Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2)

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal.

Avaliação citotóxica, mutagênica e genotóxica dos análogos do Megazol

A doença de Chagas é uma doença tropical infecciosa e negligenciada responsável por um grande número de pessoas infectadas e em risco de infecção, principalmente nas regiões pobres da América Latina. No momento, apenas duas drogas, Benzonidazol e Nifurtimox, estão disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, mas são ineficazes por apresentarem baixa taxa de cura. O Megazol é um importante representante da classe dos nitroimidazóis e é uma alternativa promissora devido ao seu potencial tripanocida com um perfil superior de ação quando comparado ao tratamento disponível. No entanto, o Megazol não é utilizado clinicamente uma vez que possui atividade mutagênica e carcinogênica relatada. O Instituto de Tecnologia em Fármacos (Farmanguinhos) desenvolveu três análogos do Megazol: PTAL 05-02 (3-amino-5-(1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-il)-1H-1,2,4-triazol), PAMT 09 (2-amino-N-(1-metil-4-nitro-1H-imidazol-5-il)-5-(trifluorometil)-1H-1,2,4-triazol) e PTAL 04-09 (1-(1-metil-4-nitro-1H-imidazol-5-il)-1H-pirazol). O objetivo deste trabalho é apresentar novas moléculas análogas do Megazol com atividade tripanocida, desenvolvidas a partir de estratégias racionais de desenvolvimento de substâncias bioativas ao manter o perfil farmacodinâmico do Megazol enquanto tenta diminuir ou remover o efeito genotóxico. Testes genotóxicos na avaliação segura de novas substâncias bioativas foram utilizados, de acordo com as diretrizes da OECD. O teste da Salmonella/microssoma foi utilizado na avaliação mutagênica e citotóxica, utilizando linhagens de Salmonella enterica sorovar Typhimurium, deficientes e supercompetentes na síntese de enzimas nitroredutase e acetiltransferase. O análogo PAMT 09 não foi mutagênico em nenhuma concentração e linhagem utilizada. Os análogos PTAL 05-02 e PTAL 04-09 foram mutagênicos, na ausência de S9 mix, para a linhagem TA98/1,8-DNP6. Na avaliação de citotoxicidade, os três análogos foram citotóxicos, independente de metabolização exógena S9 mix. O teste do micronúcleo, utilizando células de macrófago de rato, foi realizado para a avaliação genotóxica dos análogos do Megazol. Os três análogos foram capazes de induzir a formação de micronúcleos e apresentaram efeito citotóxico.

ELISA com MSP5 recombinante truncada para detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale em bovinos.

Os objetivos buscados pelos autores neste estudo foram produzir e solubilizar a proteína MSP5 recombinante truncada de Anaplasma marginale e avaliar seu desempenho em um ensaio de imunoadsorção enzimática indireto para detecção de anticorpos contra a riquétsia. O gene msp5, exceto a região N-terminal hidrofóbica, foi amplificado por reação em cadeia da polimerase, clonado em plasmídeo pTrcHis-TOPO e expresso em Escherichia coli. A solubilização da proteína recombinante foi avaliada em diferentes pHs e concentrações de uréia. A sensibilidade e a especificidade do ensaio foram avaliados testando-se 66 soros de animais infectados experimentalmente com A. marginale e 96 soros negativos, com o estado de infecção desses animais confirmado por reação em cadeia da polimerase. Um total de 1.666 amostras de soros bovinos, provenientes do Brasil - Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) e Minas Gerais (267), assim como do Uruguai (32) e Costa Rica (803) foram testadas nos ELISAs com MSP5 truncada e com MSP1a recombinantes, e a concordância entre os dois testes foi avaliada. O ELISA indireto com MSP5 truncada foi capaz de detectar animais infectados com 96,97% de sensibilidade e 100% de especificidade. Nos animais infectados experimentalmente, o ELISA detectou anticorpos do 12o dia após a inoculação (DPI) até o último dia de observação (37o DPI). Os ELISAs para MSP5 e MSP1a apresentaram concordância de 95,67%, com índice kappa de 0,81. Os resultados discordantes apresentaram uma diferença significativa (P < 0,001). Anticorpos contra A. marginale foram detectados em animais de todas asregiões estudadas. O ELISA com MSP5 recombinante truncada apresentou bom desempenho na detecção de anticorpos contra A. marginale, com alta sensibilidade e especificidade, representando uma importante ferramenta para o diagnóstico da anaplasmose bovina em estudos epidemiológicos.

Estudio de una estrategia alternativa de ingeniería genética para incrementar la fijación biológica de nitrógeno atmosférico

Para satisfacer los altos rendimientos que impulsan la agricultura moderna la aplicación de fertilizantes nitrogenados ha sido fundamental. Dado que la base de la producción industrial de los fertilizantes químicos esta basado en el uso de combustibles fósiles, estos, actualmente, incrementan el costo económico debido a la disminución constante de las reservas de petróleo. Además, dada la baja eficiencia en el uso del fertilizante aplicado por parte de las plantas y el alto impacto ambiental debido a la emisión de óxido nitroso, resulta necesario emprender la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la concentración del nitrógeno fijado. Una de las propuestas para disminuir la aplicación de fertilizantes es el uso de microorganismos fijadores de nitrógeno; que ya son ampliamente utilizados en leguminosas por su capacidad de establecer asociaciones simbióticas; las cuales, lamentablemente, aún no han sido encontradas entre los principales cultivos de cereales. El objetivo del presente trabajo es la producción de una técnica de ingeniería genética que permita obtener bacterias fijadoras de nitrógeno recombinantes capaces de asociarse a distintos cultivos vegetales incrementando la productividad de los mismos. Para ello, los genes que sintetizan la nitrogenasa (nif), que están co-localizados en una isla genómica, en Pseudomonas stutzeri A1501 se transfirieron, vía el cósmido recombinante X940, a un promotor del crecimiento vegetal, Pseudomonas protegens Pf-5. La bacteria recombinante obtenida, P. protegens Pf-5 X940, fue capaz de crecer en medios de cultivo deficientes en nitrógeno o con el agregado de amonio; mostró una alta actividad nitrogenasa, liberando al medio de cultivo cantidades significativas de amonio y presentó expresión de los genes nif, sugiriendo que el proceso de fijación, en esta bacteria, es constitutivo. Las inoculaciones de especies vegetales (arabidopsis, alfalfa, festuca alta y maíz) con Pf-5 X940 aumentaron la concentración de amonio en el suelo y la productividad de las plantas en condiciones deficientes de nitrógeno. Estos resultados inician un nuevo camino hacia la producción efectiva de inoculantes recombinantes para la fijación de nitrógeno en un amplio rango de cultivos

Estudio de una estrategia alternativa de ingeniería genética para incrementar la fijación biológica de nitrógeno atmosférico

Para satisfacer los altos rendimientos que impulsan la agricultura moderna la aplicación de fertilizantes nitrogenados ha sido fundamental. Dado que la base de la producción industrial de los fertilizantes químicos esta basado en el uso de combustibles fósiles, estos, actualmente, incrementan el costo económico debido a la disminución constante de las reservas de petróleo. Además, dada la baja eficiencia en el uso del fertilizante aplicado por parte de las plantas y el alto impacto ambiental debido a la emisión de óxido nitroso, resulta necesario emprender la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la concentración del nitrógeno fijado. Una de las propuestas para disminuir la aplicación de fertilizantes es el uso de microorganismos fijadores de nitrógeno; que ya son ampliamente utilizados en leguminosas por su capacidad de establecer asociaciones simbióticas; las cuales, lamentablemente, aún no han sido encontradas entre los principales cultivos de cereales. El objetivo del presente trabajo es la producción de una técnica de ingeniería genética que permita obtener bacterias fijadoras de nitrógeno recombinantes capaces de asociarse a distintos cultivos vegetales incrementando la productividad de los mismos. Para ello, los genes que sintetizan la nitrogenasa (nif), que están co-localizados en una isla genómica, en Pseudomonas stutzeri A1501 se transfirieron, vía el cósmido recombinante X940, a un promotor del crecimiento vegetal, Pseudomonas protegens Pf-5. La bacteria recombinante obtenida, P. protegens Pf-5 X940, fue capaz de crecer en medios de cultivo deficientes en nitrógeno o con el agregado de amonio; mostró una alta actividad nitrogenasa, liberando al medio de cultivo cantidades significativas de amonio y presentó expresión de los genes nif, sugiriendo que el proceso de fijación, en esta bacteria, es constitutivo. Las inoculaciones de especies vegetales (arabidopsis, alfalfa, festuca alta y maíz)con Pf-5 X940 aumentaron la concentración de amonio en el suelo y la productividad de las plantas en condiciones deficientes de nitrógeno. Estos resultados inician un nuevo camino hacia la producción efectiva de inoculantes recombinantes para la fijación de nitrógeno en un amplio rango de cultivos

Codon ambiguities as a mechanism to alter the genetic code in Saccharomyces cerevisiae

Although the genetic code is generally viewed as immutable, alterations to its standard form occur in the three domains of life. A remarkable alteration to the standard genetic code occurs in many fungi of the Saccharomycotina CTG clade where the Leucine CUG codon has been reassigned to Serine by a novel transfer RNA (Ser-tRNACAG). The host laboratory made a major breakthrough by reversing this atypical genetic code alteration in the human pathogen Candida albicans using a combination of tRNA engineering, gene recombination and forced evolution. These results raised the hypothesis that synthetic codon ambiguities combined with experimental evolution may release codons from their frozen state. In this thesis we tested this hypothesis using S. cerevisiae as a model system. We generated ambiguity at specific codons in a two-step approach, involving deletion of tRNA genes followed by expression of non-cognate tRNAs that are able to compensate the deleted tRNA. Driven by the notion that rare codons are more susceptible to reassignment than those that are frequently used, we used two deletion strains where there is no cognate tRNA to decode the rare CUC-Leu codon and AGG-Arg codon. We exploited the vulnerability of the latter by engineering mutant tRNAs that misincorporate Ser at these sites. These recombinant strains were evolved over time using experimental evolution. Although there was a strong negative impact on the growth rate of strains expressing mutant tRNAs at high level, such expression at low level had little effect on cell fitness. We found that not only codon ambiguity, but also destabilization of the endogenous tRNA pool has a strong negative impact in growth rate. After evolution, strains expressing the mutant tRNA at high level recovered significantly in several growth parameters, showing that these strains adapt and exhibit higher tolerance to codon ambiguity. A fluorescent reporter system allowing the monitoring of Ser misincorporation showed that serine was indeed incorporated and possibly codon reassignment was achieved. Beside the overall negative consequences of codon ambiguity, we demonstrated that codons that tolerate the loss of their cognate tRNA can also tolerate high Ser misincorporation. This raises the hypothesis that these codons can be reassigned to standard and eventually to new amino acids for the production of proteins with novel properties, contributing to the field of synthetic biology and biotechnology.

Identificação e caracterização de duas isoformas da Ferritina da amêijoa R. decussatus e avaliação de algumas das suas propriedades biológicas

Dissertação de mest., Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Produção e purificação da proteína rica em gla (grp) humana recombinante

Dissertação de mest., Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Deteção de proteínas virais com nanossensores óticos

O desenvolvimento de tecnologias para a deteção de vírus é um tema de grande interesse em medicina de diagnóstico. Neste contexto, os biossensores têm-se revelado importantes ferramentas bioanalíticas, na medida em que permitem efetuar deteções moleculares de forma rápida, específica, reprodutível e com baixo custo associado. No âmbito desta dissertação, estabeleceram-se metodologias para a deteção fluorescente do fator de infetividade viral (Vif) do VIH através de um nanossensor ótico funcionalizado com anticorpos recombinantes anti-Vif, fragmentos variáveis de cadeia simples 4BL. Quantum dots carboxílicos conjugados a proteínas Vif são excitados a um comprimento de onda de 405 nm, transmitindo luz fluorescente a 605 nm a um fotodetetor de silício amorfo hidrogenado com um filtro de fluorescência integrado. Para implementar um sistema de deteção sensível e eficiente, estudaram-se estratégias de ativação de superfície em chips de vidro. A variabilidade das condições experimentais de um protocolo de silanização com (3-mercaptopropil)-trimetoxisilano (MPTS) foi avaliada através da análise de ângulos de contacto e densidades moleculares de fluoresceína funcionalizada com maleimida. Estabeleceu-se que, uma incubação dos substratos por 4 h com 5% (w/v) MPTS, seguida de cura a 110 ºC por 2 h, e redução com 10 mM ditiotreitol por 30 min, promove a formação de camadas de organosilanos de qualidade com grupos tiol reativos bem orientados. Estratégias de imobilização do elemento recetor foram testadas em substratos de vidro ativados e em sistemas de microfluídica vidro/PDMS, tomando por base o tag de afinidade, glutationa S-transferase (GST), do anticorpo recombinante. Vidros funcionalizados com glutationa e anti-GST mostraram-se igualmente reativos ao anticorpo GST-4BL, resultando uma capacidade de ligação do antigénio de aproximadamente 4.76 x 1010 moléculas/cm2 de QD-Vif, o que corresponde a 15% da cobertura máxima de superfície. Dos ensaios em sistemas de microfluídica resultaram sinais fracos e poucos reprodutíveis, destacando a necessidade de desenvolver metodologias de funcionalização mais apropriadas.

Engineering new strategies to improve pharmacokinetics of therapeutic proteins

Tese de doutoramento, Farmácia (Biotecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

New method for the simultaneous identification of pathogenic human viruses using multiplex PCR

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Biodegradação enzimática de aminas aromáticas tóxicas

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

Transglutaminases do mosquito Anopheles gambiae: Caracterização genética, bioquímica e funcional durante a infecção por Plasmodium berghei

A malária constitui um problema de saúde pública, que tem vindo a agravar-se, sendo crescente a necessidade de estratégias renovadas para o seu controlo, como a interrupção do ciclo esporogónico. Deste modo, é essencial compreender as respostas imunológicas de Anopheles anti-Plasmodium. Demonstrou-se anteriormente, que a inibição de transglutaminases, enzimas que participam em vários processos biológicos ao catalisarem a formação de ligações covalentes entre péptidos, agrava a infecção em mosquitos pelo parasita. O presente trabalho tem por objectivo caracterizar as transglutaminases AGAP009098 e AGAP009100 de Anopheles gambiae. Os métodos utilizados para este efeito foram: a sequenciação de regiões dos genes AGAP009098 e AGAP009100; a clonagem molecular de fragmentos da região codificante do gene AGAP009098, usando o vector plasmídico pET–28a(+) e Escherichia coli como sistema de expressão; e PCR em Tempo Real para analisar a expressão relativa dos genes AGAP009098 e AGAP009100 nos diferentes os estádios de desenvolvimento. AGAP009098 é expressa ubiquamente e AGAP009100 a partir do estádio pupa. Estes resultados apontam para a conclusão de que AGAP009098 e AGAP009100 poderão desempenhar funções em processos biológicos relevantes, por exemplo na defesa imunitária, ou no desenvolvimento. Os péptidos recombinantes, obtidos a partir da clonagem com sucesso de fragmentos da região codificante do gene AGAP009098, constituem uma ferramenta importante para averiguar a função destas TGases, no futuro.

Opções de utilização sequencial de anti-retrovíricos em doentes com falência terapêutica em Angola

A infecção pelo VIH/SIDA constitui um dos principais problemas de saúde no Mundo e em África. A África Sub-sahariana detém actualmente 67% das infecções a nível global. Angola, localizada na sub-região central de África (OMS) tem uma prevalência actual média estimada em 2.4%, estando rodeada a Sul e Leste por países de prevalências mais elevadas. Em Angola, predomina o VIH-1. Os dados publicados sobre a epidemiologia molecular do VIH em Angola mostram uma grande diversidade de subtipos e formas recombinantes circulantes (CRF), recombinantes circulantes únicas (URF) e amostras não tipificadas. A motivação para o estudo presente foi o conhecimento ainda limitado sobre a infeção por VIH em Angola, desde a epidemiologia molecular às características clínicas, imunológicas, virológicas, resposta à terapêutica anti-retrovírica combinada (TARVc) e perfil de resistência do VIH à TARVc. Foi estudado um coorte de 300 doentes adultos, com infecção por VIH, de 15 de Junho de 2006 a 15 de Junho de 2010. Predomina o género feminino, 65% (194/300) e o grupo etário dos 25 aos 39 anos, 62% (186/300). A mediana de idades é 33 anos, residem em Luanda 98% (295/300), 94% são angolanos, sendo os estrangeiros de S. Tomé e RDC. A Classificação CDC de 1993 na linha de base mostrou um predomínio de doentes da categoria clínica C, 53% (160/300), com uma ou duas doenças definidoras; 34% (101/300) dos doentes eram da Categoria C3 do CDC e 49% (147/300) tinham linfócitos T CD4+ abaixo das 200 cel/l. A doença definidora mais frequente foi a Tuberculose, em 39% dos doentes (117/300). A mediana de linfócitos T CD4+ na linha de base foi de 195 cel/μl [1-1076]. Apenas 12,2% dos doentes (37/302) tinha T CD4+ de base superior a 500 células/l. Determinou-se a carga vírica na linha de base, em 213 dos doentes (71%), verificando-se que 46% destes doentes (97/213) tinham cargas virícas superiores a 100.000 cp/ml, 32% (69/213) entre 10001 e 100000, 21% (45/213) entre 400 e 10000, 0,9% (2/213) abaixo de 400 cp/ml. Iniciaram terapêutica anti-retrovírica no período de estudo 206 doentes (69%) com esquemas terapêuticos baseados em NNRTI, sendo 131 (64%) medicados com a associação d4t+3TC+ NVP. Ao fim de 4 anos, em Junho de 2010, havia 126 doentes monitorizados com contagem de linfócitos T CD4+ e CV, estando 62% dos doentes com CV indetectável (79/126). Os doentes em falência virológica corresponderam a 16% (20/126), 9% (11/126) tinham resultados discordantes (boa resposta imunológica mas carga viral detectável) e 13% (16/126) foram inconclusivos. Foi mudada a terapêutica para esquema de 2ª linha em 5 doentes, 4 dos 5 doentes com critérios de falência virológica e 1 sem critérios de falência virológica, por toxicidade ao EFV. Os doentes com critérios de falência imunológica ou virológica segundo a OMS e os doentes com dados inconclusivos foram seleccionados para testes genotípicos de resistência aos anti-retrovíricos (TR). Foram realizados TR e subtipagem em 37 doentes. Nos doentes que realizaram TR sob TARVc, as mutações de resistência mais frequentemente encontradas foram a M184V, em 16 doentes, a K103N em 12 doentes e a Y181C em 7 doentes. O subtipo C, foi o subtipo predominante em 30% (11/37) dos casos. Para avaliar a adesão à TARVc, foram estudados 63 doentes, faltosos a consultas ou demonstrado sinais de falência clínica, imunológica ou virológica. O método realizado foi o auto-relato por entrevista. Verificou-se uma adesão à TARVc de 100% em 33% (21/63), adesão entre 100% e 90% em 7% (4/63), de 50 a 90% em 7% (4/63) e inferior a 50% em 54% (34/63). Como factores de não-adesão, predominavam a mobilidade no emprego Opções de utilização sequencial de anti-retrovíricos em doentes com falência terapêutica em Angola X e factores familiares e sociais, apontados como razão para a falta às consultas que davam acesso aos medicamentos ARV. Fazendo corresponder os resultados dos testes de resistência realizados à adesão de todos os doentes entrevistados, verifica-se que o grupo de 34 doentes com menos de 50% de adesão, 19 realizaram TR e desses, 13 mostraram mutações de resistência, sendo 10 resistentes a 2 classes de ARV, NITR e NNITR, 2 a NNITR e 1 a NITR. Os restantes 6 doentes deste grupo eram aparentemente susceptíveis às 3 classes de ARV. Actualmente, estão em seguimento 58% dos doentes (176/300), 26 % (77/300) perderam-se no seguimento e 16% (47/300) faleceram. O estudo realizado salienta a fase tardia da chegada aos cuidados médicos; mostra a tuberculose como doença indicadora mais frequente e mostra que a maioria dos doentes foi medicada com D4T+3TC+NVP. Os critérios de sucesso terapêutico descem ao longo do estudo de 71% para 62%. Indica a necessidade de acções urgentes para acesso mais precoce aos cuidados de saúde e intervenção social para ultrapassar as limitações à adesão à TARVc e tornar esta mais eficaz. As opções de segunda linha já disponíveis são muito reduzidas (tenofovir, lopinavir potenciado com ritonavir e saquinavir), havendo necessidade de continuar estes estudos para uma avaliação mais profunda da eficácia destas terapêuticas.

Avaliação da sustentabilidade corporativa: estudo das relações híbridas pelo modelo do Hybrid Bottom Line

A presente tese reflete sobre os temas do desenvolvimento sustentável, da sustentabilidade corporativa, da responsabilidade social corporativa e das dimensões do Triple Bottom Line. O principal objetivo do nosso trabalho é contribuir para o conhecimento das relações que se estabelecem nas interseções entre a dimensão económica, social e ambiental da sustentabilidade corporativa, aqui designadas de relações híbridas. Neste sentido, desenvolveu-se um enquadramento teórico que fundamenta o modelo proposto, designado por Hybrid Bottom Line. De acordo com este enquadramento procurou-se conceber uma metodologia que permitisse analisar como é que estas relações de interseção entre economia-ambiente e economia-social se verificam e de que forma os seus resultados podem beneficiar a compreensão, avaliação e melhorias no entendimento da sustentabilidade corporativa, bem como possibilitar uma análise dirigida a fatores recombinantes específicos. Em complemento, foi desenvolvida uma proposta que permite posicionar o esforço desenvolvido pela empresa no âmbito da sustentabilidade e desta forma tipificar as suas ações. Nesta tese a abordagem empírica recaiu na análise dos relatórios de sustentabilidade publicados pelas empresas e baseados nas diretivas de relato propostas pelo Global Reporting Initiative. A amostra para o estudo abrangeu um total de 85 empresas de diferentes dimensões de 36 sectores económicos e representando 36 países de 5 continentes. A análise dos resultados foi feita utilizando diversos métodos de análise de dados (de frequência e de conteúdo) e análises estatísticas (análise de contingência, variância e de correspondências múltiplas) que permitiram observar as relações entre as dimensões do Triple Bottom Line, dando lugar à construção de uma matriz de relações híbridas. Seguidamente foi realizada uma análise longitudinal de uma das empresas da amostra tendo como referência a matriz híbrida obtida, assim como a tipificação da empresa no âmbito da sustentabilidade. Os resultados alcançados nas diferentes fases indicam que o enquadramento teórico que foi utilizado é útil para a análise das interseções entre as dimensões e permite uma avaliação dirigida a fatos ocorridos entre pares dimensionais, bem como projetar análises e posicionamentos futuros. Os resultados obtidos sugerem que a proposta apresentada é útil e deverá ser utilizada e desenvolvida noutros contextos. Esta tese contribui para a ideia de que a responsabilidade corporativa não deve ser só vista e operacionalizada como uma realidade de dimensões segmentadas mas também deve ser observada como um conjunto possível de interações que se manifestam nas interseções das suas diferentes dimensões.