Searching biocompounds in marine natural extracts with potential use in tumor prevention and treatment

Cancer is a multistage process characterized by three stages: initiation, promotion and progression; and is one of the major killers worldwide. Oxidative stress acts as initiator in tumorigenesis; chronic inflammation promotes cancer; and apoptosis inactivation is an issue in cancer progression. In this study, it was investigated the antioxidant, antiinflammatory and antitumor properties of hexane, ether, chloroform, methanol and water extracts of five species of halophytes: A. macrostachyum, P. coronopus, J. acutus, C. edulis and A. halimus. Antioxidant activity was assessed by DPPH• and ABTS•+ methods, and the total phenolics content (TPC) was evaluated by the Folin-Ciocalteau method. The anti-inflammatory activity of the extracts was determined by the Griess method, and by evaluating the inhibition of NO production in LPS-stimulated RAW- 264.7 macrophages. The cytotoxic activity of the extracts against HepG2 and THP1 cell lines was estimated by the MTT assay, and the results obtained were further compared with the S17 non-tumor cell line. The induction of apoptosis of J. acutus ether extract was assessed by DAPI staining. The highest antioxidant activities was observed in C. edulis methanol and the J. acutus ether extracts against the DPPH• radical; and J. acutus ether and A. halimus ether extracts against the ABTS•+ radical. The methanol extracts of C. edulis and P. coronopus, and the ether extract of J. acutus revealed a high TPC. Generally the antioxidant activity had no correlation with the TPC. The A. halimus chloroform and P. coronopus hexane extracts demonstrated ability to reduce NO production in macrophages (> 50%), revealing their anti-inflammatory capacity. The ether extract of J. acutus showed high cytotoxicity against HepG2 cancer cells, with reduced cellular viability even at the lowest concentrations. This outcome was significantly lower than the obtained with the non-tumor cells (S17). This result was complemented by the induction of apoptosis.

O cancro é uma das doenças mais mortais em todo o mundo, sendo caracterizada por um conjunto de células que cresce de uma forma descontrolada levando à formação de tumores. O processo de desenvolvimento tumoral é definido por três etapas principais: iniciação, promoção e progressão. A iniciação resulta da exposição a agentes mutagénicos e traduz-se em pequenas alterações na morfologia celular ou de tecidos, e num aumento da vulnerabilidade para o desenvolvimento de tumores. As espécies reactivas de oxigénio (ERO) têm sido descritas como tendo um papel principal na iniciação tumoral e sobrevivência induzida por uma grande variedade de mediadores. De facto, descobertas iniciais que associam ERO com a iniciação de tumores têm sugerido que o stress oxidativo actua como agente causador de danos no ADN, aumentando a frequência de mutações nas células, levando a transformação do tumor. Para diminuir os danos causados pelos ERO, os organismos aeróbicos desenvolveram sistemas de defesa antioxidante: enzimáticos e não enzimáticos. Deste modo, agentes antioxidantes, que estão muitas vezes presentes em plantas, podem ajudar o nosso organismo a fortalecer os seus próprios mecanismos de defesa, tornando-os mais eficientes. A promoção é caracterizada pelo crescimento clonal de células iniciadas, que ocorre através de proliferação celular e a inibição da apoptose. Como consequência, surge nos tecidos uma lesão detéctavel, originando o tumor primário. Os promotores tumorais mais comuns induzem alterações na expressão génica de productos relacionados com a hiperproliferação, remodelação de tecidos e promoção da inflamação. Danos crónicos em tecidos são induzidos em resposta à inflamação crónica e à geração de ERO citotóxicos, que conduzem a uma proliferação presistente e regenerativa. Mais, a exposição contínua aos agentes inflamatótios, leva à inflamação crónica que por sua vez estimula a carcinogénese. O último passo da carcinogenese é a progressão. Esta é geralmente caracterizada por alterações permanentes ao nível celular e molecular, que estão envolvidas na transição de um fenótipo benigno para maligno. Nesta fase um processo chave para o crescimento tumoral é a capacidade de induzir angiogénese, quando a lesão atinge uma porporção que dificulta o fornecimeno de oxigénio e nutrientes. Num estádio avançado do seu crescimento, as células neoplásicas adquirem a capacidade de migrar e colonizar os tecidos adjacentes e órgãos de locais distantes através da corrente sanguínea. As plantas superiores têm sido uma importante fonte de compostos bioactivos com actividade anti-tumoral, devido à grande diversidade de substâncias químicas que produzem. Como tal, as plantas halófitas surgem também como fonte de interesse nesta área. Estas são capazes de sobreviver a ambientes com elevado teor de salinidade. Deste modo, podem desenvolver stress oxidativo, que é regulado por diversos mecanismos que facilitam a retenção e aquisição de água, protecção de cloroplastos, e manutenção da homeostase iónica. Essencialmente, estas acções compreendem a síntese de osmólitos (pequenos glícidos, polióis, aminoácidos e metilaminas), proteínas específicas (enzimas antioxidantes, proteínas transportadoras de iões) e moléculas antioxidantes (compostos fenólicos, carotenóides e vitaminas). Isto pode explicar a utilização de algumas espécies de halófitas em países orientais, na medicina tradicional e na alimentação. Para, além disso, sabe-se que as moléculas presentes em plantas, vulgarmente designadas por fitoquímicos, possuem propriedades antioxidantes e parecem ter uma actividade quimiopreventiva, eventualmente prevenindo a carcinogénese, através da estimulação de enzimas celulares antioxidantes e desintoxicantes. Fitoquímicos com actividades supressoras de tumores têm demonstrado modificar diversas vias de sinalização celular anómala, prevenindo a promoção e a progressão tumoral. Deste modo, o presente estudo teve como objectivos principais avaliar a actividade antioxidante, anti-inflamatória e anti-tumoral de extractos de hexano, éter, clorofórmio, metanol e água de cinco espécies de halófitas recolhidas no Algarve, nomeadamente A. macrostachyum, P. coronopus, J. acutus, C. edulis e A. halimus. As propriedades antioxidantes dos extractos foram avaliadas através de dois métodos padrão, que analisam a redução de radicais estáveis, nomeadamente o 1,1- difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) e o ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico) (ABTS+). Como os compostos fenólicos já demonstraram ter actividade na inibição do stress oxidativo, e como têm sido muitas vezes relacionadas com a presença de actividade antioxidante, o conteúdo total em compostos fenólicos de todos os extractos foi estimado através do método de Folin-Ciocalteau. Além disso, foi também determinada a actividade anti-inflamatória dos extratos, por se saber que a inflamação crónica está associada ao desenvolvimento tumoral. Para tal, foi utilizado o ensaio de Griess, que é um método simples e rápido para avaliar indiretamente a produção de óxido nitríco em meio aquoso, através da medição de nitritos, que é um produto final estável do óxido nitríco, na presença de oxigénio. Este método permite determinar o potencial inibitório dos extractos sobre a produção de óxido nitríco, na linha celular de macrófagos RAW-264.7 estimulada com lipopolissacarídeo (LPS). Foi também estudada a atividade citotóxica dos extractos, pelo método do brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil tetrazólio (MTT), que ao ser um composto metabolizável pela mitocôndria permite determinar a sua viabilidade, e consequentemente a viabilidade celular. A citotoxicidade dos extractos foi avaliada contra duas linhas celulares humanas, carcinoma hepatocelular (HepG2) e leucemia monocítica aguda (THP1). Os resultados obtidos foram posteriormente comparados com uma linha celular de medula óssea (S17), de linhagem não tumoral. Finalmente, a indução de apoptose do extracto que apresentou ser mais citotóxico foi avaliada através de um método de coloração dos núcleos com 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Este método permite observar as caracteristicas morfológicas das células em apoptose, como a condensação da cromatina, a fragmentação do núcleo e a formação de corpos apoptóticos. Todas as espécies estudadas apresentaram actividade antioxidante, mas os extractos mais activos foram o extracto de metanol de C. edulis (IC50 = 0,1 mg/mL) e o de éter etílico de J. acutus (IC50 = 0,2 mg/mL); contra o radical ABTS os extratos com maior actividade foram o de éter etílico de J. acutus (IC50 = 0,4 mg/mL) e o de éter etílico de A. halimus (IC50 = 0,9 mg/mL). Os exractos de C. edulis de metanol, de P. coronopus de metanol e o de éter etílico de J. acutus revelaram possuir o maior teor em compostos fenólicos. De um modo geral, os extractos com elevada actividade antioxidante não exibem elavados niveis de compostos fenólicos. Apenas o extracto metanólico de C. edulis e o extracto de éter de J. acutus mostraram simultaneamente elevado teor em composto fenólicos e elevado actividade antioxidante. Estes dados sugerem que a actividade antioxidante total dos extractos de plantas halófitas podem dever-se à acção combinada de compostos bioquímicos fenólicos com não-fenólicos, como péptidos e ácidos orgânicos. Relativamente à capacidade anti-inflamatória, os extractos de clorofórmio de A. halimus e hexano de P. coronopus demonstraram serem os mais eficazes na redução da produção de oxido nitríco nos macrófagos RAW-264.7 estimulados com LPS, (redução de 43,3% e 47,4% da produção de nitritos relativamente ao controlo, respectivamente). Como até agora, nenhuma bioactividade anti-inflamatória foi identificada nestas espécies, estes extractos de P. coronopus and A. halimus são bons candidactos para futuras experiências para confirmar a actividade anti-inflamatória encontrada nestas análises preliminares. O extrato de éter etílico de J. acutus mostrou possuir uma grande actividade citotóxica contra as células tumorais HepG2, apresentando uma reduzida % de viabilidade celular, mesmo em concentrações baixas (IC50 = 6,2 μg/mL). Este resultado foi significativamente menor do que o obtido contra as células de linhagem não tumoral, S17 (IC50 = 34,4 μg/mL), apresentando um índice de selectividade de 7,4 na concentração de 15,6 μg/mL. Este resultado foi complementado pela observação das características de apoptose, realizada na presença de DAPI, através de microscopia de fluorescência. As observações mostraram que houve indução de apoptose, com 17,1% de núcleos apoptóticos nas células tumorais HepG2, que contrastam com os 2,9% nas células não tumorais, S17. Verificou-se que o extracto de éter de J. acutus apresentou elevada actividade antioxidante e alto teor em compostos fenólicos, o que sugere que a capacidade antioxidante do extracto pode depender do seu conteúdo em compostos fenólicos. Uma vez que vários estudos já reportaram propriedades anti-carcinogénicas dos polifenóis, é possível sugerir que o elevado teor em compostos fenólicos encontrado no extracto de éter de J. acutus tem um papel no efeito citotóxico observado nas células HepG2. Neste sentido este extracto é uma fonte promisora de compostos quimioterapêuticos para o tratamento do cancro hepático, frequentemente resistente aos fármacos quimioterapêuticos comuns. Este actua através da inibição da proliferação das células tumorais de uma maneira selectiva, assim como a indução da morte celular programada, contrariamente ao que acontece com um composto usado normalmente no tratamento do cancro, o etopósido. Em conclusão, foram encontrados extractos com acção nas três fases do processo carcinogénico. Ao nível da anti-iniciação, o extracto metanólico de C. edulis e o de éter de J. acutus e de A. halimus demonstraram ser os mais eficientes. Ao nível da anti-promoção, os extractos de clorofórmio de A. halimus e hexano de P. coronopus foram os mais bioactivos. Por fim, ao nível da anti-progressão, o extracto de éter de J. acutus mostrou possuir a maior actividade. Estes resultados demonstram a potencial utilização destes extractos em estratégias de prevenção e de tratamento de tumores, levando ao melhoramento da qualidade de vida dos pacientes, aumentando o seu bem-estar, mitingando os efeitos secundários indesejáveis e promovendo melhores taxas de recuperação.

Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina