Biodegradação enzimática de aminas aromáticas tóxicas

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

A enzima azoredutase PpAzoR de Pseudomonas putida tem uma elevada capacidade de clivagem da ligação azo dos corantes, em condições de anaerobiose. No entanto, é do conhecimento que as aminas aromáticas formadas apresentam, em alguns casos, níveis mais elevados de toxicidade do que a verificada para os corantes iniciais. A utilização da enzima CotA-lacase de Bacillus subtilis que oxida vários substratos, incluindo aminas aromáticas, em condições de aerobiose, foi usada para transformar as aminas aromáticas, resultantes da ação da PpAzoR. Nesta dissertação, o objetivo foi a identificação e caracterização dos produtos formados pela ação sequencial das enzimas PpAzoR e CotA-lacase sobre oito corantes azo (AR266, DB38, DR80, MB3, MB9, MB17, RB5 e RY145) utilizando HPLC e 1H RMN. Para tal, após transformação das células de Escherichia coli, foram obtidas as estirpes recombinantes a superproduzir as enzimas PpAzoR e CotA-lacase, que foram purificadas, e as respetivas atividades determinadas. As velocidades de descoloração para a PpAzoR com os corantes selecionados foram determinadas. Foram realizadas reações em larga escala sendo que, num primeiro passo, os corantes foram degradados por ação da PpAzoR, produzindo-se as aminas aromáticas correspondentes e, sequencialmente foi adicionada CotA-lacase. O objetivo último deste trabalho é o desenvolvimento de novas estratégias para produzir compostos de elevado valor acrescentado a partir de efluentes contendo corantes, contribuindo deste modo para a criação de uma economia circular e uma inteligente e eficiente utilização de recursos. Os produtos da reação dos DR80, MB3, MB17, MB9 e RY145 com a azoredutase PpAzoR foram identificados como aminas aromáticas. No entanto verificou-se, em todos os casos, a ausência inesperada de pelo menos uma amina nas misturas reacionais, o que se pode prender com alguns fatores, como o desarejamento insuficiente ou o tratamento de amostras para análise por RMN. Na análise dos produtos resultantes da ação da CotA-lacase sobre as aminas aromáticas, verificou-se que algumas destas são substrato desta enzima, levando à produção de fenazinas e orto-quinonas. Estes compostos podem ser utilizados em numerosas aplicações, como indústrias de tintas de cabelo, farmacêutica ou de diagnóstico.

Abstract: The azoreductase PpAzoR from Pseudomonas putida has the ability to cleave the azo bond of azo dyes, under anaerobic conditions. However it is know that the aromatic amines produced exhibited, in some cases, high levels of toxicity. The laccase CotAlaccase from Bacillus subtilis oxidize several substrates, including aromatic amines under aerobic conditions. Therefore, this enzyme was used to transform the aromatic amines, resulting from the PpAzoR activity and it was found that this activity lowers significantly the toxicity of the products. In this thesis, the aim was to identify and characterize the products of the mult i-step enzymatic reactions with eight different synthetic azo dyes (AR266, DB38, DR80, MB3, MB9, MB17, RB5 and RY145) using HPLC and 1H NMR. To this end, after transformation of Escherichia coli cells, the recombinant strains to overproduce the enzymes were obtained. After purification steps, the enzymatic activity for both enzymes, PpAzoR and CotA-laccase, were determined and the decolourisation rates forPpAzoR with the selected dyes were also determined. Large-scale reactions were carried out, where in a first step, the dyes have been degraded by the action of PpAzoR, yielding the corresponding aromatic amines, and sequentially CotA-laccase was added. The final goal is the development of new strategies to produce high-value compounds from underutilized dye-containing wastewater effluents, contributing for the creation of a circular economy and for the smart and efficient use of resources. In reaction using DR80, MB3, MB9, MB17 and RY145 dyes, aromatic amines have been identified. However the absence of at least one of the amines in the reaction mixtures was noticed, most likely related with the insufficient deaeration or the procedures followed in the sample treatment for NMR analysis. In the analysis of products resulting from the CotA-laccase activity, it was found that some aromatic amines act as substrate for this enzyme, leading to the formation of phenazines and orto-quinones. These are compounds that are currently used in a number of applications in industries of compounds for hair dying, pharmaceutical and diagnosis.