧失的主导因素。 3）以我国兰科海南特有种-华石斛（Dendrobium sinense TangetWang）为研究对象，采用双向指示种分析法（TWINSPAN）和除趋势对应分析法（DCA）对海南霸王岭国家级自然保护区华石斛附生群落进行了分类和排序。结果表明：TWINSPAN分类结果将22个样方划分为2个植被类型、5个群系、7个群丛组；并分别对各群丛组的生境特点、植被树种组成作了论述。DCA二维排序图较好地验证了TWINSPAN的分类结果，并客观地反映了群落的生境特征。随着海拔逐渐升高，华石斛附生群落植被类型从山地常绿林逐渐过渡到高山苔藓矮林，群落中的优势种由喜高温耐干旱的热带、亚热带树种逐渐演变为耐低温喜湿的亚热带、温带树种。华石斛在主要群落类型群系间、群丛组内的数量、密度和空间分布格局表现出较大差异，以具通风、凉爽和高湿环境的高山苔藓矮林附生数量最多。附生群落类型的多样性反映了华石斛对多样生境的适应性。华石斛附生群落植被类型群丛组的划分，进一步细化和丰富了海南热带森林植被类型山地常绿林和高山矮林的划分，有助于了解华石斛自然居群的生境特点，为进一步开展华石斛的保育工作提供了科学依据。 4）兰科菌根菌对兰花种子萌发和原球茎生长起了重要作用，在成年阶段也扮演着重要角色。为了解东南亚特有种五唇兰的菌根形态和菌根真菌的动态侵染过程，对不同生境下两种变异类型（叶背绿色和叶背紫色）的成年植株菌根分三个时间段采样并进行显微观察。结果表明，成年的五唇兰植株与菌根真菌有着密切关系，菌丝的侵染、定殖和消解程度随着生长发育变化而变化；在营养生长阶段和生殖生长阶段都发现菌丝结，这两个阶段的菌丝特征有所不同；而在休眠阶段的菌根中观察不到菌丝结；不同生境和不同变异类型的菌根结构无明显区别。 5)利用种子原地共生萌发技术，通过种子预处理及播种等技术的不断完善，获得了大量种子萌发原球茎；初步揭示了华石斛种子萌发原球茎规律。结果表明：10%NaOH浸泡10min预处理能显著提高华石斛种子萌发率；原生境人工播种明显提高了萌发的原球茎数及宿主原球茎产生率；但不同附生宿主间存在差异，自然萌发原球茎数非常低。播种后2.5个月左右种子开始萌发，4.5个月左右达到高峰，在6.5个月原球茎数基本趋于稳定。 6)华石斛菌根化苗重引入实验结果表明，实验室筛选的有益真菌与原生境下筛选有益真菌存在一定差异。菌根化苗重引入野外生境，3个月后以12号华石斛菌根化苗生长最好，3、9号华石斛菌根化苗生长较正常，而7、10号两种华石斛菌根化苗叶片受损或死亡，无菌组培苗基本已死亡；华石斛菌根化苗成活率在50%以上，而对照几乎全部死亡；从菌根化苗长势评价，3、9、12号3个内生真菌华石斛菌根化苗生长较好，为真正有益共生真菌。

喜树、蓝果树和珙桐的比较胚胎学特征及其亲缘关系

摘要 喜树的花芽形成于五月初，七月开花．雄蕊花药具4孢子襄。药壁一般具5层细胞．表皮一层，宿存。药室内壁一层，具纤维加厚。中层二层。绒毡层一层，分泌型，细胞具二核．绒毡层膜位于外平周壁。在小孢子四分体后期绒毡层细胞分泌球形 的乌氏体，小孢子母细胞减数分裂的胞质分裂为同时型，通过缢缩方式形成四个小孢子。小孢子四分体为四面体型。散粉时孢子囊各自开裂而不两两汇合，花药裂缝螺旋形。花粉2细胞，赤道面具3个孔沟型的萌发孔，外壁具多孔的复盖层。雌雄蕊异熟，虫媒传粉。胚珠倒生，悬垂，具由引孽组织形成的珠孔塞，珠被堕层，珠孔周围的珠被组织细胞申含淀粉粒，珠脊维管束止予合点，具珠被绒毡层，珠被绒毡层分布在从卵器到合点的区段，珠被绒毡层细胞单核。珠孔受精，从传粉到受精的间隔在l天左右。珠心冠大多存在，具承珠盘。珠心为假厚珠心，具单个孢原细胞。胚囊发育为蓼型。线形排列的大孢子四分体中无功能大孢子退化次序是从珠孔端向合点端依次进行。珠孔端第三大孢子至少具一次核分裂能力。成熟胚囊具7细胞，两个助细胞在受精时宿存，反足细胞单核，两个极核在受精前融合，三核并合后核仁不融合成—大核仁。精卵核融合为有丝分裂前型。胚乳发育为细胞型。初生胚乳核分裂前细胞中形成显著的成膜原体。初生胚乳核最初的三次分裂为横裂。胚胎发育为柳叶菜型成熟种子具胚乳，胚直，几与种子等长，子叶披针形，种皮薄，由珠被最外的2 ~ 3层细胞形成。胚与胚乳均含丰富的喹啉类生物碱：喜树碱。 中国蓝果树的花芽形成千早春三月，五月初开花。花下具关节。雄蕊花药具4孢子囊，药壁一般具5～7层细胞。表皮一层，宿存。药室内壁一层，具纤维加厚。中层2—4层．绒毡层一层，分泌型，细胞具2至多核，核可融合成多倍体核，或经核内有丝分裂形成多倍体核，核仁大而显著。小孢子母细胞减数分裂的胞质分裂为同时型。小孢子四分体为四面体型，少数为十字形。散粉时孢子囊两两汇合，花药纵缝开裂。胚珠倒生，悬垂。具由引导组织形成的珠孔塞。珠被单层，珠脊维管束到合点后继续延伸进入珠被，呈“U”字形，具珠被绒毡层，珠被绒毯层细胞单核。珠孔受精。珠心冠大多不存在。承珠盘不存在。珠心为假厚珠心，具单个孢原细胞。胚囊发育为蓼型和葱型。胚囊发育为蓼型和葱型。线形排列的大孢子四分体中无功能大孢子退化次序通常是从合点端向珠孔端依次进行。成熟胚囊具7细胞，两助细胞在受精时宿存，反足细胞单核，两个极核在受精时融合。三核并合后核仁融合成—大核仁。精卵核融合为有丝分裂前型。胚乳发育为细胞型，初生胚乳核最初的四次分裂方向为横，纵，横，横。成熟种子具胚乳，胚直，几与种子等长，子叶椭圆状卵形至卵形，基部浅心形至心形，种皮薄，由5-11层压扁的细胞组成。胚与胚乳均不具喜树碱。 珙桐的花芽形成于夏末，来年春末开花。雄蕊花药具4孢子囊，药壁—般具5 层细胞。表皮一层，宿存。药室内壁一层，具纤维加厚。中层2层。 绒毡层一层．分泌型，细胞具--核0造孢细胞越冬。小孢子母细胞来年春天减数分裂。减数分裂的胞质分裂为同时型。小孢子四分体为四面体型，少数为十字型。散粉时孢子囊两两汇合，花药纵缝开裂。花粉具2细胞。胚珠倒生．悬垂，具由引导组织形成的珠孔塞。珠被单层．珠脊维管束网状分技进入珠被．具珠被绒毡层，珠被绒毡层细胞单核。珠孔受精。珠心具多孢原．珠心冠大多存在。成熟胚囊具7细胞．两助细胞受精时宿存．反足细胞多核，核融合成多倍体核．两极棱在受精时融合。精卵核融合为有丝分裂前型。胚乳发育为游离核型。 鑑于上述现象，本文作者得到以下几点认识． 1．赞同Takhta jan将珙桐属从蓝果树科中分出，珙桐属特有的胚胎学特征有：1)生殖周期长．2)珠被具网状分枝的维管束．3）反足细胞具多倍体棱，4）胚珠具多细胞孢原。
2．蓝果树属与八角枫科有着较与喜树属更为密切的亲缘，即恩格勒系统的篮果树科并不十分自然。蓝果树属与八角枫科共有的重要特证有;花序腋生，花下具关节，花药基着，散粉时孢予囊两两贯通，纵缝开裂．珠被维管束“U”字形，极核在受精时融合，胚乳胞型和游离核型，核果，胚子叶基部。喜棚在许多方面与蓝果树属不同，其中有些特征在山茱萸目中是唯一的。这些特征表现在．花序顶生，花药顶着．药隔突出，散粉时孢子囊各自开裂而不两两贯通，裂缝螺旋形，大孢子四分体中无功能的三个大孢子退化次序通常是从珠孔端向合点端依次进行，第三大孢子发育成双棱雌配子体．珠孔周围珠被组织细胞中具淀粉粒，极核在受精前融合．三核并合后核仁不融合成—大核仁，胚乳细胞型．初生-乳核最初的三次分裂为横裂翅果，胚子叶基部禊形，胚及胚乳具喹啉类生物碱t喜树碱。鑑于上述特征，作者倾向子将仅含蓝果树属的蓝果树科置于八角枫科附近，而将喜树属从蓝果树科中分出并单独成为山茱萸目中的一科。
3.蓝果树属植物虽为东亚一北美间断分布，但在胚胎学上东亚和北美的种具有连续一致的特征。

植物血红蛋白基因及植物凝集素基因转化水稻的研究

植物血红蛋白在共生固氮根瘤中主要是对固氮酶进行嫌氧保护，确保固氮酶活性，在植物根中协助氧的运输或作为感觉氧压的信号分子．豆科植物凝集素功能之一是对相应专一的根瘤菌有识别作用，并有利于根瘤菌的聚集和侵染。本论文将非豆科结瘤植物Parasponia andersonii血红蛋白基因及豌豆凝集索基因转入水稻，目的是此二基因表达后，豌豆凝集素可聚集、识别豌豆根瘤菌，并有助于它们的侵染，血红蛋白则可对根瘤菌固氮酶进行嫌氧保护，保障其发挥固氮作用，从而为实现水稻结瘤和固氮打下初步基础。 本论文将带有Parasponia血红蛋白基因的pL305质粒，带有潮霉素磷酸转移酶基因及Parasponia血红蛋白基因的农杆菌双元载体质粒pLX412-Hb用花粉管通道法转化水稻l用pLX412-Hb和带有Bar基因、豌豆凝集素基因、Parasponia血红蛋白基因的质粒pLHB用基因枪法转化水稻幼胚及愈伤组织，带有pLX412-Hb的Agrobactmum tumefaciens LBA4404转化烟草，得到如下结果： 1．用pL305质粒花粉管通道法转化水稻，运作1512朵花，得到707粒种子．将230粒种子萌发，发芽220粒;白化苗4株，成苗206株;计发芽率96%，白化苗率1.7%，成苗率90%。取120株提取DNA以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有6株为阳性结果，阳性率5%．再取4株DNA点杂交阳性植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southem杂交，有3株有阳性结果，阳性率为75%，照此推算转化植株约占总植株的4%．目前，这些转基因植株已开花结实。 2．用pLX412-Hb质粒花粉管通道法转化水稻，运作743朵花，得到340粒种子。将120粒种子萌发，发芽117粒，白化苗3株，成苗111株;计发芽率97. 5%，白化苗率2. 5%，成苗率92. 5%．取30株提取DNA以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有4株为阳性结果，阳性率13%。再取4株DNA点杂交呈阳性的植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，有2株有阳性结果，阳性率为50%，照此推算转化植株约占总植株的7%。目前部分转基因植株巳开花结实． 3.用pLX412 - Hb质粒基因枪法转化水稻幼胚及愈伤组织，抗性筛选得到15株再生植株，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有14株为阳性结果，阳性率93%．取7株DNA点杂交呈阳性的植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，都为阳性结果，阳性率为100%，照此推算转化植株约占总植株的93%．目前，部分转基因植株已开花结实． 4．用pLX412 -Hb质粒通过Agrobacterrum tumeFaciens LBA4404转化烟草，抗性筛选得到的再生植株以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，结果为阳性． 5．用pLHB基因枪法转化的愈伤组织，抗性筛选得到已分化出绿芽点的愈伤组织，以Parasponia血红蛋白基因为探针或以豌豆凝集素基因为探针进行Southern杂交，杂交结果均为阳性． 6．最近国外巳发现大麦有血红蛋白基因．本论文以大麦血红蛋白cDNA为探针对未转基因的水稻进行Southern杂交，结果有阳性带。说明水稻有与大麦血红蛋白基因高度同源序列。以Parasponia血红蛋白基因为探针时杂交结果为阴性，说明水稻血红蛋白基因与Parasponiaa血红蛋白基因核苷酸序列相差较大． 7．提取Southern杂交证明有Parasponia血红蛋白基因整合的水稻根及叶总RNA，以Parasponia血红蛋白基因cDNA为探针进行RNA点杂交，结果根总RNA为阳性，叶总RNA为阴性。初步证明Parasponia血红蛋白基因在水稻根中表达。 8．提取未转基因的水稻根及叶RNA，以大麦血红蛋白基因cDNA为探针进行RNA点杂交，结果：根总RNA为阳性结果，叶总RNA为阴性结果．初步证明水稻血红蛋白基因在水稻根中表达。 总之，本论文证明已将Parasponia血红蛋白基因整合进水稻植株染色体，将豌豆凝集素基因、Parasponia血红蛋白基因整合进水稻愈伤组织染色体，初步证明水稻有血红蛋白基因，内外源血红蛋白基因都有组织特异性表达，从而为本研究的战略设想奠定初步基础。

组织培养产生小麦族属间易位和其它染色体变异的分子细胞遗传学分析

组织培养能够诱导染色体断裂和重接进而产生染色体易位的观点已被广泛认识。大量的研究注意到了组织培养产生的核型不稳定性，其中大多数研究的对象是栽培作物及其属间或种间杂种幼胚和幼穗再生植株。借助于减数分裂分析、染色体分带和其它检测技术，在再生植株中发现了包括易位在内的许多染色体变异。可以相信，除了传统的同源和部分同源染色体配对时的自发易位和辐射诱变等方法以外，远缘杂种组织培养有可能作为产生染色体易位的又一种选择。尽管如此，至今还没有取得培养细胞中染色体易位的直接证据。本研究以普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种为材料，研究了组织培养过程中离体细胞的染色体变异，用基因组原位杂交技术（GISH）证实组织培养诱导小麦染色体与簇毛麦染色体发生易位。同时，研究了小麦×黑麦杂种培养细胞中的染色体变异和黑麦B-染色体的变化。利用组织培养技术获得了小麦-黑麦和小麦-长穗偃麦草代换系和附加系。 1 普通小麦比较容易与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1和TH_1W杂交，所选的9个普通小麦品种或品系与TH_1和TH_1W配制的19个杂交组合，平均结实率为46.7%，共计获得19个杂交组合2316粒杂种种子。正反交结果表明，以普通小麦为母本的杂交结实率高于反交结实率。在继代培养过程中，杂种幼胚愈伤组织生长迅速，甚至直接诱导出绿苗，共获得不同杂交组合2005株再生植株。 2 普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织发生了比较大范围的染色体数目和结构变异。在检查的中国春×TH_1W、TH_1W×84加7911515、TH_1×84加7911515、TH_1W×91E27、鲁资357×TH_1W等5个杂种组合的1730个愈伤组织细胞中，平均有19.1%的细胞发生了染色体数目变异，不同杂交组合变化在12.7%（中国春×TH_1W）至30.7%（TH_1×84加7911515），其中，以染色体数目减少的变异为主，数目增加的变异比较少。杂种愈伤组织平均有6.3%的细胞发生了染色体断裂，产生染色体断片、环状染色体、端着丝点染色体和缺失染色体。断裂的染色体可能重新融合在一起，形成双着丝点染色体。 3 培养时间影响普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体和普通小麦×黑麦杂种愈伤组织细胞中的染色体数目和结构变异。在一定时间里，随着培养时间的延长，未发生核型变异的细胞逐渐减少，发生变异的细胞逐渐增多，主要表现在染色体数目减少的细胞增多，而染色体数目增加的细胞有减少的趋势。在长时间培养（190日龄）的愈伤组织中染色体加倍的细胞消失了，表明长时间培养对高倍性的细胞具有不利的选择，使这类细胞难以在长期继代培养中生存下去。愈伤组织在第一次继代培养时就发现有核型变异，说明染色体变异在愈伤组织培养初期就可以发生。 4 以簇毛麦总基因组DNA为探针，采用荧光原位杂交技术在普通小麦×硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种愈伤组织细胞中发现小麦染色体与簇毛麦染色体发性易位，这一结果是组织培养诱导培养细胞中属间染色体易位的第一个直观的证据。易位的染色体既有臂间易位，也有小片段易位。易位的染色体不仅可以在愈伤组织细胞中存在，也能够在再生植株中表达。在64株中国春×TH_1W和NPFP×TH_1再生植株中，观察到了3个易位株，其中1个易位株是一个小麦染色体与一个簇毛麦染色体发生了相互易位，易位的簇毛麦染色体片段比较小，大约为簇毛麦染色体臂的1/2，而易位的小麦染色体大约是臂长的1/3，另外2个易位株染色体断点位于或靠近着丝点。本研究的结果再次证实了利用组织培养能够创造小麦与外源染色体之间发生易位。 5 ~(60)Co γ-射线辐射处理对于普通小麦中国春与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH_1W杂种愈伤组织细胞的染色体变异有很大的影响。表现在未发生变异的细胞大大减少，发生染色体数目变异的细胞急剧增加，主要是染色体数目减少的变异提高了21.3%，相反染色体增加的变异不但没有增加，而且还有所减少。经过辐射处理的愈伤组织细胞染色体结构变异也有大幅度增加，变异频率提高，变异类型增加。发生染色体断裂和重接形成双着丝点染色体的细胞频率达到22.3%，比对照提高13.9%。辐射诱变对培养细胞中簇毛麦染色体变异发生明显的影响。与此同时，簇毛麦染色体与小麦染色体易位频率比对照提高了近2倍。观察结果还表明愈伤组织辐射处理比延长培养时间诱导染色体变异的效果更好。 6 尽管愈伤组织中发生的染色体变异在再生植株中多有发现，但是，只有比较小范围染色体变异的愈伤组织细胞具有再生能力形成再生植株，那些发生剧烈变异的细胞通常不具有再生能力，因而不能在再生植株中得到表达。普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂种大多数再生植株染色体数目与供体杂种保持一致，只有少数植株发生染色体数目变异。显然，发生较大染色体变异的愈伤组织细胞在增殖和分化过程中处于不利的地位，逐渐被淘汰。 7 在普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦与黑麦杂种愈伤组织中，观察到相当高频率的染色体加倍细胞，为利用组织培养创造双二倍体提供了一种可能。但是，加倍的细胞只是培养初期的愈伤组织中出现，经过一段时间的培养，这种细胞大多消失了。而且，大多数再生植株染色体数目未发生加倍，其中并没有出现期望的双二倍体植株。表明加倍了的细胞在愈伤组织生长和分化过程中大范围变异的细胞一样受到不利的选择，再生能力比较差。因此，利用组织培养创造双二倍体需要更大的努力。 8 一些黑麦品种含有数目不等的B-染色体。B-染色体的多少对普通小麦与黑麦的杂交结实率有比较大的影响，数目越多，杂交结实率越低。在培养初期的愈伤组织细胞中，B-染色体的频率很高，例如69%的中国春×芬7416杂种的40日龄愈伤组织细胞中含有数目不等的B-染色体。常染色体的倍性影响B-染色体的分布，染色体数目加倍的双二倍体细胞中含多数B-染色体的细胞频率大大高于单倍体细胞。经过一段时间的培养之后，绝大多数B-染色体都不存在了，只有极少数细胞含有1个B-染色体。可能的原因是离体培养过程对B-染色体产生了不利的选择。 9 利用组织培养技术，从普通小麦与八倍体小黑麦杂种幼胚再生植株自交后代中选育出2个异代换系，从4D缺体小麦×八倍体小黑麦再生植株回交后代中选育出1个附加系。荧光原位杂交、C-分带和种子贮藏蛋白分析证明这两个代换系1D/1R代换，附加的也是1R染色体。从4D缺体小麦与八倍体小偃麦杂种再生植株自交和回交后代中选育出5个代换系和2个附加系。染色体配对和RAPD分析证实了长穗偃麦草染色质的存在。其中一些小麦-长穗偃麦草代换系和附加系对叶锈病免疫或高抗，对条锈病的一些生理小种和白粉病具有比较高的抗性。而且，附加系924和代换系807蛋白质含量分别达到19.32%和18.83%。 10 当普通小麦鲁资357与硬粒小麦-簇毛麦双二倍体杂交时，无论是实生苗还是再生植株都发生杂种致死现象。细胞学观察没有发现植株染色体发生变异，荧光原位杂交表明簇毛麦染色也没有发生可见的变异。推测这种杂种致死现象是由于鲁资357和硬粒小麦81086A（TH_1和TH_1W的硬粒小麦亲本）中可能分别带有互补的杂种致死基因所致。

棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆

系统获得性抗性(Systematic acquired resistance, SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后，植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快，因此植物的抗病性得以增强，与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性，许多学者称之为广谱抗病基因工程，该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿。 NDR1和NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用，前者功能定位在ROS(reactive oxygen species)的激活和随后的水杨酸(SA)诱导合成之间，突变株病原菌诱导后SA合成能力降低，SAR发生减弱，目前还没有对该基因进行过量表达分析的报道;后者功能定位在SAR信号转导级联反应之中的SA积累和随后的SAR基因表达之间。该突变株在病原菌侵染时不产生病程相关蛋白(PRs)，表现为感病，而对照抗病;过量表达该基因的转基因拟南芥对多种病原菌的侵染产生抗性，PR1等PRs蛋白的表达量也提高，异源表达该基因的水稻对白叶枯病的抗性也提高。本研究利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆了这两种基因，序列分析表明拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因与Columbia生态型相比，共有7处碱基不同，引起编码氨基酸变化4处，而NPR1基因与报道的Wassilewskija生态型来源的NPR1基因完全相同。 我们构建了35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型高效表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern鉴定外源基因已经整合到植物基因组中。抗病性分析显示过量表达NDR1和NPR1基因的烟草对晚疫病和赤星病的抗性都有明显提高，说明这两个基因的在其它植物中异源表达后，都能提高植物对多种病原菌的抗性。 本论文提出了利用这两个基因来培育抗黄萎病棉花的设想，一方面为解决这个“世纪性”难题积累新的资料，另一方面也为其它作物的抗病基因工程提供新的经验。利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型表达载体分别对陆地棉品种石远321进行花粉管通道法转化。同时，还探讨了这两个基因在棉花中的共转化实验，希望它们的“协同增效”能进一步提高棉花的抗病性。对其中2001年夏天在南京注射所获得的5,000粒种子在三亚进行100 g/ml卡那霉素筛选，初步鉴定分别获得转NDR1和NPR1基因株系26和24棵，PCR进一步鉴定其中分别有12和7棵为转基因阳性，转基因频率分别为0.50％和0.27％，目前利用营养钵蘸根法对其二代进行抗枯、黄萎病鉴定，结果显示有转基因植株对枯、黄萎病的抗性都明显增强，进一步的鉴定正在进行中。2002年初海南注射分别获得转NDR1和NPR1基因以及共转化种子22,000、10,500和12,500粒种子，2002年夏在中国农科院植保所黄萎菌病圃筛选抗黄萎病单株，并利用100 g/ml卡那霉素初步筛选出了一批抗性植株，每种转基因株系随机挑选5株进行PCR鉴定，结果显示为阳性。进一步的抗黄萎病鉴定和筛选以及分子分析正在进行中。 同时，本文还探讨了病原菌诱导型启动子在广谱抗病基因工程应用的可能性。根据烟草的Pr1-a启动子已知序列设计引物，PCR扩增启动子序列后,构建病原菌诱导型NPR1基因植物表达载体，并对棉花进行转化，获得种子11,500粒，利用同上的筛选方法，获得了一致的结果，目前抗黄萎病鉴定、分子检测以及生物学分析正在进行中。 最后，鉴于抗生素标记在转基因植物的应用引起了许多“安全性”争论的事实，还构建了无筛选标记的表达载体对抗虫棉进行转化，这样在生产上可以直接获得抗虫棉抗黄萎病棉花新材料，也为其它作物抗病基因工程积累经验。 本研究还提出了一种较为有效的提取高质量棉花总RNA的方法，与原来一些棉花RNA纯化方法相比，该方法所用都为常规试剂，易于重复，质量高。并且利用获得的总RNA构建了黄萎菌激发子诱导的cDNA文库，滴度测定为1╳107pfμ/μg，插入片段大小在5 00~2 000 bp范围内。 鉴于NPR1基因研究的重要性，本研究还利用简并引物PCR技术从海岛棉和陆地棉的基因组中都分离到了NPR1基因的同源片段，大小都为208 bp，与拟南芥NPR1基因的相应部分的同源性分别为66％和65％，它们之间的同源性为87％，目前该基因的全长正在分离鉴定中。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的防御反应中起着重要的作用，通过分析已知20余种pgip基因序列的保守区，设计简并引物，PCR扩增海岛棉（Gossypium barbadense）7124 cDNA文库，得到一条长561 bp的片段，序列测定后分析确认为pgip基因的一部分。根据此序列和棉花病原菌诱导的cDNA文库载体中已知部分设计RACE引物，扩增后，5’和3’RACE分别得到666bp和906 bp的片段。序列分析表明它具有完整的编码框，产物为330 aa的蛋白质。序列分析该蛋白具有10个串联的LRR(leucine-rich repeat)区，与柑桔(Citrus)和枳(Poncirus)的pgip基因的同源性分别为69.2%和68.7%。进一步PCR扩增得到该基因的全长阅读框，并且获得了相应的基因组片段，序列分析发现该基因没有内含子。这是从棉属植物中克隆的第一个pgip基因。