New method for the simultaneous identification of pathogenic human viruses using multiplex PCR

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Os vírus da imunodeficiência adquirida tipo 1 (HIV-1), hepatite C (HCV) e hepatite B (HBV) constituem uma ameaça mundial para a saúde pública. Estatísticas recentes sugerem que milhões de pessoas possuem SIDA, hepatite C ou B, sendo que co-infeções entre estes três vírus são relativamente comuns devido à partilha de rotas de transmissão. Por este motivo, um melhor diagnóstico destas infeções e co-infeçoes é vital para monitorizar estas doenças infeciosas e controlar epidemias. Um marco importante no diagnóstico clínico consistiu na implementação de testes serológicos baseados na deteção de antigénios e anticorpos antivirais. De uma forma geral, testes serológicos fazem a deteção indireta dos vírus, estando por isso sujeitos a falsos negativos, como é exemplo a elevada taxa de falsos negativos no período janela da infeção. De forma a evitar estes problemas, várias técnicas baseadas em ácidos nucleicos têm sido introduzidas para deteção direta destes vírus, com especial relevância no controlo da qualidade das doações para bancos de sangue. A sensibilidade das técnicas baseadas em ácidos nucleicos aumentou consideravelmente com o aparecimento da reação em cadeia da polimerase (PCR), que permite a amplificação de secções do genoma viral partindo de uma quantidade pequena de amostra. De entre as várias técnicas disponíveis, as mais utilizadas são o PCR em tempo real, essencialmente utilizado na quantificação de cargas virais e monotorização da resposta às terapias antivirais, e o multiplex PCR, onde várias regiões são amplificadas em simultâneo permitindo a identificação viral. No entanto, a grande maioria dos métodos atualmente disponíveis baseiam-se na análise de uma única região do genoma viral (estando sujeitos a falsos negativos) ou requerem várias reações independentes, o que aumenta significativamente o custo do diagnóstico. Desta forma, é urgente o desenvolvimento de métodos que detetem simultaneamente vários vírus numa só reação. Nesta dissertação é descrito o desenvolvimento de três PCR multiplex para a deteção do HIV-1, HCV e HBV e um multiplex PCR para a deteção simultânea destes três vírus. Após o alinhamento de várias sequências genómicas de cada vírus, 33 pares de primers de PCR foram desenhados para amplificação por PCR de oito regiões genómicas no HIV-1, 14 no HCV e 11 no HBV. Destas regiões, cinco foram amplificadas com sucesso em PCR singleplex para o HIV-1, sete para o HCV e 11 para o HBV. De seguida, cinco regiões para o HIV-1 e HBV e seis para o HCV foram incluídas nos PCR multiplex individuais de forma a obter amplificações com tamanhos diferentes. Deste modo, cada vírus é identificado pela amplificação de diferentes regiões genómicas que resultam num padrão específico de bandas observáveis em eletroforese. A eficácia dos PCR multiplex foi testada em 70 amostras de plasma de indivíduos residentes em Portugal e na Escócia infetados com estes vírus (32 com HIV-1, 26 com HCV, oito com HBV, três co-infeções HIV-1/HCV e uma co-infeção HIV-1/HBV). A deteção dos vírus foi concretizada pela visualização dos produtos amplificados em gel de agarose. Os resultados comprovam que pelo menos uma região genómica foi sempre amplificada em todas as amostras. Das amostras de HIV-1, 31 % foram amplificadas para as cinco regiões, sendo representativas dos vários genótipos do HIV-1 (B, C, G e recombinantes). Metade das amostras de HCV pertencentes a diferentes genótipos (1A e 3) foram amplificadas para as seis regiões. No caso do HBV, 33 % das amostras foram amplificadas com todos os pares de primers testados. Em média, 3,31 regiões foram amplificadas no HIV-1, 4,54 regiões no HCV e 3,44 regiões no HBV. Estes testes demonstram que os PCR multiplex permitem a correta deteção dos vírus independentemente dos genótipos e em amostras com diferentes proveniências. De forma a demostrar a robustez dos PCR multiplex, foram realizados testes de sensibilidade através de amplificações PCR com gradientes de temperatura de annealing e com gradientes de concentrações virais (i.e., diluições em série). Os resultados indicam que o intervalo ideal de funcionamento dos três PCR multiplex em termos de temperaturas de annealing é de 54,5 °C a 58,3 °C. No entanto, algumas regiões amplificaram em temperaturas fora deste intervalo, sugerindo que mesmo em diferentes condições podem permitir a deteçao viral. Os limites de deteção em termos de carga viral foram estimados para 343,75 cópias/mL para o HIV-1, 418,56 UI/mL para o HCV e 19,92 UI/mL para o HBV. Estes limites de deteção sugerem que os PCR multiplex são adequados ao diagnóstico viral durante o período janela. Foram ainda realizados alguns testes adicionais onde ficou evidente que os PCR multiplex são específicos e não originam amplificações na presença de material genético humano ou de outros vírus. Por fim, foram selecionadas duas regiões de cada vírus para serem incluídas no PCR multiplex para a deteção simultânea de HIV-1, HCV e HBV. A escolha das regiões foi realizada tendo em consideração o sucesso de amplificação dos vários marcadores incluídos nos PCR multiplex individuais, bem como a conjugação de tamanhos dos produtos de PCR de forma a obter um padrão de bandas identificadoras de cada vírus. Este multiplex foi testado em amostras de indivíduos co-infetados (duas HIV-1/HCV e uma HIV1/HBV) e em amostras de misturas artificiais de material genético dos diferentes vírus. Em todas as amostras foi possível a correta deteçao dos vírus presentes na mistura, com exceção de uma co-infeção HIV-1/HCV onde o HIV-1 não foi detetado, muito provavelmente devido à baixa carga viral deste vírus na amostra (41cópias/mL). Uma das grandes vantagens dos métodos propostos nesta dissertação é a localização dos primers em regiões genómicas conservadas (i.e., com poucos polimorfismos), o que permite a deteção de vários genótipos. No entanto, os vários marcadores testados têm diferentes eficácias de amplificação nas amostras testadas. Este facto poderá dever-se à extrema variabilidade genética presente nestes vírus (especialmente os de RNA, HIV-1 e HCV), às baixas cargas virais de algumas amostras (especialmente em infeções com HIV-1) ou resultar de outros fatores inerentes ao próprio PCR (por exemplo, interações entre primers). No entanto, a ausência de amplificação de alguns marcadores em algumas amostras não impediu a deteçao dos diferentes vírus. Mesmo que uma ou mais regiões não sejam amplificadas, uma correta deteção dos vírus é possível com os nossos PCR multiplex devido ao uso de vários marcadores em simultâneo, o que constitui uma vantagem em relação aos métodos que utilizam apenas um par de primers. Em conclusão, os métodos apresentados nesta dissertação são adequados para a identificação de HIV-1, HCV e HBV (separadamente ou em simultâneo) em casos de co-infeções ou quando não é adequado a utilização de testes serológicos (por exemplo, no período pré-seroconversão e em recém-nascidos). O PCR multiplex para a deteção de vários vírus na mesma reação facilita a análise de amostras em grande escala, ao permitir uma redução nos custos e no tempo de diagnóstico. Desta forma, estes PCR multiplex poderão ser usados em amostras obtidas em contexto clínico e em bancos de doação de sangue, aumentando o rigor da deteção e a rapidez na obtenção de resultados.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), hepatitis C virus (HCV) and hepatitis B virus (HBV) are a significant threat to public health worldwide. Several serological and nucleic acid assays are used for the correct detection of these viruses. However, most detection methods lack accuracy and are expensive and time-consuming. It is therefore of paramount importance to develop methods for the simultaneous identification of different viruses at low cost and with high accuracy. In this thesis, one multiplex PCR for the simultaneous identification of HIV-1, HCV and HBV and three multiplex PCRs for identification of each virus are described. A total of 33 primer pairs were designed in conserved genomic regions for detection of different genotypes. Primers were initially tested by singleplex PCR and five (for HIV-1 and HBV) and six (for HCV) primers pairs were selected for final multiplex PCRs. Because the target regions were selected with a unique combination of lengths, each virus can be identified by band pattern analysis. The reproducibility of the assays was tested in 70 plasma samples from infected individuals. All samples yielded positive amplifications, with 31.3 % (HIV-1), 50 % (HCV) and 33.3 % (HBV) of the samples amplified for all target regions. The multiplex PCR for simultaneous detection of the three viruses successfully identified 83.3 % of the co-infected samples. Finally, multiplex PCRs proved to be specific and had low detection limits: 343.75 copies/mL for HIV-1, 418.56 IU/mL for HCV and 19.92 IU/mL for HBV. The main advantages of these assays are the use of multiple targets (avoiding false-negative results), use of PCR primers designed in conserved genomic regions (increasing the specificity), use of low cost laboratory equipment and the suitability for identification of co-infections. Overall, these assays can be used for a rapid screening of samples in clinical diagnostic or blood banks.