Tratamento com minociclina e transplante intraestriatal de células mononucleares da medula óssea após acidente vascular experimental encefálico

Diversos estudos sugerem que a tetraciciclina semi-sintética minociciclina e o transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMOs) induzem neuroproteção em modelos experimentais de acidente vascular encefálico (AVENC). No entanto, poucos investigaram, comparativamente, os efeitos destas duas abordagens terapêuticas após AVENC induzido por microinjeções de endotelina – 1 (ET -1). Nesta dissertação, objetivou-se comparar os efeitos do bloqueio microglial com minociclina com os obtidos pelo transplante intraestriatal de CMMOs na fase aguda após acidente vascular encefálico experimental, sobre a área de lesão, neuroproteção, apoptose de recuperação funcional. Ratos machos adultos, da raça Wistar, pesando entre 250 e 350g, foram distribuídos em quatro grupos experimentais: controle (chamado de Salina) - isquêmico tratado com salina (N=4), isquêmico tratado com minociclina (N=4), isquêmico tratado com CMMOs (N=3) e doador de CMMOs (N=2). Testes comportamentais foram realizados em 1, 3 e 7 dias pós-isquemia para avaliar a recuperação funcional entre os grupos. Animais tratados com minociclina receberam 2 doses diárias de 50mg/kg nos 2 primeiros dias, e 5 aplicações únicas de 25mg/kg (i.p) nos dias subsequentes até o sexto dia após a indução isquêmica. 1x106 de CMMOs foram obtidas de ratos da mesma linhagem e transplantadas diretamente no estriato, 24h após a lesão isquêmica. Todos os animais foram perfundidos 7 dias após a indução isquêmica. Secções coronais foram coradas por violeta de cresila para análise histopatológica geral, e por imunohistoquímica para a identificação de corpos neuronais (neuN), microglia/macrófagos ativados (ED1) e células apoptóticas (Caspase-3). A análise histopatológica geral mostrou grande palor, perda tecidual e intensa ativação microglial/ macrofágica no estriato de animais tratados com solução salina estéril. O tratamento com CMMO foi mais eficaz do que a minociclina (P<0,05, ANOVA-Tukey) na redução do número de microglia/macrófagos ativados (salina 276,3 ± 9,3); CMMOs 133,8 ± 6,8) e minociclina 244,6 ± 7,1). CMMOs e minociclina reduziram a área de lesão, em 67,75% e 69,1%, respectivamente. Os dois tratamentos promoveram o mesmo nível de preservação neuronal (p< 0,05) em relação ao controle, 61,3 ± 1,5); 86,8 ± 3,4) e 81 ± 3,4). As CMMOs reduziram de forma mais eficaz (p<0,01) o número de células apoptóticas em relação à minociclina e grupo controle (26,5 ± 1,6); 13,1 ± 0,7) e 19,7 ± 1,1). Ambas as abordagens terapêuticas promoveram recuperação funcional dos animais isquêmicos. Os resultados sugerem que o tratamento com CMMOs é mais eficaz na modulação da resposta microglial e na diminuição da apoptose do que o tratamento com minociclina, apesar de ambos serem igualmente eficazes para indução da neuroproteção. Estudos futuros devem investigar se o tratamento com minociclina associado ao transplante de CMMOs produzem efeitos sinérgicos, o que poderia amplificar os níveis de neuroproteção observados.

ABSTRACT: Several studies suggest that both the semi-synthetic tetracycline minocycline and mononuclear bone marrow cell (BMMCs) transplantation induce neuroprotection in experimental models of stroke. However, a few studies comparatively investigated the effects of these therapeutic approaches following endothelin-1 (ET-1)-induced stroke. In this dissertation, we aimed at investigating the comparative effects of microglial inhibition with minocycline and BMMC transplantation in the acute phase of experimental stroke. Male adult Wistar rats were divided in four experimental groups: saline-treated (N=4), minocyclinetreated (N=4), BMMC-treated (N=4). Behavioral tests were performed at 1, 3 and 7 days post-ischemia to evaluate functional recovery between groups. Animals treated with minocycline received two 50mg/kg (i.p.) doses in the first two days plus five single 25mg/kg (i.p.) daily doses up to sixth days post-ischemia. 1x106 BMMCs were obtained from Wistar rats and directly transplanted into the striatum at 24h post-ischemia. Animals were perfused at 7 days after ischemia onset. Coronal sections were stained with cresyl violet for gross histopathological analysis and immunolabeled for identification of neuronal bodies (NeuN), activated microglia/macrophages (ED1) and apoptotic cells (active caspase-3). Gross histopathological analysis revealed pallor, tissue loss and intense microglial/macrophage activation in ischemic animals treated with sterile saline. BMMC transplantation induced a higher reduction (p<0.05, ANOVA-Tukey) in the number of ED1+ cells than (saline, 276, 3± 9,3;BMMCs, 133,8± 6,8; minocycline, 244,6 ± 7,1). BMMC transplantation and minocycline reduced the infarct area, compared to control, in about 67,75% and 69,1%, respectively, with no statistical differences between treatments (p>0.05). Both treatments afforded comparable levels (p>0.05) of neuronal preservation compared to control (61,3± 1,5; 86,8± 3,4; 81±3,4). BMMC treatment induce a higher decrease in the number of apoptotic cells compared to control and minocycline treatment (26,5± 1,6; 13,1± 0,7; 19,7± 1,1). Both therapeutic approaches improved functional recovery in the ischemic animals. The results suggest that BMMC transplantation is more effective in modulating microglial activation and reducing apoptic cell death than minocycline, although both treatments are equally efficacious on improving neuronal preservation. Future studies should investigate whether minocycline treatment concomitant with BMMC transplantation produces synergistic effects, which might improve neuroprotection.