Characterization of proteolytic bacteria from the Aleutian deep-sea and their proteases

Six deep-sea proteolytic bacteria taken from Aleutian margin sediments were screened; one of them produced a cold-adapted neutral halophilic protease. These bacteria belong to Pseudoalteromonas spp., which were identified by the 16S rDNA sequence. Of the six proteases produced, two were neutral cold-adapted proteases that showed their optimal activity at pH 7-8 and at temperature close to 35 degrees C, and the other four were alkaline proteases that showed their optimal activity at pH 9 and at temperature of 40-45 degrees C. The neutral cold-adapted protease E1 showed its optimal activity at a sodium chloride concentration of 2 M, whereas the activity of the other five proteases decreased at elevated sodium chloride concentrations. Protease E1 was purified to electrophoretic homogeneity and its molecular mass was 34 kDa, as estimated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The molecular weight of protease E1 was determined to be 32,411 Da by mass spectrometric analysis. Phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF) did not inhibit the activity of this protease, whereas it was partially inhibited by ethylenediaminetetra-acetic acid sodium salt (EDTA-Na). De novo amino acid sequencing proved protease E1 to be a novel protein.

Expression, purification, and characterization of recombinant Chinese shrimp crustin-like protein (CruFc) in Pichia pastoris

A crustin-like protein (CruFc) from Fenneropenaeus chinensis was expressed in Pichia pastoris and then purified to electrophoretic homogeneity on a Sephacryl S-100 column with a band corresponding to the expected one (13 kDa) shown by 15% SDS-PAGE. Western blot indicated that the rCruFc specifically reacted with polyclonal rabbit anti-Fenneropenaeus chinensis CruFc. Production in a 5 l bioreactor gave 237 mg rCruFc/l. Antimicrobial assay revealed that 4 mu M rCruFc inhibited growth of Staphylococcus aureus.

A novel polypeptide from shark cartilage with potent anti-angiogenic activity

Using guanidine-HCl extraction, acetone precipitation, ultra-filtration and chromatography, a novel polypeptide with potent anti-angiogenic activity was purified from cartilage of the shark, Prionace glauca. N-terminal amino acid sequence analysis and SDS-PAGE revealed that the substance is a novel polypeptide with MW 15500 (PG155). The anti-angiogenic effects of PG155 were evaluated using zebrafish embryos model in vivo. Treatment of the embryos with 20 mu g/ml PG155 resulted in a significant reduction in the growth of subintestinal vessels (SIVs). A higher dose resulted in almost complete inhibition of SIV growth, as observed by endogenous alkaline phosphatase (EAP) staining assay. An in vitro transwell experiment revealed that the polypeptide inhibited vascular endothelial growth factor (VEGF) induced migration and tubulogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Exposure of HUVECs in 20 mu g/ml PG155 significantly decreased the density of migrated cells. Almost complete inhibition of cell migration was found when HUVECs were treated with 40-80 mu g/ml PG155. PG155 (20 mu g/ml) markedly inhibited the tube formation of HUVECs and a dose-dependent effect was also found when treatment of HUVECs with PG155 at the concentration from 20 to 160 mu g/ml.

Isolation and characterization of the oxygen-evolving photosystem II complex from the economical red alga Bangia fusco-purpurea

The highly pure and active photosystem II (PSII) complex was isolated from Bangia fusco-purpurea (Dillw) Lyngb., an important economic red alga in China, through two steps of sucrose density gradient ultracentrifugation and characterized by the room absorption and fluorescence emission spectra, DCIP (2,6-dichloroindophenol) reduction, and oxygen evolution rates. The PSII complex from B. fusco-purpurea had the characteristic absorption peaks of chlorophyll (Chl) a (436 and 676 nm) and typical fluorescence emission peak at 685 nm (Ex = 436 nm). Moreover, the acquired PSII complex displayed high oxygen evolution (139 mu mol O-2/(mg Chl h) in the presence of 2.5 mM 2,6-dimethybenzoqinone as an artificial acceptor and was active in photoreduction of DCIP (2,6-dichloroindophenol) by DPC (1,5-diphenylcarbazide) at 163 U/(mg Chl a h). SDS-PAGE also suggested that the purified PSII complex contained four intrinsic proteins (D1, D2, CP43, and CP47) and four extrinsic proteins (33-kD protein, 20-kD protein, cyt c-550, and 14-kD protein).

Method for large-scale isolation and purification of R-phycoerythrin from red alga Polysiphonia urceolata Grev

R-phycoerythrin was isolated and purified from a red alga, Polysiphonia urceolata Grev, using Streamline column combined with ion-exchange chromatography or hydroxyapatite chromatography. The purity of R-phycoerythrin isolated by Streamline column was up to 1.66 and the yield of R-phycoerythrin could be as high as 0.68 mg/g frozen P. urceolata. All the eluates from Streamline column were divided into two equivalent parts, respectively. One part was pumped into the ion-exchange column loaded with Q-Sepharose and the other was applied to the adsorption column loaded with hydroxyapatite. The purities of R-phycoerythrin purified using these two methods were both up to 3.26, more than 3.2 the commonly accepted criterion. The yield of purified R-phycoerythrin from the ion-exchange chromatography was 0.40 mg/g frozen P. urceolata and that from the hydroxyapatite chromatography could reach 0.34 mg/g frozen P. urceolata. The purified protein had three absorption peaks at 498, 535, and 565 nm and displayed a fluorescence maximum at 580 nm, which was consistent with the typical spectrum of R-phycoerythrin. The purified R-PE was also identified with electrophoresis. Only one single protein band appeared on native-PAGE with silver staining. SDS-PAGE demonstrated the presence of one 20 kDa major subunit, and one low intensity band corresponding to 33 kDa subunit. The results indicate that using the expanded bed adsorption combined with ion-exchange chromatography or hydroxyapatite chromatography, R-phycoerythrin can be purified from frozen P. urceolata on large scale. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

扇贝裙多肽的制备与分析

海洋生物是新型的肽类次级代谢物的丰富来源，现已从多种生物中发现一系列高活性的抗肿瘤、抗病毒、抗微生物及心血管疾病的活性多肽。以栉孔扇贝裙为原料，利用酶解的方法制备肽混合物，对其进行分离分析，获得高附加值的混合肽制品。通过一系列酶反应动力学研究，进行最佳用酶及其酶解最佳条件的选择。酶解条件为：酶浓度2500单位/每克样品，酶解温度45 ℃， 使用537酸性蛋白酶和1398中性蛋白酶先后于pH3和pH7左右作用共计5个小时。对所得胨肽混合物进行超滤，分级纯化，选择分子量介于600与4000道尔顿之间的混合肽，测定其氨基酸的组成，含有18种氨基酸，其中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量最高。通过SDS-PAGE对主要成分进行分离并确定分子量大小，电泳结果显示：混合肽主要含有三至五种多肽成分，分子量介于1000至3000道尔顿之间。通过质谱分析得到验证，并确定五种多肽的分子量分别为1714.32、 1857.97、 2034.53、 2474.77、 2492.80道尔顿。

DNA分子标记技术在海带种质鉴定中的应用

本文在CTAB和SDS／K＋两种DAN提取方法基础上，综合与改进，建立了海带配子体DNA的提取和纯化方法。用此法得到了较高质量的海带配子体DNA，可有效地应用于海带分子标记的研究。采用RAPD，ISSR和AFLP三种DNA分子标记技术对海带配子体细胞系进行了种质鉴定和评价，结果表明：1）RAPD方法可以有效地应用于海带配子体细胞系的鉴定，用三个RAPD引物（OPC20，OPD20和OPD15）构建的DNA指纹图谱，不仅能将23个海带配子体细胞系区分开，而且能将每种海带的雌、雄配子体区分开。2）在没有其它海带配子体DNA分子标记背景资料的前提下，运用ISSR标记方法，辅证了RAPD方法的有效性及可靠性，排除了因原核生物的“污染”，所造成的RAPD标记方法的干扰，同时，也能辨别非海带配子体，这可以评价海带配子体保存的实际效果。3）AFLP分子标记结果表明，海带配子体细胞系具有高的多态性，这对海带具体性状进行连锁标记分析，可能是有效的方法。4）在RAPD标记的基础上，初步建立海带配子体SCAR标记，为海带分子标记辅助选种、育种打下基础。5）对3F、5F、12M三个实验材料，进一步用rDNA转录间隔区（ITS1）测序分析，与已知海带配子体ITS1的差别很大，说明不是海带配子体。综合上述，RAPD，ISSR和AFLP三种DNA分子标记技可以对海带种质资源进行鉴定、评估，为海带科学保种、选种提供依据。

环境因子对养殖生物白斑综合症传播和分子生物标志物系统的影响研究

本文研究了海洋微藻在白斑综合症(white spot syndrome)暴发中的可能作用，以及阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基苯磺酸钠(SDBS)长期暴露对紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)生物标志物系统的影响(72 d)。 1．海洋微藻在养殖对虾白斑综合症传播中的作用研究 为了证实海洋微藻是否是养殖对虾白斑综合症的传播途径，我们首先将六种海洋微藻：球定边金藻(Isochrysis galbana)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、小球藻(Chlorella sp. )、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)、锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)和盐藻(Dunaliella salina)，与人工注射感染白斑病毒(white spot syndrome virus)的成体日本囊对虾共同培养，用套氏PCR方法检测共培养的微藻能否携带白斑病毒。在此基础上，进一步研究了共培养后的海洋微藻是否能感染幼体日本囊对虾。研究结果表明，除了H. akashiwo，实验海洋微藻均可携带白斑病毒，但它们携带病毒的能力有明显差异，Chlorella sp.和S. trochoidea携带白斑病毒的能力较强；但是，与白斑病毒的其他携带者（如桡足类等）不同，携带病毒的海洋微藻10天后病毒检测结果均呈阴性。共培养后小球藻组可感染幼体日本囊对虾，但幼体携带病毒的量只能通过二步PCR方法才能检测到。上述结果表明，海洋微藻在WSSV的水平传播途径中具有一定的作用。 2．表面活性剂对紫贻贝生物标志物系统的影响研究 以青岛胶州湾现场调查数据为依据，选择阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基苯磺酸钠(SDBS)作为污染物、以近海底栖生物紫贻贝为受试生物，研究了长期暴露后紫贻贝生化指标(SOD, CAT, GSH, GPx, GST, iNOS, AKP)和遗传毒理指标(AFLP指纹图谱)的变化。实验结果发现: 经过72d不同浓度暴露后，SDBS实验组紫贻贝体内的SOD、CAT和iNOS活性均有显著下降（除CAT 0.1mg/L组外），GSH、GST和GPx在3.0mg /L SDS、SDBS组较各自对照组均有显著升高。SDBS对紫贻贝生化指标影响的显著性水平大于SDS。统计分析显示，SDBS暴露组下GST与GPx呈显著正相关关系，iNOS与SOD也表现出一定正相关,但GSH与CAT、GSH与SOD呈现显著负相关关系。SDS浓度与GST呈显著正相关，而SDBS浓度与CAT呈显著负相关。另外，实验结果发现后闭壳肌中iNOS是一个具有应用前景的阴离子表面活性剂暴露生物标志物。AFLP标记结果统计显示，在实验给定的污染物浓度下，SDBS基因毒性要大于SDS；不同的DNA指纹图谱以及遗传距离图显示不同的污染物造成的DNA损伤是不同的。结果表明，在长期暴露条件(72 d)下，一定浓度的阴离子表面活性剂可以对岗哨生物紫贻贝的SOD, CAT, GSH, GPx, GST, iNOS和AFLP指纹图谱一组指标产生显著影响。

紫球藻藻红蛋白和藻蓝蛋白共价交联物的构建及其与天然藻胆体特性的比较研究

用蔗糖密度梯度超速离心的方法从单细胞红藻---紫球藻（Porphyridium cruentum）中分离纯化了完整的藻胆体。光谱分析表明，藻胆体在可见光区域有四个吸收峰（545nm, 565nm, 618nm 和 650nm）和一个吸收肩（498nm）；荧光发射峰分别在680nm和595nm，二者的比值（λ_(680nm)~(em)/λ_(595nm)~(em)）可高达10以上，说明分离的藻胆体非常完整。非变性电泳结果显示，分离的藻胆体至少有三种颜色的条带，分别为：B－PE，R－PC和b－PE，APC可能含量很少而未见到。SDS－PAGE电泳鉴定至少有三条明显的带，为PE的α和β的重叠带，γ亚基和RPC的亚基。用羟基磷灰石层析和Sephadex G-200层析的方法分离到了高纯度的B－藻红蛋白、b-藻红蛋白和较纯的R－藻蓝蛋白。光谱检验发现，分离得到的藻胆蛋白均为天然态，其中藻红蛋白的荧光发射峰在580nm左右，藻蓝蛋白的荧光发射峰在640nm左右。SDS－PAGE电泳分析，B-藻红蛋白有两条带，分子量大约在20kD，31kD。小分子量的条带极宽，是因为α和β亚基的分子量相近，所以有重叠；大分子量的条带是γ亚基。相对应的是b-藻红蛋白只有20kD的条带，无γ亚基的条带。藻蓝蛋白有两条明显的条带，大约为16kD和20kD。用戊二醛共价交连的方法得了紫球藻B-藻红蛋白和R－藻蓝蛋白和共价结合体。吸收光谱表明，交联体和对照最明显的区别是紫外光区278nm的峰高增加并且蓝移到268nm；交联体的荧光发射光谱与对照相比，498nm激发产生的峰值在588nm（游离的PE的发射峰）和650nm（交联体中PC的发射峰），而对照只有590nm的发射峰，并且交联体在588nm的峰高明显低于对照。非变性电泳鉴定，发现有与对照不同的新的条带出现。这一切证明藻胆蛋白能量传递模型共价交联成功。人工构建的交联物和天然的藻胆体相比，对低离子强度和低温（4 ℃）更为稳定，但能量传递效率相对较低。

WSSV囊膜蛋白VP28基因在蓝藻中克隆和表达

该研究通过蔗糖密度梯度离心分离纯化WSSV-中国株,在电镜观察下观察到不同病毒组分的大小、形态及负染后显示的精细结构;通过SDS-PAGE鉴定在囊膜组分、完整病毒粒子组分中的VP28蛋白.设计一对特异性PCR扩增引物.PCR法从WSSV-中国株基因组DNA中扩增得到vp28基因片段640bp,并在起始密码子ATG前,填加了适合于蓝藻表达系统高效表达的SD序列.进一步将vp28基因正向连接到海藻穿梭表达载体pRL-489上的启动子PpsbA下游,酶切鉴定连接正确.通过PCR扩增在DNA水平上验证vp28基因在两种鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120中均以质粒形式存在,在聚球藻Synechococcussp.PCC7002中以整合形式存在于染色体DNA上.用制备的抗WSSV的抗血清,通过WesternBlotting在蛋白水平上证明vp28基因在两种鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120中均得到了表达,分子量为28kD.该论文的研究目的是通过基因工程获得WSSV囊膜蛋白VP28的转基因蓝藻,期望有助于揭示WSSV感染对虾的分子机一,确定VP28的功能.

青岛文昌鱼酚氧化酶的定位，功能及其在胚胎发育中的变化

本文利用生化，组化，电镜酶细胞化学技术研究了文昌鱼酚氧化酶（PO）的定位，生理功能以及在胚胎发育中的变化。文昌鱼的体表粘液中存在PO，并且主要以酚氧化酶原（proPO）的形式存在，proPO可被胰蛋白酶，SDS和酵母聚糖激活。PO的最适温度为55 ℃，最适pH为9.0。组化结果证明：PO 分布于文昌鱼的表皮，鳃上皮和肠上皮细胞中。超微结构进一步显示：在表皮细胞和肠上皮细胞中，PO 位于均质状的圆形颗粒中，电子密度较高；而在鳃上皮细胞中，PO存在于圆形颗粒和次级溶酶体中。PO能够增强多巴的抗菌活性。在文昌鱼的胚胎发育过程中，PO出现的最早时期是在早期神经胚，PO活性在孵化期达到最高，至一天幼虫时，PO活性开始略有下降。在早期神经胚中，整个外胚层包括神经外胚层和表皮外胚层细胞中均有PO 阳性产物，而中胚层和内胚层细胞中则呈阴性反应。随着神经胚的继续发充，神经外胚层细胞中PO的染色强度逐渐减弱，而表皮外胚层细胞中的PO 染色强度不发变化。当神经板分化出来时，PO 活性从神经板细胞中消失，而在表皮细胞中保持不变。PO可以作为神经处胚层从表皮外胚层中分化出来的标志酶。本文首次报道PO 存在于文昌鱼的体表粘液中，证明它可以起免疫防御作用；并首次发现PO 可以作为神经外胚层与表皮外胚层分化的标志酶。

条斑紫菜孢子体与配子体PSII的特性以及单颗粒分析

选择条斑紫菜（Porphyra yezoensis）两个不同发育阶段（孢子体和配子体）作为研究对象，分别从孢子体与配子体的类囊体膜上分离到具有高放氧活性的PSII复合物。配子体PSII复合物的放氧活性为2269.77±152.94 μmolO2/chl(mg).h，孢子体PSII复合物的放氧活性为2256.33±141.81 μmolO2/chl(mg).h。对分离到的PSII复合物的稳定性和放氧活性进行了研究，结果表明：孢子体和配子体的PSII复合物，在4℃条件下保存比-80℃下放氧活性高，稳定性高。配子体跟孢子体比较，在-80℃保存条件下第六天就已经没有放氧活性，而此时-80℃下孢子体PSII复合物仍然具有放氧活性。同时对4℃下保存的PSII复合物进行分子筛柱层析，室温吸收光谱测定以及放氧活性测定，发现随着放氧活性逐渐降低的同时，蛋白大分子有聚合现象。室温吸收光谱表明经过长期的保存，吸收峰向短波长方向偏移，同时叶绿素易降解成为脱镁叶绿素。分别测定了配子体与孢子体PSII复合物的SDS-PAGE电泳蛋白条带的氨基酸序列，配子体PSII复合物经过SDS-PAGE电泳后的蛋白条带，经过质谱测定，鉴定出CP-47、D2、D1蛋白。孢子体PSII复合物，经过SDS-PAGE电泳后的蛋白条带，经过质谱分析鉴定出CP-47、CP-43、D2、D1蛋白。CP-47， CP-43蛋为PSII反应中心叶绿素P680的脱辅基蛋白，D1 与D2蛋白为PSII的反应中心蛋白。对纯化的PSII复合物，并首次采用单颗粒技术分析比较其形态结构，电镜观察证实纯化的PSII复合物为二聚体，颗粒大小约为13nm×7.8nm，经过计算总分子量约为500kDa，但是孢子体与配子体的PSII复合物在形态上有轻微差别，配子PSII复合物要略宽于孢子体复合物，孢子体PSII复合物周边棱角形较配子体明显。

红藻无性繁殖系的诱导及其发育机制的初步研

以红藻中的角叉菜（Chondrus ocellatus）、龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）、真江蓠(Gracilaria asiatica)和海膜（Halymenia sinensis）为材料，观察了红藻幼苗的早期发育，通过组织培养构建无性繁殖系，并初步探讨了红藻无性繁殖系的发育及分化机理，为海藻无性繁殖系的获得提供理论基础和依据。 在室内进行了角叉菜的四分孢子和果孢子的细胞培养，并观察其早期发育过程。结果表明，四分孢子和果孢子的早期发育是相似的，可主要分为三个阶段：早期分裂阶段、盘状体阶段和直立体形成阶段。 切段组织培养表明，红藻无性繁殖系的获得主要通过两种途径：一种为切段组织经过培养可直接形成再生植株；另一种为切段组织经培养脱分化，诱导出愈伤组织或类愈伤组织，愈伤组织或类愈伤组织再分化，形成盘状体，盘状体继续发育即可形成再生植株。 通过切段组织培养，获得了龙须菜和真江蓠再生植株。在PES培养液中，添加6－BA（0.25 mg/L）对龙须菜切段组织再生新枝的诱导有促进作用，诱导率可高达84.4％，高浓度的IAA或6－BA（4 mg/L）对切段组织有损伤作用。实验证明伤口大小对切段组织再生新枝有影响，且伤口太大对再生新枝的形成不利。龙须菜的切段组织培养过程中表现出极性。 通过组织培养，诱导出海膜类愈伤组织—丝状体。添加植物生长调节类物质（IAA 和 6-BA）对海膜丝状体的诱导无促进作用。海膜切片在消毒海水中培养即可获得丝状体。海膜丝状体的外植体来源主要有两个：一是健康的藻体； 另一是盘状体，其丝状体的诱导率分别为80％ 和90％。筛选出了丝状体适宜的生长条件：13－23℃，10－15 μE•m−2• s−1，12h：12h（Light: Dark），其中18℃为最佳生长温度。高的光照强度（50 μE•m−2•s−1）对丝状体产生损伤作用。 红藻无性繁殖系的发育途径，根据其获得途径也有两种情况。经过切段组织培养直接获得的无性繁殖系，是切段切口处已分化的细胞表现其全能性，恢复分裂能力，再生新枝，切段表现出极性。极性的上端产生新枝，下端形成固着器，成为一个完整的植株。经过愈伤组织和类愈伤组织获得的无性繁殖系，是切口处已分化的细胞表现其全能性，经脱分化形成愈伤组织和类愈伤组织，附着在基质上后，再分化形成盘状体，按照孢子的早期发育途径，形成直立体幼苗。 通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，对龙须菜正常藻体及无性繁殖系发育过程中蛋白的表达进行检测，检测出表达差异的蛋白质，推测这两个蛋白可能与龙须菜切段组织再生有关，其中30 KD的蛋白仅在再生新枝中表达，150 KD和125 KD的蛋白仅在正常生长的龙须菜和龙须菜切段的极性下端中表达。 根据高等植物中与萌芽、分生组织以及愈伤组织发育相关的基因序列保守区设计了五对特异引物，通过PCR和RT-PCR扩增检测及DNA测序分析，对红藻无性繁殖系早期发育相关的基因序列，进行了初步分析。

文蛤体液抗肿瘤蛋白的分离纯化与作用方式研究

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，目前的抗肿瘤药物虽然具有一定疗效，但存在选择性差、毒副作用大等缺点，药物治疗期待着新的突破。因此，寻找高效低毒的抗肿瘤药物已经成为当前肿瘤研究的重要内容。传统抗肿瘤天然药物的来源局限在陆地，近年来在海洋来源的具有抗肿瘤活性物质的开发上取得了很多成果，获得了多种高活性、毒副作用小、作用机制新颖的活性化合物，为新型抗肿瘤药物的研发提供了新思路。 本研究采用硫酸铵分级沉淀、弱阳离子交换层析、疏水层析、强阴离子交换层析等分离技术，结合MTT活性追踪方法，从海洋软体动物文蛤体液中纯化得到单一蛋白组份MML，SDS-PAGE检测其分子量约为40kD。该蛋白在体外具有显著的抗人肝癌细胞BEL-7402的活性，其IC50达到52µg/mL。相差显微镜下观察发现，MML起效较快，细胞处理半小时后，形态开始发生改变，细胞膜逐渐与胞内物质分离，最终形成明显的空泡状结构。 为进一步研究MML的作用方式，分别从细胞膜毒性、细胞周期阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡的角度开展了相关研究。在细胞膜毒性方面，采用扫描电镜观察、Hoechst33342/ PI双染色和乳酸脱氢酶漏出率检测的方法，初步证明了MML对BEL-7402具有细胞膜毒性。结合流式细胞仪、微管蛋白免疫荧光检测技术，研究了MML作用后的细胞周期及微管蛋白的变化情况，结果发现MML的抗肿瘤作用方式可能是通过改变肿瘤细胞膜通透性，进而破坏微管蛋白聚合、阻滞细胞周期，产生抑制肿瘤细胞增殖的活性。DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳分析发现，MML作用后的细胞出现一定程度的凋亡，这种凋亡现象的产生是由于MML的直接诱导，还是间接作用产生，尚有待于深入研究。

鲨鱼软骨抗血管生成多肽的分离纯化及其生物活性

以血管生成为靶点的抗肿瘤策略是抗肿瘤领域的研究热点，目前已经发现许多天然和化学合成的抗血管生成药物。鲨鱼软骨作为抗新生血管生成因子的重要来源的研究已有20多年的历史，很多研究显示鲨鱼软骨提取物有抗血管生成活性。但鲨鱼软骨活性多肽的完整分子结构一直未见报道；鲨鱼软骨活性多肽干扰血管生成通路的信号途径尚不明确。 本文应用盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤、凝胶层析等分离技术，从青鲨（Prionace glauca）软骨中分离纯化并鉴定了一种新的具有抗新生血管生成活性的多肽。经SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析显示，该多肽分子量为15500 Da，采用蛋白数据库分析表明该多肽是一种新发现的鲨鱼软骨多肽（Polypeptide from Prionace glauca，PG155）。 体外实验显示，PG155抑制内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell ，HUVEC）迁移和管腔形成，并呈剂量依赖关系。200 μg/ml PG155对牛主动脉内皮细胞（Bovine Aortic Endothelial Cells，BAECs）和HUVECs及以下癌细胞，包括人肝癌细胞（human hepatoma Bel-7402 cells，Bel-7402）、 口腔上皮癌细胞（human oral epidermoid carcinoma KB cells ，KB）、人结肠癌细胞（human colon cancer HCT-18 cells，HCT-18）和人乳腺癌细胞（human breast MCF7 cancer cells ，MCF7）的增殖均无抑制作用，说明PG155无细胞毒作用。20 μg/ml PG155显著抑制HUVEC的迁移和管腔形成；40-80 μg/ml PG155 对VEGF 介导的HUVEC的迁移和管腔形成几乎完全抑制。 体内实验显示，PG155显著抑制斑马鱼胚胎模型新生血管生成，并呈剂量依赖关系。形态学观察表明PG155显著抑制斑马鱼胚胎肠下静脉（subintestinal vessels， SIVs）的生长，随着浓度的升高SIVs的生长可受到完全抑制。碱性磷酸酶染色分析显示，在一定浓度范围内，PG155随着浓度的升高对斑马鱼胚胎整体血管生成抑制作用依次增强。160 μg/ml PG155会引起斑马鱼胚胎心脏功能障碍。 由海洋生物中发现新的肿瘤新生血管生成抑制剂国内外的报道较少，我们的工作表明鲨鱼软骨可作为血管生成抑制剂的重要来源，鲨鱼软骨活性多肽PG155由于具有极低的细胞毒作用，并能抑制VEGF介导的血管生成过程，有希望成为一类新型抗肿瘤药物。