The activity of mouse Cerberus like 2 during cardiogenesis - genetic and morphogenetic studies

Cardiogenesis is a delicate and complex process that requires the coordination of an intricate network of pathways and the different cell types. Therefore, understanding heart development at the morphogenetic level is an essential requirement to uncover the causes of congenital heart disease and to provide insight for disease therapies. Mouse Cerberus like 2 (Cerl2) has been defined as a Nodal antagonist in the node with an important role in the Left-Right (L/R) axis establishment, at the early embryonic development. As expected, Cerl2 knockout mice (Cerl2-/-) showed multiple laterality defects with associated cardiac failure. In order to identify the endogenous role of Cerl2 during heart formation independent of its described functions in the node, we accurately analyzed animals where laterality defects were not present. We thereby unravel the consequences of Cerl2 lossof- function in the heart, namely increased left ventricular thickness due to hyperplasia of cardiomyocytes and de-regulated expression of cardiac genes. Furthermore, the Cerl2 mutant neonates present impaired cardiac function. Once that the cardiac expression of Cerl2 is mostly observed in the left ventricle until around midgestration, this result suggest a specific regulatory role of Cerl2 during the formation of the left ventricular myoarchitecture. Here, we present two possible molecular mechanisms underlying the cardiac Cerl2 function, the regulation of Cerl2 antagonist in activation of the TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 signaling identified by increased Smad2 phosphorilation in Cerl2-/- hearts and the negative feedback between Cerl2 and Wnt/ß-catenin signaling in heart formation. In this work and since embryonic stem cells derived from 129 mice strain is extensively used to produce targeted mutants, we also present echocardiographic reference values to progressive use of juveniles and young adult 129/Sv strain in cardiac studies. In addition, we investigate the cardiac physiology of the surviving Cerl2 mutants in 129/Sv background over time through a follow-up study using echocardiographic analysis. Our results revealed that Cerl2-/- mice are able to improve and maintain the diastolic and most of systolic cardiac physiologic parameters as analyzed until young adult age. Since Cerl2 is no longer expressed in the postnatal heart, we suggest that an intrinsic and compensatory mechanism of adaptation may be active for recovering the decreased cardiac function found in Cerl2 mutant neonates. Altogether, these data highlight the role of Cerl2 during embryonic heart development in mice. Furthermore, we also suggest that Cerl2-/- may be an interesting model to uncover the molecular, cellular and physiological mechanisms behind the improvement of the cardiac function, contributing to the development of therapeutic approaches to treat heart failures.

Sendo o coração o primeiro órgão a ser formado, é também o primeiro a funcionar com o objectivo de suprir as necessidades do embrião vertebrado. No entanto, a morfogénese cardíaca é bastante complexa, e perturbações podem originar doenças cardíacas congénitas, sendo os defeitos com maior incidência à nascença. Com o objectivo de melhor compreender a intrincada base molecular que controla a formação e o desenvolvimento deste órgão e assim promover a união entre prevenção e tratamento, é de importância fundamental aprofundar os conhecimentos nesta área de investigação. Apesar das óbvias diferenças entre o humano e o ratinho, o coração nos dois modelos animais é constituído por quatro câmaras (dois átrios e dois ventrículos) e os respectivos funcionamentos são semelhante tendo contudo algumas ressalvas ao serem equiparados. Além disto, 99% dos genes no ratinho têm equivalentes em humanos, logo o ratinho é considerado um ótimo modelo para o estudo de doenças humanas. Durante o desenvolvimento, o coração recebe informação para se posicionar ao longo dos três eixos do corpo. É o terceiro eixo, o esquerdo-direito (E/D), que determina a direção de rotação do coração e que portanto influencia a sua morfologia final, como exemplo, ventrículo e átrio esquerdo posicionados no lado esquerdo do embrião. Embora já se saiba através de recentes estudos em peixe-zebra como o sinal assimétrico do eixo E/D direciona a rotação cardíaca, ainda é desconhecido a influência deste eixo no posicionamento dos outros órgãos viscerais. Nodal, membro da família de factores de crescimento TGF-ß, tem sido reconhecido como um elemento chave durante o estabelecimento do eixo E/D e do desenvolvimento do embrião sendo especialmente requerido para a formação da mesoderme. O membro da família Cerberus/Dan, mouse cerberus-like2 (Cerl2), é expresso assimetricamente no lado direito do nó em ratinhos e codifica a proteína que uma vez secretada é capaz de se ligar diretamente a Nodal. Dessa maneira, o antagonismo entre Cerl2 e Nodal é essencial para restringir assimetricamente a atividade do Nodal para o lado esquerdo do nó levando a indução da sua cascata de sinalização na placa lateral da mesoderme esquerda. Esta restrição assimétrica para o lado esquerdo do embrião vai determinar a orientação assimétrica dos órgãos. Em ratinhos knock-out para o gene Cerl2 (Cerl2-/-) foi demonstrado que o gene Nodal também pode ser expresso no lado direito do nó levando a indução da cascata de sinalização Nodal na placa lateral da mesoderme direita. Como consequência os ratinhos Cerl2-/- manifestam uma variedade de defeitos de lateralidade (DL) conhecidos como situs inversus, isomerismo e heterotaxia. Adicionalmente estão associadas aos DL malformações cardiovasculares, sendo as mais comuns rotação alterada do eixo cardíaco, defeitos no septo ventricular e atrial, bem como alterações na rotação e diferenciação das artérias, estas últimas conhecidas como transposição das grandes artérias, tronco arterioso comum, dupla saída do ventrículo direito e dupla via de saída do ventrículo esquerdo. Assim, estes fenótipos podem ser a causa de morte nos primeiros dias de vida dos animais Cerl2 mutantes. Adicionalmente, resultados preliminares revelaram um novo fenótipo nos Cerl2-/- recém-nascidos caracterizado pelo aumento da espessura das paredes do ventrículo esquerdo ao qual nestes animais não foram associados defeitos de lateralidade. De forma a caracterizar detalhadamente este fenótipo e identificar o papel do Cerl2 durante a formação do coração, procedeu-se à análise do fenótipo cardíaco em embriões e em ratinhos no começo da vida pós-natal 0 (P0). Com os dados apresentados neste estudo, demonstrou-se que o aumento da espessura do miocárdio no ventrículo esquerdo (VE) e no septo interventricular (SIV) em Cerl2 mutantes sem DL é causado pela hiperplasia dos cardiomiócitos no ventrículo esquerdo. Além disso, nos mutantes de Cerl2 o aumento da expressão relativa de ciclina D1 no VE foi detectada no estádio embrionário 13 (E13). Este resultado pode estar relacionado com a expressão específica de Cerl2 no VE, tal como detectada em animais controlo, indicando assim um possível papel regulatório do Cerl2 durante a formação do coração e mais especificamente, do ventrículo esquerdo. Além disso, os ratinhos Cerl2-/- apresentaram expressão alterada de genes cardíacos durante o estádio embrionário e nas primeiras horas após o nascimento, o que é incompatível com a função cardíaca normal também confirmada pela redução da função sistólica em ratinhos neonatais de Cerl2-/-. Para além de investigarmos o mecanismo celular responsável pelo aumento da massa ventricular esquerda, também sugerimos dois mecanismos moleculares pelos quais o Cerl2 pode estar envolvido. Sendo Cerl2 antagonista da via de sinalização TGFßs/Nodal/Activin/Smad2, em corações embrionários (E13) e neonatais de Cerl2-/- observou-se um aumento da fosforilação de Smad2 (pSMAD2). Estes resultados sugerem que a via de sinalização TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 pode estar ativamente aumentada na ausência de Cerl2. Interessantemente, tem sido relatado que esta via é essencial para a regulação da cardiogénese uma vez que também desempenha um papel relevante como mediador na patogénese cardíaca em corações de ratinho adulto após lesão. A segunda hipótese tem como base dados recentes os quais reportam que a via de sinalização Wnt e Cerl2 estão interligadas no nó através de um feedback negativo, onde o mRNA do Cerl2 é regulado após a transcrição por Wnt3 levando à degradação de Cerl2 no lado esquerdo do nó e portanto estabelecendo a sua expressão de forma assimétrica. Em contrapartida, Cerl2 é capaz de inibir a auto-regulação da proteína Wnt3. Adicionalmente, também foi revelado que a via de sinalização Wnt/ß-catenin é essencial para estimular a proliferação de cardiomiócitos na camada compacta de ambos os ventrículos. Apesar de em nenhum estudo até agora ter sido demonstrada a relação entre Wnt/ß-catenin e Cerl2 no coração e de serem necessárias confirmações adicionais, sugerimos que a hiperplasia do VE encontrado em Cerl2-/- pode também ser devida ao aumento da via de sinalização Wnt/ßcatenin. Uma vez que as células estaminais embrionárias derivadas da estirpe 129 de ratinho colonizam eficientemente as linhas germinativas, esta linhagem celular tem sido utilizada com frequência para a produção de linhas de animais geneticamente modificados. Como diferentes fundos genéticos podem originar diferentes fenótipos, o estabelecimento de valores de referência para cada estirpe de ratinhos é uma ferramenta útil nos dias atuais. A ecocardiografia não-invasiva permite avaliar a função cardíaca e a morfometria ventricular esquerda e o seu uso tem crescido na última década. Dessa maneira, foram criados valores de referência para a estirpe 129/Sv de ratinhos juvenis (3 semanas) e adultos (8 semanas). Com o objectivo de analisar se os ratinhos Cerl2-/- continuam a manifestar um aumento da massa ventricular esquerda com a redução da função cardíaca, procedeu-se à monitorização, através de ecocardiografia, de ratinhos recém-nascidos até à fase de jovens adultos (P60). Uma parte significante dos mutantes Cerl2 morrem no primeiro dia de vida, na presença e na ausência de DL. Tem sido relatado que a presença de DL é incompatível com um longo tempo de vida e portanto é esperado que a grande maioria destes mutantes com DL não sobrevivam. Já nos mutantes de Cerl2 que morrem nas primeiras horas de vida e não apresentaram defeitos de lateralidade, foi detectada uma tendência para o aumento da massa ventricular esquerda a qual é indicativa de hipertrofia. Além disto este grupo revelou uma dramática redução da função cardíaca como foi demonstrado pela diminuição dos batimentos cardíacos por minuto e pela diminuição do pico da velocidade da artéria pulmonar. Curiosamente, os mutantes de Cerl2 que sobrevivem conseguem recuperar a sua função cardíaca como também demonstrado pela fração de ejeção, a fração de encurtamento e a fração de alteração das áreas (sistólica e diastólica) quando comparados com os animais controlo. Este resultado foi confirmado pela manutenção dos níveis de expressão dos indicadores de hipertrofia e stress (como por exemplo o Anp, Bnp e Ankrd1). Dessa maneira, concluiu-se que o primeiro dia de vida pós-natal é determinante para os mutantes que não apresentam DL. Contudo é desconhecido o(s) factor(es) que determina(m) a morte ou sobrevivência destes animais. Apesar da melhora na função cardíaca nos adultos de Cerl2-/-, o débito cardíaco obtido no ventrículo esquerdo quando normalizado pelo peso do corpo, revelou uma redução quando comparado com animais wild-type, indicando portanto que a recuperação da função sistólica não é completa. Curiosamente os ratinhos adultos Cerl2-/- quando comparados com os ratinhos controlo apresentaram diferentes padrões de dimensão nas paredes do VE, como exemplo afinamento da parede anterior e posterior. De acordo com a literatura tem sido sugerido que a alteração aeróbica regional do metabolismo cardíaco pode levar á uma diferença assimétrica na espessura das paredes dos ventrículos, sendo no entanto necessária uma investigação detalhada. Embora ainda seja desconhecido o mecanismo pelo qual os ratinhos Cerl2-/- conseguem adaptar-se a vida pós-natal, sugerimos que o estes ratinhos mutantes podem ser um modelo interessante para estudar os mecanismos moleculares, celulares e fisiológicos que estão por trás da restauração da função cardíaca. Portanto análises detalhadas neste modelo poderia ajudar a desenvolver abordagens terapêuticas para o tratamento de insuficiência cardíaca. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese proporcionam um conjunto importantes de novos dados relacionados com a cardigénese, durante e após a vida intrauterina, os quais revelam a importância de Cerl2 na regulação da formação do coração independentemente da sua bem conhecida função no estabelecimento do eixo E/D.

Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina