Searching biocompounds in marine natural extracts with potential use in tumor prevention and treatment

Cancer is a multistage process characterized by three stages: initiation, promotion and progression; and is one of the major killers worldwide. Oxidative stress acts as initiator in tumorigenesis; chronic inflammation promotes cancer; and apoptosis inactivation is an issue in cancer progression. In this study, it was investigated the antioxidant, antiinflammatory and antitumor properties of hexane, ether, chloroform, methanol and water extracts of five species of halophytes: A. macrostachyum, P. coronopus, J. acutus, C. edulis and A. halimus. Antioxidant activity was assessed by DPPH• and ABTS•+ methods, and the total phenolics content (TPC) was evaluated by the Folin-Ciocalteau method. The anti-inflammatory activity of the extracts was determined by the Griess method, and by evaluating the inhibition of NO production in LPS-stimulated RAW- 264.7 macrophages. The cytotoxic activity of the extracts against HepG2 and THP1 cell lines was estimated by the MTT assay, and the results obtained were further compared with the S17 non-tumor cell line. The induction of apoptosis of J. acutus ether extract was assessed by DAPI staining. The highest antioxidant activities was observed in C. edulis methanol and the J. acutus ether extracts against the DPPH• radical; and J. acutus ether and A. halimus ether extracts against the ABTS•+ radical. The methanol extracts of C. edulis and P. coronopus, and the ether extract of J. acutus revealed a high TPC. Generally the antioxidant activity had no correlation with the TPC. The A. halimus chloroform and P. coronopus hexane extracts demonstrated ability to reduce NO production in macrophages (> 50%), revealing their anti-inflammatory capacity. The ether extract of J. acutus showed high cytotoxicity against HepG2 cancer cells, with reduced cellular viability even at the lowest concentrations. This outcome was significantly lower than the obtained with the non-tumor cells (S17). This result was complemented by the induction of apoptosis.

The activity of mouse Cerberus like 2 during cardiogenesis - genetic and morphogenetic studies

Cardiogenesis is a delicate and complex process that requires the coordination of an intricate network of pathways and the different cell types. Therefore, understanding heart development at the morphogenetic level is an essential requirement to uncover the causes of congenital heart disease and to provide insight for disease therapies. Mouse Cerberus like 2 (Cerl2) has been defined as a Nodal antagonist in the node with an important role in the Left-Right (L/R) axis establishment, at the early embryonic development. As expected, Cerl2 knockout mice (Cerl2-/-) showed multiple laterality defects with associated cardiac failure. In order to identify the endogenous role of Cerl2 during heart formation independent of its described functions in the node, we accurately analyzed animals where laterality defects were not present. We thereby unravel the consequences of Cerl2 lossof- function in the heart, namely increased left ventricular thickness due to hyperplasia of cardiomyocytes and de-regulated expression of cardiac genes. Furthermore, the Cerl2 mutant neonates present impaired cardiac function. Once that the cardiac expression of Cerl2 is mostly observed in the left ventricle until around midgestration, this result suggest a specific regulatory role of Cerl2 during the formation of the left ventricular myoarchitecture. Here, we present two possible molecular mechanisms underlying the cardiac Cerl2 function, the regulation of Cerl2 antagonist in activation of the TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 signaling identified by increased Smad2 phosphorilation in Cerl2-/- hearts and the negative feedback between Cerl2 and Wnt/ß-catenin signaling in heart formation. In this work and since embryonic stem cells derived from 129 mice strain is extensively used to produce targeted mutants, we also present echocardiographic reference values to progressive use of juveniles and young adult 129/Sv strain in cardiac studies. In addition, we investigate the cardiac physiology of the surviving Cerl2 mutants in 129/Sv background over time through a follow-up study using echocardiographic analysis. Our results revealed that Cerl2-/- mice are able to improve and maintain the diastolic and most of systolic cardiac physiologic parameters as analyzed until young adult age. Since Cerl2 is no longer expressed in the postnatal heart, we suggest that an intrinsic and compensatory mechanism of adaptation may be active for recovering the decreased cardiac function found in Cerl2 mutant neonates. Altogether, these data highlight the role of Cerl2 during embryonic heart development in mice. Furthermore, we also suggest that Cerl2-/- may be an interesting model to uncover the molecular, cellular and physiological mechanisms behind the improvement of the cardiac function, contributing to the development of therapeutic approaches to treat heart failures.

The role of lymphotoxin-B receptor signaling in t-cell acute lymphoblastic leukemia development

Dissertação de mest., Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

Identification of genes regulated by mir-363*, a regulator of bone marrow endothelial cell properties

As células estaminais hematopoiéticas residem na medula óssea e possuem capacidade para se auto-renovar e dar origem a todos os tipos de células sanguíneas. O endotélio da medula óssea é constituído por células endoteliais de medula óssea (BMEC) e compreende dois nichos com funções distintas: o nicho osteoblástico e o nicho vascular. O nicho osteoblásctico proporciona condições para a quiescência de células estaminais hematopoiéticas, enquanto no nicho vascular ocorre proliferação e diferenciação das mesmas. Quando ocorre um desequilíbrio na expressão de genes que codificam para proteínas envolvidas na mobilização de células do nicho osteoblástico para o nicho vascular – factores angiócrinos – ocorre uma desestabilização do microambiente medular, que se pode traduzir num processo tumoral. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes, de cadeia simples, que regula a expressão génica. Os miRNAs são sequências endógenas de RNA que possuem entre 19 e 25 nucleótidos de tamanho. Os miRNAs são reguladores da expressão genica, induzindo o silenciamento a nível da pós-transcrição, através da sua ligação com uma sequência específica para a qual possuem afinidade, na região 3’ não traduzida (3’ UTR) dos seus mRNA alvo, conduzindo à inibição da tradução ou à sua degradação. Os miRNAs estão envolvidos na regulação de genes de diversas vias afectando processos fundamentais como hematopoiese, apoptose, proliferação celular e tumorigénese. Os níveis de expressão dos miRNAs estão alterados no cancro, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Os perfis dos níveis de expressão de vários miRNAs foram estudados, tendo-se verificado que se alteram durante o processo de carcinogénese, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Apesar do miR-363* estar envolvido na regulação da expressão de genes que regulam propriedades das células endoteliais e medula óssea, os genes sobre os quais exerce a sua função ainda não foram identificados.O objectivo do presente estudo é a identificação dos genes directamente regulados pelo miR-363* (genes alvo) e a sua relevância para a disfunção medular e a sua caracterização nos síndromes mielodisplásicos. A estratégia usada baseou-se na redução ou aumento forçados dos níveis de miR-363* em células endoteliais e subsequente análise da expressão génica através de microarrays de cDNA do genoma humano. A redução do miR-363* vai implicar o aumento da expressão dos seus genes alvo, assim como o aumento dos níveis do miR-363* vai induzir a degradação e consequente redução dos seus genes alvos. A intersecção dos dados gerados através do estudo da expressão com bases de dados que possuem algoritmos para previsão de genes alvo directos dos miRNAs (miRBase e MicroCosm Targets) permitiu restringir os genes a analisar a sete genes, nomeadamente BST1, ESAM, FCER1G, IKBKG, SELE, THBS3 e TIMP1. A interacção directa destes candidatos a alvos directos do miR-363* foi posteriormente validada. Para tal, as 3’UTR dos genes foram clonadas num vector que contém o gene da luciferase. Uma vez as clonagens realizadas, efectuaram-se ensaios funcionais em células endoteliais, nomeadamente HUVEC, nas quais se co-transfectaram os vectores gerados, anti-miRs ou pre-miRs (para diminuir ou aumentar o nível de miRNA) e o plasmídeo controlo da Renilla para normalização dos ensaios de luciferase. A variação da luminescência obtida em presença do aumento ou redução do miR-363* deu uma forte indicação da regulação directa do miR-363* nesses alvos. No entanto, a confirmação desta interacção directa foi efectuada através de ensaios de mutagénese, nos quais de induziram mutações na 3’UTR nos locais de ligação do miRNA, seguidos dos ensaios funcionais como acima descritos. Esta estratégia sugere que o TIMP1, inibidor da metaloprotease-9 (MMP-9), é regulado directamente pelo miR-363*. Adicionalmente, os níveis de expressão dos alvos directos do miR-363* foram estudados em 17 amostras de aspirados de medula óssea de doentes com síndromes mielodisplásicos. Os síndromes mielodisplásicos são caracterizados como um grupo heterogéneo de condições, que apresentam citopenias (produção deficiente de eritrócitos, leucócitos e/ou megacariócitos) e medula óssea displástica e hipercelular. A escalonagem dos doentes foi feita de acordo com o sistema de prognóstico IPSS elaborado pela Organização Mundial de Saúde, e que consiste numa tabela de risco de progressão de síndromes mielodisplásicos para leucemia mielóide aguda (LMA) e que agrupa os doentes em baixo risco – que compreende os níveis baixo e intermédio 1 – e em alto risco – que compreende os níveis intermédio 2 e alto. Dos genes regulados pelo miR-363*, o destacam-se o TIMP1, estando aumentando em doentes com mau prognóstico, e o THBS3 que apresenta um aumento nos doentes com prognóstico intermédio. Em suma, os estudos realizados permitiram a identificação de genes regulados pelo miR-363* e contribuiram para o conhecimento de como o miR-363* contribui para a disfunção medular, particularmente em síndromes mielodisplásicos, pela desregulação das propriedades endoteliais.

Study of influence of regulatory polymorphisms of expression in development of breast cancer

The human genome has millions of genetics variants that can affect gene expression. These variants are known as cis-regulatory variants and are responsible for intra-species phenotypic differences and individual susceptibility to disease. One of the diseases affected by cis-regulatory variants is breast cancer. Breast cancer is one of the most common cancers, with approximately 4500 new cases each year in Portugal. Breast cancer has many genes mutated and TP53 has been shown to be relevant for this disease. TP53 is one of the most commonly mutated genes in human cancer and it is involved in cell cycle regulation and apoptosis. Previous work by Maia et al has shown that TP53 has differential allelic expression (DAE), which suggests that this gene may be under the influence of cis-regulatory variants. Also, its DAE pattern is totally altered in breast tumours with normal copy number. We hypothesized that cis-regulatory variants affecting TP53 may have a role in breast cancer development and treatment. The present work aims to identify the cis-regulatory variants playing a role in TP53 expression, using in silico, in vitro and in vivo approaches. By bioinformatic tools we have identified candidate cis-regulatory variants and predicted the possible transcription factor binding sites that they affect. By EMSA we studied DNA-protein interactions in this region of TP53. The in silico analysis allowed us to identified three candidate cis-regulatory SNPs which may affect the binding of seven transcription factors. However, the EMSA experiments have not been conclusive and we have not yet confirmed whether any of the identified SNPs are associated with gene expression control of TP53. We will carry out further experiments to validate our findings.

Inibição da angiogénese em tumores sólidos: aplicação dos lipossomas catiónicos

Este trabalho pretende abordar a aplicabilidade dos lipossomas catiónicos como veículos de terapia anti-angiogénica, bem como verificar o seu efeito em diversos tipos de cancro. O termo angiogénese define-se como o processo de formação de novos vasos a partir de uma vasculatura pré-existente. Este processo é regulado por várias vias de transdução de sinal que envolvem múltiplos fatores como, por exemplo, o VEGF, o mais potente indutor angiogénico conhecido. A angiogénese é essencial para o crescimento tumoral, pois permite um maior aporte de nutrientes e oxigénio para as células hipóxicas do interior do tumor, que se traduz num aumento da proliferação celular. Nos últimos anos, surgiu um grande interesse na capacidade dos lipossomas catiónicos em reconhecer seletivamente as células endoteliais da vasculatura tumoral. A modificação dos constituintes dos lipossomas catiónicos, como por exemplo a inclusão de polietilenoglicol, permite ultrapassar as principais desvantagens da utilização deste tipo de formulações, como a toxicidade e a rápida eliminação do organismo. A utilização de lipossomas catiónicos na veiculação de terapia anti-angiogénica permite uma maior acumulação dos fármacos nas células-alvo, não só aumentando a eficácia terapêutica como reduzindo a toxicidade associada. Esta estratégia poderá revelar-se um enorme passo na terapia contra o cancro, não só na inibição da progressão tumoral como também, em combinação com a quimioterapia convencional, no aumento das taxas de cura.

Evolution, gene regulation and functional analysis of BMP2 in fish

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional growth factors belonging to the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily with a central role in bone formation and mineralization. BMP2, a founding member of this family, has demonstrated remarkable osteogenic properties and is clinically used to promote bone repair and fracture healing. Lack of basic data on factors regulating BMP2 expression and activity have hampered a better understanding of its role in bone formation and bone-related diseases. The objective of this work was to collect new functional data and determine spatiotemporal expression patterns in a fish system aiming towards a better understanding of BMP2 function and regulation. Transcriptional and post-transcriptional regulation of gilthead seabream BMP2 gene was inferred from luciferase reporter systems. Several bone- and cartilage-related transcription factors (e.g. RUNX3, MEF2c, SOX9 and ETS1) were found to regulate BMP2 transcription, while microRNA 20a was shown to affect stability of the BMP2 transcript and thus the mineralogenic capacity of fish bone-derived host cells. The regulation of BMP2 activity through an interaction with the matrix Gla protein (MGP) was investigated in vitro using BMP responsive elements (BRE) coupled to luciferase reporter gene. Although we demonstrated the functionality of the experimental system in a fish cell line and the activation of BMP signaling pathway by seabream BMP2, no conclusive evidence could be collected on a possible interaction beween MGP and BMP2. The evolutionary relationship among the members of BMP2/4/16 subfamily was inferred from taxonomic and phylogenetic analyses. BMP16 diverged prior to BMP2 and BMP4 and should be the result of an ancient genome duplication that occurred early in vertebrate evolution. Structural and functional data suggested that all three proteins are effectors of the BMP signaling pathway, but expression data revealed different spatiotemporal patterns in teleost fish suggesting distinct mechanisms of regulation. In this work, through the collection of novel data, we provide additional insight into the regulation, the structure and the phylogenetic relationship of BMP2 and its closely related family members.

Identification and molecular characterization of bone-related micrornas: functional implications

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

Characterization of TRIB2 following PI3K inhibition

Dissertação de mestrado, Oncobiologia,(Mecanismos Moleculares do Cancro), Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Locust bean gum-based microparticles for pulmonary delivery of antibiotics

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016