Modelo in vitro de parkinsonismo experimental induzido por rotenona: investigação de mecanismos de ação, neuroproteção e morte celular

Evidências crescentes na literatura têm sugerido papel importante para os fatores ambientais, como a exposição a pesticidas, na patogênese da doença de Parkinson. Em animais experimentais, a exposição à rotenona, um pesticida e piscicida de uso comum, induz características de parkinsonismo através da inibição do complexo I mitocondrial. O objetivo deste estudo foi investigar a morte de neurônios induzida por rotenona utilizando culturas primárias mistas neurônio/glia derivadas de hipocampo e de mesencéfalo ventral de ratos, bem como o papel do Ca2+ na neste modelo experimental e a utilização de extrato aquoso de folhas de mogno com substâncias com alto poder antioxidante. A perda neuronal foi analisada com ensaios colorimétricos (MTT e LDH). Nossos resultados mostraram significativa redução na viabilidade celular após exposição à rotenona de maneira dependente de concentração, mas não dependente de tempo. Foi observada igual e elevada suscetibilidade em culturas mistas neurônio/glia derivadas de hipocampo e de mesencéfalo ventral ao agente neurotóxico. Em termos mecanicísticos, nossos resultados mostraram um papel discreto desempenhado pelo Ca2+ mitocondrial na neurodegeneração induzida por rotenona. Além disso, neste paradigma utilizado, verificamos que o extrato aquoso de folhas de mogno não promoveu proteção contra a toxicidade da rotenona, na concentração testada; ainda, promoveu efeito sinérgico em associação com rotenona. Verificou-se ainda que a rotenona, bem como o extrato de mogno promoveu indução de morte celular tanto por necrose quanto por apoptose, nas concentrações utilizadas. Os resultados deste estudo devem avançar nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação de fatores ambientais na patogênese da doença de Parkinson.

Encefalite viral induzida pelo vírus da dengue em camundongos suíços albinos: a resposta inflamatória do sistema nervoso central do hospedeiro neonato

Para estudar a resposta imune inata produzida especificamente no interior do SNC em desenvolvimento, evitando a influencia do sistema imune, empregamos modelo de infeccao viral induzida pela inoculacao intracerebral do virus da dengue em camundongos neonatos. Oito camundongos lactentes de dois dias de idade da espécie Mus musculus e variedade suica albina foram inoculados por via intracerebral com homogenado cerebral infectado com a especie Flavivirus (DENV3 genotipo III). Outro conjunto de animais foi utilizado como controle (nao infectado) e inoculado com igual volume de homogenado cerebral nao infectante e mantidos nas mesmas condicoes dos infectados. Decorridos 7 dias apos a infeccao os camundongos doentes foram sacrificados e tiveram seus cerebros processados para imunomarcacao de astrocitos e microglias. Quantificou-se a resposta imune glial no stratum lacunosum molecular (Lac Mol), radiatum (Rad) e pyramidale (Pir) de CA1-2 do hipocampo e na camada molecular do giro denteado (GDMol) usando o fracionador optico para estimar o numero de microglias e astrocitos em animais infectados e controles. Intensa astrocitose reativa e intensa ativacao microglial foram encontradas em animais neonatos com sinais clinicos de meningoencefalite. Entretanto, embora tenham sido maiores as estimativas do numero de microglias ativadas nos infectados (Inf) do que nos animais controles (Cont) nas camadas GDMol (Inf: 738,95 } 3,07; Cont: 232,73 } 70,38; p = 0,0035), Rad (Inf: 392,49 } 44,13; Cont: 62,76 } 15,86; p = 0,0004), em relacao ao numero total de microglias (ativadas ou nao) apenas o stratum radiatum mostrou diferença significante (Inf: 6.187,49 } 291,62; Cont: 4.011,89 } 509,73; p = 0,01). Por outro lado apenas a camada molecular do giro denteado mostrou diferenca no numero de astrocitos (Inf: 8.720,17 } 903,11; Cont: 13.023,13 } 1.192,14; p = 0,02). Tomados em conjunto os resultados sugerem que a resposta imune inata do camundongo neonato a encefalite induzida pelo virus da dengue (sorotipo 3, genotipo III) esta associada a um maior aumento do numero de microglias do que de astrocitos reativos e essa mudanca e dependente da camada e da regiao investigada. As implicacoes fisiopatologicas desses achados permanecem por ser investigadas.

Tratamento com minociclina e transplante intraestriatal de células mononucleares da medula óssea após acidente vascular experimental encefálico

Diversos estudos sugerem que a tetraciciclina semi-sintética minociciclina e o transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMOs) induzem neuroproteção em modelos experimentais de acidente vascular encefálico (AVENC). No entanto, poucos investigaram, comparativamente, os efeitos destas duas abordagens terapêuticas após AVENC induzido por microinjeções de endotelina – 1 (ET -1). Nesta dissertação, objetivou-se comparar os efeitos do bloqueio microglial com minociclina com os obtidos pelo transplante intraestriatal de CMMOs na fase aguda após acidente vascular encefálico experimental, sobre a área de lesão, neuroproteção, apoptose de recuperação funcional. Ratos machos adultos, da raça Wistar, pesando entre 250 e 350g, foram distribuídos em quatro grupos experimentais: controle (chamado de Salina) - isquêmico tratado com salina (N=4), isquêmico tratado com minociclina (N=4), isquêmico tratado com CMMOs (N=3) e doador de CMMOs (N=2). Testes comportamentais foram realizados em 1, 3 e 7 dias pós-isquemia para avaliar a recuperação funcional entre os grupos. Animais tratados com minociclina receberam 2 doses diárias de 50mg/kg nos 2 primeiros dias, e 5 aplicações únicas de 25mg/kg (i.p) nos dias subsequentes até o sexto dia após a indução isquêmica. 1x106 de CMMOs foram obtidas de ratos da mesma linhagem e transplantadas diretamente no estriato, 24h após a lesão isquêmica. Todos os animais foram perfundidos 7 dias após a indução isquêmica. Secções coronais foram coradas por violeta de cresila para análise histopatológica geral, e por imunohistoquímica para a identificação de corpos neuronais (neuN), microglia/macrófagos ativados (ED1) e células apoptóticas (Caspase-3). A análise histopatológica geral mostrou grande palor, perda tecidual e intensa ativação microglial/ macrofágica no estriato de animais tratados com solução salina estéril. O tratamento com CMMO foi mais eficaz do que a minociclina (P<0,05, ANOVA-Tukey) na redução do número de microglia/macrófagos ativados (salina 276,3 ± 9,3); CMMOs 133,8 ± 6,8) e minociclina 244,6 ± 7,1). CMMOs e minociclina reduziram a área de lesão, em 67,75% e 69,1%, respectivamente. Os dois tratamentos promoveram o mesmo nível de preservação neuronal (p< 0,05) em relação ao controle, 61,3 ± 1,5); 86,8 ± 3,4) e 81 ± 3,4). As CMMOs reduziram de forma mais eficaz (p<0,01) o número de células apoptóticas em relação à minociclina e grupo controle (26,5 ± 1,6); 13,1 ± 0,7) e 19,7 ± 1,1). Ambas as abordagens terapêuticas promoveram recuperação funcional dos animais isquêmicos. Os resultados sugerem que o tratamento com CMMOs é mais eficaz na modulação da resposta microglial e na diminuição da apoptose do que o tratamento com minociclina, apesar de ambos serem igualmente eficazes para indução da neuroproteção. Estudos futuros devem investigar se o tratamento com minociclina associado ao transplante de CMMOs produzem efeitos sinérgicos, o que poderia amplificar os níveis de neuroproteção observados.

Análise comparativa dos padrões neurodegenerativos da substância cinzenta em diferentes áreas corticais de ratos adultos submetidos à lesão isquêmica focal

O acidente vascular encefálico (AVE) pode ocorrer em qual região do Sistema Nervoso Central (SNC), sendo o córtex cerebral é uma das regiões mais frequentemente afetadas por essa desordem neural aguda, embora inexistam investigações que tenham comparado o padrão lesivo em diferentes regiões corticais após isquemia focal de mesma intensidade. O objetivo desta investigação foi avaliar o padrão degenerativo de diferentes áreas corticais após lesão isquêmica focal. Para isso, induziu-se isquemia focal por microinjeções estereotáxicas de endotelina-1 (ET-1) nos córtices somestésico, motor e de associação de ratos adultos (N=45). Nos animais controle injetou-se o mesmo volume de solução salina estéril (N=27). Os animais foram perfundidos 1, 3, e 7 dias após o evento isquêmico. O encéfalo foi removido, pós-fixado, crioprotegido e seccionado em criostato. A histopatologia geral foi avaliada em secções de 50 coradas pela violeta de cresila. Secções de 20μm foram submetidas à imunoistoquímica para marcação de astrócitos (anti-GFAP), micróglia/macrófagos ativados (anti-ED1) e microglia em geral (anti-Iba1). Avaliou-se os padrões lesivos qualitativamente (por inspeção em microscópio óptico) e quantitativamente (pela contagem do número de células nos lados ipsi e contralateral à lesão), pela estatística descritiva e comparações intra e intergrupos com análise de variância com correção a posteriori de Tukey. Os animais isquêmicos apresentaram conspícua perda tecidual, ativação microglial e astrocitose entre 3 e 7 dias após a indução isquêmica, o que não foi observado nos animais controle. A perda tecidual e a ativação de células gliais foram mais intensas no córtex somestésico, depois no córtex motor, com intensidade reduzida na área de associação, o que foi confirmado por análise quantitativa. Os resultados sugerem que uma lesão isquêmica de mesma intensidade induz um padrão diferencial de perda tecidual e neuroinflamação, dependendo da área cortical, e que as áreas sensoriais primárias e motoras são mais susceptíveis ao processo isquêmico do que áreas de associação.

Perda neuronal, ativação glial, neurogênese e alterações sensório-motoras após isquemia focal no córtex somestésico de ratos adultos

O Acidente vascular encefálico (AVE) é considerado uma das mais importantes causas de morte e perda funcional no mundo. Poucas condições neurológicas são tão complexas e devastadoras, provocando déficits neurológicos incapacitantes ou óbito nos sobreviventes. As regiões corticais são comumente afetadas por AVE, o que resulta em perda sensorial e motora. O estabelecimento dos padrões neuropatológicos em regiões corticais, incluindo a área somestésica, é fundamental para a investigação de possíveis intervenções terapêuticas. No presente estudo, investigamos os padrões de perda neuronal, microgliose, astrocitose, neurogênese e os déficits funcionais no córtex somestésico primário de ratos adultos, submetidos á lesões isquêmicas focais, induzidas por microinjeções de 40p Moles de endotelina-1 (ET-1). Foram utilizados 30 ratos (Rattus Norvegicus) da linhagem Wistar, adultos jovens, pesando entre 250-280g. Os animais foram divididos em grupos isquêmicos (N= 21) e controle (N=9). Os mesmos foram perfundidos nos tempos de sobrevida de 1, 3 e 7 dias. Os animais do grupo de 7 dias foram submetidos à testes comportamentais para avaliar a perda de função sensório-motora. Secções foram coradas pela violeta de cresila, citocromo oxidase e imunomarcadas para identificação neurônios (anti-NeuN), microglia ativada e não ativada (Iba-1), macrófagos/microglia ativados (ED-1), astrócitos (GFAP) e neuroblastos (DCX). As comparações estatísticas entre os grupos foram feitas por análise de variância (ANOVA), um critério com correção a posteriore de Tukey. Os animais isquêmicos apresentaram déficits sensório-motores revelados pela Escala Neurológica de Bederson, Teste de Colocação da Pata Anterior e Teste do Canto. Microinjeções de ET-1 induziram lesão isquêmica focal na área somestésica primária com perda neuronal, astrocitose e microgliose progressivas principalmente nos tempos mais tardios. A coloração para citocromo oxidase revelou o campo de barris, mas, inesperadamente, marcou uma população de células inflamatórias com características de macrófagos na região isquêmica. Houve aumento do número de neuroblastos, principalmente ao sétimo dia, na zona subventricular do hemisfério isquêmico, em relação ao hemisfério contralateral e animais controle. Não houve migração significativa de neuroblastos no córtex somestésico isquêmico. Os resultados mostram que microinjeções de ET-1 são um método eficaz para indução de perda tecidual e déficits sensoriais no córtex somestésico primário de ratos adultos. Também se evidencia que a zona subventricular é influenciada por eventos isquêmicos distantes e que populações macrofágicas parecem aumentar o padrão de expressão de citocromo oxidase. O referido modelo experimental pode ser utilizado em estudos futuros onde agentes neuroprotetores em potencial podem ser utilizados para minimizar as alterações neuropatológicas descritas.

Avaliação neuropatológica da lesão estriatal em ratos machos e fêmeas da linhagem lister hooded induzida experimentalmente por microinjeções de endotelina-1

A resposta inflamatória pode exacerbar o processo lesivo após desordens neurais agudas. O dimorfismo sexual gerado pelas diferentes presenças hormonais existentes entre macho e fêmea têm demonstrado habilidades neuroprotetoras endógenas opostas, apresentando uma melhor preservação da integridade do tecido nervoso na fêmea, putativamente, devido à presença dos hormônios ginógenos. Não existem investigações comparando como essa diferença pode afetar a resposta inflamatória durante o AVE. No presente estudo, investigaram-se as diferenças nos processos inflamatórios agudos do dimorfismo sexual de ratos adultos, de ambos os sexos, submetidos à lesão isquêmica aguda induzida por Endotelina (ET1) no corpo estriado. Seis grupos experimentais foram delineados: Animais machos de 24 horas de sobrevida (n= 8); machos de 72 horas de sobrevida de (n=8); machos de 7 dias de sobrevida (n=8); e fêmeas de 24 horas de sobrevida (n= 8); fêmeas de 72 horas de sobrevida de(n=8); fêmeas de 7 dias de sobrevida. A análise histopatológica geral foi realizada em secções coradas pela violeta de cresila. Macrófagos, astrócitos e neurônios foram identificados por imuno-histoquímica com anticorpos específicos para estas células inflamatórias (ED1, anti-GFAP e Anti-NeuN, respectivamente). Realizou-se contagem de micróglia/macrófagos ativados e corpos neuronais nos grupos experimentais mencionados. Não se notou diferença quantitativa entre os diferentes sexos, contudo houve uma aparente queda na quantidade de macrófagos/micróglia em 3 dias, tanto para os machos quanto para as fêmeas, apresentando alguma diferença na ativação astrocitária mais forte em machos. Os resultados sugerem que as diferenças sexuais na linhagem Lister Hooded, não são suficientes para causar diferenças significativas na preservação do tecido nervoso e em alguns aspectos da resposta inflamatória após a indução de isquemia cerebral por meio de ET1.

Estudo das alterações neuropatológicas e do comportamento em tarefas hipocampo-dependentes induzidas pela encefalite experimental aguda associada ao vírus piry

Este trabalho investiga as alterações neuropatológicas e do comportamento em tarefas hipocampo-dependentes induzidas pela encefalite experimental aguda associada ao vírus Piry. Três janelas temporais (3, 7 e 10 dias após a inoculação) foram avaliadas e dois ambientes testados de forma a avaliar se o enriquecimento ambiental influencia as alterações associadas à infecção. Camundongos fêmeas de dois meses de idade foram mantidos em ambientes empobrecido (IE) ou enriquecido (EE) durante seis meses e foram testados para as atividades de burrowing, de campo aberto e de discriminação olfatória. Após esse período os animais foram inoculados por via intranasal com 5μl de homogenado de cérebro normal (NBH) ou homogenado de cérebro infectado pelo vírus Piry (PY) e então reorganizados nos seguintes grupos: IENBH, IEPY, EENBH e EEPY, com sete animais cada. Três, sete e dez dias após a inoculação (dpi), os animais de cada janela temporal foram perfundidos com fixador aldeídico. Os encéfalos foram removidos, seccionados e as secções foram processadas para imunohistoquímica para anti-Piry e para anti-Iba-1 para marcação dos antígenos virais e de macrófagos/micróglias, respectivamente. Quantificações estereológicas foram feitas em cada camada celular de CA3 usando o método do fracionador óptico. Estimativas do fracionador óptico mostraram que não houve alteração da estimativa do número total de micróglias em CA3 nos grupos analisados, indicando que a infecção não alterou o número de células, mas a morfologia das micróglias, que se mostraram mais ativadas no grupo IEPY do que no grupo EEPY. Os resultados revelaram a presença de antígenos virais no bulbo olfatório, córtex piriforme, estriado e fimbria, ao longo da via olfatória. A atividade de burrowing no grupo IEPY diminuiu na primeira janela temporal e permaneceu baixa até a última janela, enquanto que no grupo EEPY não houve alteração neste teste. Na atividade de campo aberto, o grupo IEPY aumentou o tempo imóvel já na primeira janela e continuou aumentando até a última; reduziu o número de linhas cruzadas na segunda janela e permaneceu reduzido na última; e diminuiu o tempo na zona central na segunda e última janela. Já o grupo EEPY, aumentou o tempo imóvel e reduziu o número de linhas cruzadas na segunda janela. No teste de discriminação olfatória, o principal grupo afetado foi o grupo IEPY, que não discriminou os dois odores na última janela, enquanto que o grupo EEPY não teve alteração na discriminação.

Influência do tamanho da ninhada sobre o declínio cognitivo e a morfologia microglial da camada molecular do giro denteado em rattus novergicus

Tem sido proposto que o envelhecimento está associado à alteração inflamatória no sistema nervoso central de roedores, mas não se sabe se as mudanças microgliais induzidas pelo envelhecimento são afetadas pelo ambiente pós-natal associado ao tamanho da ninhada. Por outro lado a camada molecular do giro denteado tem sido reconhecida como o alvo principal do input da via perfurante cuja integridade sináptica é essencial para formação de memória da identidade e da localização espacial de objetos. No presente trabalho investigamos se as mudanças morfológicas microgliais induzidas pelo envelhecimento são influenciadas por mudanças no tamanho da ninhada no início da vida. Para avaliar essas questões, ratos da variedade Wistar amamentados em ninhadas de 6 ou 12 filhotes por nutriz foram mantidos sedentários em grupos de 2-3 do 21o dia pós-natal em diante. Aos 4 (adulto) ou aos 23 (velho) meses de idade, os animais foram submetidos a testes de memória espacial e de reconhecimento da forma de objetos, sacrificados, perfundidos com fixador aldeídico e tiveram seus cérebros processados para imunomarcação seletiva para microglias/macrófagos com anticorpo anti Iba-1. A seguir uma fração representativa das células imunomarcadas da camada molecular do giro denteado foi reconstruída em três dimensões usando o programa Neurolucida e as características morfológicas de cada célula foram quantificadas com o software Neuroexplorer. Foi encontrado que os animais mantidos em gaiolas padrão de laboratório durante toda a vida apresentaram déficits de memória espacial independente da idade e não importando o tamanho da ninhada. Por outro lado todos os indivíduos idosos não importando o tamanho da ninhada tiveram sua memória de reconhecimento de objeto prejudicada. A análise da morfologia microglial revelou que a área e o perímetro do corpo celular e o volume dos ramos parecem ser afetados mais intensamente pelo envelhecimento e que essa alteração é mais acentuada nos animais de ninhada grande. Além disso, observou-se retração e espessamento dos ramos nos animais velhos em maior proporção nos animais de ninhadas grandes. Tomados em conjunto os resultados sugerem que a memória espacial parece ser mais suscetível ao processo de envelhecimento do que a memória de reconhecimento de objeto e que essas mudanças estão associadas a efeitos distintos sobre o soma e o padrão de ramificação das microglias da camada molecular dos animais maduros e idosos.

Neurodegeneração crônica em modelo murino: ensaios comportamentais e neuropatológicos na doença prion em fêmeas adultas de camundongos albinos suíços

No presente trabalho implantou-se como modelo experimental para estudos de neurodegeneração crônica a doença prion induzida pelo agente ME7 em fêmea adulta no camundongo Suíço albino. As alterações comportamentais e neuropatológicas seguem de perto as previamente descritas para o camundongo C57BL/6j com duas exceções: 1) o septum ao invés do hipocampo é a região onde se detectou mais precocemente o maior número de microglias ativadas e astrócitos reativos e onde houve a maior redução de redes perineuronais nos estágios iniciais da doença; 2) Em relação ao C57BL/6j o curso temporal da doença é em média 4 semanas mais longo (26 semanas) e os sintomas iniciais começam a aparecer 4 semanas mais tarde (16 semanas) na variedade Suíça albina. Semelhante ao encontrado no C57BL/6j não se encontrou diferença nas estimativas do número de neurônios nos animais inoculados com o agente ME7 em relação aos inoculados com homogenado cerebral normal 15 e 1 8 semanas após a inoculação. A análise comparada do número de microglias ativadas astrócitos reativos e redes perineuronais empregando o fracionador óptico revelou diferenças significativas nos animais sacrificados na 15ª em relação aos sacrificados na 18ª semana pós-inoculação, com aumento do número das primeiras e redução do número das últimas na 18ª semana (teste T, bi-caudal p<0.05). A análise de cluster seguida da análise discriminante dos resultados dos testes comportamentais da variedade Suíça albina aplicada a cada quinzena ao longo do curso temporal da doença, revelou que a remoção de comida é a única variável discriminante para detecção de dois grupos distintos: um grupo menor (em torno de 40%, n=4), mais sensível, onde a doença cursa mais rápido e os animais atingem a fase terminal em 22 semanas, e outro maior (em torno de 60%, n=6), menos sensível, onde os animais atingem a fase terminal em 26 semanas. Os resultados são importantes para estudos comparativos de imunopatologia dentro da mesma e entre variedades de modelos murinos de neurodegeneração crônica na doença prion induzida pelo agente ME7.

Ensaios estereológicos e morfologia tridimensional na formação hipocampal de aves migratórias marinhas: análise quantitativa da imunomarcação seletiva de neurônios e micróglia em Calidris pusilla e Actitis macularia

É objetivo do presente trabalho implantar como modelos para estudo da formação hipocampal das aves migratórias as espécies de maçarico Calidris pusilla e Actitis macularia que abandonam as regiões geladas do Canadá, fugindo do inverno, em direção à costa da América do Sul e do Caribe onde permanecem até a primavera quando então retornam ao hemisfério norte. Mais especificamente pretende-se descrever a organização morfológica qualitativa e quantitativa da formação hipocampal, empregando citoarquitetonia com cresil violeta e imunomarcação para neurônios e células da glia, sucedidas por estimativas estereológicas do número total de células identificadas com marcadores seletivos para aquelas células, assim como comparar a morfologia tridimensional da micróglia das aves com a dos mamíferos. As coletas de campo para a caracterização da formação hipocampal do Calidris pusilla e Actitis macularia em seus aspectos morfológicos foram feitas no Brasil na Ilha Canelas (0°47'21.95"S e 46°43'7.34"W) na Costa da Região Nordeste do Pará no município de Bragança, e no Canadá, na Baia de Fundy perto de Johnson's Mills na cidade de New Brunswick (45°50'19.3" N 64°31'5.39" W). A definição dos limites da formação hipocampal foi feita empregando-se as técnicas de Nissl e de imunomarcação para NeuN. Para a definição dos objetos de interesse das estimativas estereológicas e das reconstruções tridimensionais empregou-se imunomarcação com anticorpo anti-NeuN para neurônios e anti-IBA- 1 para micróglia. As estimativas estereológicas revelaram em média número similar de neurônios nas duas espécies enquanto que no hipocampo de Actitis macularia observou-se número de micróglias 37% maior do que no de Calidris pusilla. Além disso, encontrou-se que em média o volume da formação hipocampal do Actitis macularia é 38% maior do que o encontrado em Calidris pusilla. Os estudos comparativos da morfologia microglial das duas espécies de aves com a dos mamíferos Rattus novergicus e Cebus apella revelaram diferenças morfológicas significantes que indicam que as micróglias das aves mostram em média, menor complexidade (dimensão fractal), tem diâmetros e perímetros de soma menores e possuem ramos mais finos do que aquelas do rato e do macaco.

Memória espacial e morfometria tridimensional da micróglia de CA1 e do giro denteado do Cebus apella

O presente trabalho tem o intuito de Investigar possíveis correlações entre a morfologia da micróglia do hipocampo e giro denteado e o desempenho cognitivo individual em teste de memória espacial no Cebus apella. Devido ao bom desempenho do Cebus apella em tarefas cognitivas hipocampo-dependentes, utilizou-se testes selecionados da Bateria Cambridge de Testes Neuropsicológicos (CANTAB) utilizada previamente com sucesso tanto em primatas do Velho Mundo quanto em humanos. Empregou-se o teste motor de adaptação a tela para checar a adaptação dos indivíduos à tela sensível ao toque e o teste de aprendizado pareado (TAP) para avaliar aprendizado e memória espacial. Para o estudo da correlação entre o desempenho individual no TAP da bateria CANTAB e a morfologia da micróglia, foi necessário reconstruir e analisar parâmetros morfométricos selecionados a partir de micróglias reconstruídas dos terços médio e externo da camada molecular do giro denteado e do lacunosum molecular de CA1, empregando microscopia tridimensional. A definição dos limites da formação hipocampal foi feita empregando-se critérios arquitetônicos previamente definidos. Para imunomarcação seletiva de micróglias foi utilizado o anticorpo policlonal (anti-Iba1) dirigido contra a proteína adaptadora ligante de cálcio ionizado Iba-1. A partir de procedimentos de estatística multivariada identificou-se a ocorrência de agrupamentos microgliais baseados em parâmetros morfométricos que permitiram a distinção de pelo menos dois grandes grupos microgliais em todos os indivíduos. Os resultados comportamentais expressos em taxa de aprendizado e alguns dos parâmetros morfométricos da micróglia dos terços externo e médio da camada molecular do giro denteado revelaram significativas correlações, lineares e não lineares. Em contraste, nenhuma correlação dessa natureza foi encontrada no lacunosum molecular de CA1. Nós sugerimos baseado no presente e em trabalhos anteriores que a correlação entre desempenho cognitivo e a complexidade estrutural da glia não é um atributo exclusivo dos astrócitos e que a morfologia da micróglia da camada molecular do giro denteado pode estar associada ainda que de forma indireta ao desempenho individual em testes de memória espacial.

Estudo da neuropatologia induzida pelo vírus Marabá em modelo murino

O vírus Marabá (Be AR 411459) é um Vesiculovírus (VSV), membro da família Rhabdoviridae, isolado em 1983, de um pool de flebotomíneos capturado em Marabá-PA pela Seção de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas. Na literatura pouco se tem sobre neuropatologia experimental induzida pelo vírus Marabá, apesar dos 30 anos de isolamento. Um único estudo, porém, revelou que a infecção viral em camundongos recém-nascidos provoca necrose e picnose em neurônios em várias regiões do sistema nervoso central (SNC) O objetivo do presente trabalho foi investigar a distribuição do vírus Marabá no SNC, a ativação microglial e astrocitária, aspectos histopatológicos; e a expressão de citocinas e óxido nítrico (NO), na encefalite induzida pelo vírus Marabá em camundongo BALB/c adultos. Para tanto, foram realizados processamentos de amostras para análise histopatologica; immunohistoquímica para marcação de microglia, astrócitos e antígeno viral; testes de quantificação de citocinas e NO; e análises estatísticas. Os resultados demonstraram que os animais infectados (Ai) 3 dias após a inoculação (d.p.i.) apresentam discreta marcação do antígeno viral, bem como quanto a ativação de microglia e astrócitos no SNC. Por outro lado, nos Ai 6 d.p.i. a marcação do antígeno viral foi observada em quase todas regiões encefálicas, observando-se intensa ativação microglial nestes locais, embora a astrogliose tenha sido menor. Edema, necrose e apoptose de neurônios foram observados principalmente no bulbo olfatório, septo interventrícular e córtex frontal dos Ai 6 d.p.i. A quantificação dos níveis de IL-12p40, IL-10, IL-6, TNF- α, INF-ү, MCP-1 e de NO mostrou aumentos significativos nos Ai 6 d.p.i., quando comparados aos animais controles e Ai 3 d.p.i.. Por outro lado, os níveis de TGF-β, importante imunossupressor, não foi significativo em todos os grupos e tempos avaliados (3 e 6 d.p.i.). Estes resultados indicam que o vírus Marabá pode infectar diversas regiões do SNC de camundongo BALB/c adulto 6 d.p.i., produzindo alterações anátomo-patológicas e uma forte resposta imune inflamatória que pode ser letal para o animal.

Influências do tamanho da ninhada e da atividade física sobre a plasticidade glial na formação hipocampal em modelo murino

Estudos anteriores demonstraram efeitos importantes do estresse perinatal no desempenho cognitivo na vida adulta e durante o envelhecimento. Entretanto permanece por ser estudado em detalhe como o exercício físico em diferentes fases da vida contribui para reduzir esses déficits. Isso é particularmente verdadeiro quando se trata de documentar as alterações da matriz extracelular e das células da glia, largamente ignoradas nesses estudos. Assim o objetivo geral do presente trabalho é o de investigar as possíveis influências do tamanho da ninhada e da atividade física sobre a memória de reconhecimento de objetos na vida adulta e possíveis alterações associadas à plasticidade glial e da matriz extracelular da formação hipocampal em modelo murino. Para alcançar esses objetivos alteramos o tamanho da ninhada de ratos Wistar de modo a acentuar o grau de competição entre os filhotes por tetas funcionais e diminuir a quantidade de cuidado materno por indivíduo. Durante o período de aleitamento quantificamos o cuidado materno em ninhadas de diferentes tamanhos. Em várias janelas temporais submetemos grupos selecionados de sujeitos ao exercício em esteira durante 5 semanas adotando o mesmo protocolo de treinamento. Após o exercício alguns grupos de animais adultos e senis foram submetidos ao teste de memória de reconhecimento de objetos que é dependente do hipocampo, sendo sacrificados e processados para imunohistoquímica seletiva para micróglia. Outros grupos de animais adultos não submetidos aos testes comportamentais foram igualmente sacrificados sendo um dos hemisférios empregado para registro de parâmetros difusionais no hipocampo enquanto que o outro foi empregado para imunohistoquímicas seletivas para astrócitos, células NG2 e reelina. Encontramos que o aumento do tamanho da ninhada está relacionado à redução do cuidado materno, ao declínio cognitivo, à proliferação e alteração da morfologia microglial, astrocitária e de células NG2 positivas, assim como às alterações nos padrões de difusão encontradas no tecido hipocampal. Além disso que tais alterações podem ser revertidas pelo menos de forma parcial pela atividade física e que esse efeito é tanto maior quanto mais jovem é o sujeito. O envelhecimento agrava as alterações morfológicas microgliais induzidas pelo aumento do tamanho da ninhada e reduz o desempenho nos testes de memória de reconhecimento de objeto. Os mecanismos moleculares associados a esses efeitos permanecem por ser investigados.

Atividade antiinflamatória e neuroprotetora da Edaravona no córtex sensóriomotor primário de ratos adultos submetidos à isquemia focal experimental

O acidente vascular encefálico (AVENC) é uma desordem neural iniciada a partir da redução ou interrupção do fluxo sanguíneo, tornando inadequada a demanda energética para a região, promovendo assim um dano tecidual. O AVENC é classificado em hemorrágico ou isquêmico. O AVENC isquêmico tem maior prevalência e pode ocorrer por trombose ou embolismo. A patologia isquêmica tem múltiplos eventos interrelacionados como excitotoxicidade, despolarização periinfarto, estresse oxidativo e nitrosativo, inflamação e apoptose. Um elemento de fundamental importância na patologia isquêmica é a célula microglial, cuja atividade está intimamente ligada à progressão do ambiente lesivo. Uma alternativa terapêutica no tratamento do AVENC é um pirazolona denominada Edaravona. O presente trabalho avaliou a o efeito neuroprotetor da Edaravona na dose de 3mg/kg no córtex sensóriomotor primário após lesão isquêmica focal. A indução isquêmica foi induzida através da administração de 40pM do peptídeo vasoconstritor endotelina 1 diretamente sobre o córtex sensóriomotor primário. Foram avaliados animais tratados com Edaravona (N=10) e animais tratados com Água Destilada (N=10) nos tempos de sobrevida 1 e 7 dias após o evento isquêmico. O tratamento com edaravona evidenciou através da análise histopatológica com violeta de cresila uma redução de 49% e 66% na área de infarto nos animais nos tempo de sobrevida 1 e 7 dias respectivamente. Os estudos imunohistoquímicos para micróglia/macrófagos ativos (ED1⁺) demostraram uma redução na presença de células ED1⁺ em 35% e 41% para os tempos de sobrevida 1 e 7 dias respectivamente. A redução na presença de neutrófilos (MBS-1⁺) foi significativa apenas nos animais com tempo de sobrevida de 24h onde se observou a redução em 56% na presença dessas células. A análise estatística foi feita por análise de variância com correção a posteriori de Tukey com p <0,05.

Influências do envelhecimento e do ambiente sobre a progressão da encefalite experimental por arbovírus Piry em modelo murino: mudanças morfológicas microgliais e alterações comportamentais

O enriquecimento ambiental e os efeitos do envelhecimento sobre as alterações morfológicas das micróglias e no comportamento foram investigados em modelo murino de encefalite sub-letal por arbovírus. Para medir possíveis influências da idade e do ambiente sobre a progressão da encefalite, camundongos suíços albinos fêmeas de 2 meses de idade foram mantidos em Ambiente Padrão (AP) ou em Ambiente Enriquecido (AE), durante: 6 meses (Adulto - A) e 16 meses (Senil –S). Após os testes comportamentais, os camundongos A e S foram inoculados intranasalmente com igual volume de homogenado de cérebro de camundongo infectado pelo vírus Piry (Py) ou homogenado de cérebro de camundongo normal. Oito dias após a inoculação (8DPI), quando os primeiros testes comportamentais revelaram as alterações relacionadas à doença, os cérebros foram seccionados e inumomarcados seletivamente para IBA-1 e antígenos virais. Aos 20 ou 40DPI, os animais restantes foram testados comportamentalmente e processados para os mesmos marcadores e nenhum sinal neuropatológico foi detectado. Em camundongos adultos infectados o ambiente padrão (APPyA), a atividade de burrowing diminuiu e se recuperou rapidamente (8-10DPI), a atividade de campo aberto (20-40DPI), mas manteve-se inalterado em animais da mesma idade e de ambiente enriquecido (AEPyA). Em contraste animais senis tanto de ambiente enriquecido (AEPyS) quanto de ambiente empobrecido (APPyS) reduzem significativamente a atividade de burrowing em todas janelas. A encefalite causada pelo virus Piry, induziu perdas olfativas transitórias em animais APPyA e AEPyA, mas permanents em APPyS e AEPyS. A imunomarcação para os antígenos viral do Piry atingiram seu pico no parênquima do SNC aos 5 e 6DPI e desapareceu aos 8DPI. Todas as reconstruções tridimensionais das micróglias, foram realizadas aos 8DPI. Mudanças Microgliais foram significativamente mais graves em camundongos adultos do que em camundongos senis, mas os animais AE parecem recuperar a morfologia microglia homeostática mais cedo do que os animais de AP. Os efeitos benéficos do AE foram menores em camundongos envelhecidos.