Characterization of TRIB2 following PI3K inhibition

Dissertação de mestrado, Oncobiologia,(Mecanismos Moleculares do Cancro), Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Cancer can be defined as an unbalance between cell proliferation and apoptosis. The PI3K/AKT signalling pathway is one of the most mutated pathways in cancer and is involved in cell growth and survival. The transcription factor FOXO3a is a critical effector of this pathway and its inactivation by AKT prevents the expression of genes involved in cell cycle arrest and apoptosis. The TRIB2 protein was found to be a repressor of FOXO3a, and over expressed in many types of cancer. Importantly, TRIB2confers resistance to PI3K inhibitors which are being tested in clinical trials. This work shows that following PI3K inhibitor treatment, there is an increase of the TRIB2 protein levels by reducing proteasomal degradation. Furthermore, the TRIB2 COP1 binding domain is critical for AKT activation and subsequent FOXO repression. Altogether, our results provide insight into the mechanism underlying TRIB2 mediated tumorigenesis and drug resistance implicating the binding and activation of AKT and suggests a role of TRIB2 in acquired resistance against PI3K inhibitors.

O Cancro é caracterizado por uma proliferação celular descontrolada oriunda de danos e/ou mutações no ADN. Estas alterações surgem na grande maioria de erros durante o processo de replicação, falhas nos mecanismos de reparação, exposição a fatores ambientais ou a agentes cancerígenas. Existem seis alterações essências que uma célula normal submete-se na transformação em célula tumoral: evasão a supressores externos de crescimento celular, sinalização constitutiva de proliferação, evasão à apoptose (morte celular programada), capacidade própria de induzir angiogênese (produção de novos vasos sanguíneos), potencial replicativo ilimitado que torna a célula “imortal” e capacidade metastática de invadir outro tecidos. Recentemente, mais quatro características foram adicionadas, sendo elas: evasão ao sistema imunitário, instabilidade genómica, desregulação do balanço energético celular e capacidade de inflamação indutora de tumores. O Cancro é uma das maiores ameaças á saúde humana a nível mundial. Dentro dos tipos de cancro mais preocupantes está o cancro de pele, mais especificamente o Melanoma. Esta forma agressiva de cancro de pele desenvolve-se a partir de melanócitos, células especializadas na produção de melanina. Embora este tipo de cancro de pele seja uma minoria (menos de 5% dos casos totais), é um dos mais letais, sendo responsável por aproximadamente 80% de todas as mortes devido a cancro de pele. Com a sua incidência dentro da faixa etária dos 30 aos 60 anos, em particular em pessoas de pele mais clara. O facto de cada vez mais surgirem casos de jovens entre os 25-29 anos é alarmante. O aumento anual da sua incidência têm-se refletido numa subida na taxa de mortalidade associada a este tipo de cancro. Esta doença oncológica é extremamente agressiva e heterogénea, com vários subtipos histológicos e perfis mutacionais. Adere-se o problema que os tratamentos convencionais são pouco eficazes e as drogas mais recentes que conseguem ter resultados tornam-se ineficazes devido aos tumores adquirirem resistência num espaço de meses. A totalidade destes factos confere aos pacientes um prognóstico pessimista. Devido a estes factos, a investigação científica têm-se empenhado em perceber os mecanismos moleculares afetados por esta patologia e em como esse conhecimento pode auxiliar na produção de tratamentos mais eficazes. É o caso da via de sinalização de PI3K, que se verificou ser desregulada em Melanoma, que levou ao desenvolvimento de inibidores capazes de reverter esta alteração, como BEZ235. A via de sinalização de PI3K/AKT é importante na regulação de diversos processos biológicos, tais como proliferação celular, metabolismo, crescimento celular e apoptose. Esta via é ativada pela ligação de fatores de crescimento ao recetor de tirosina quinase na membrana celular. Este recetor, através de fosforilação, ativa PI3K que converte fosfatidil inositol 4,5-difosfato (PIP2) em fosfatidil inositol 3,4,5-trifosfato (PIP3). Este processo é regulado negativamente por PTEN, uma fosfatase que tem como substrato PIP3. O aumento de PIP3 recruta AKT para a membrana, fazendo com que seja ativado por outras quinases através de fosforilação dos seus resíduos Treonina 308 e Serina 473. Após esta ativação, AKT fosforila várias moléculas alvo no citoplasma e no núcleo, como por exemplo p27, BAD, GSK3, MDM2 e FOXO. Os fatores FOXO são uma família de fatores de transcrição que funcionam como ativadores ou repressores, dependendo dos seus cofatores a quando da sua ligação ao ADN. Esta família é fundamental em processos como apoptose, metabolismo, diferenciação celular, inflamação, proliferação e resposta ao stress oxidativo. O fator de transcrição p53 é responsável pela regulação de vários genes envolvidos em apoptose, paragem do ciclo celular, senescência, metabolismo e autofagia. Devido a estas funções, é considerado o “guardião do genoma” e o seu papel contra o desenvolvimento tumoral é bem conhecido. O p53 é regulado por MDM2, uma ubiquitina ligase responsável pela sua ubiquitinação e consequente degradação proteossómica. Na verdade, p53 e MDM2 exercem um feedback loop, sendo que o gene de MDM2 é um dos alvos de p53, mantendo assim os níveis de p53 constantes dentro da célula. O TRIB2 é um gene que tem sido associado ao desenvolvimento de cancro e foi recentemente considerado um biomarcador para o prognóstico e para a progressão de Melanoma. A sua sobre expressão proteica afeta negativamente os tratamentos convencionais a este tipo de cancro. Também está implicado na regulação negativa de FOXO. Dado que este fator de transcrição é uma das vias que as drogas usadas nas terapias utilizam para exercer efeitos citotóxicos e/ou citostáticos sobre as células tumorais, a regulação que TRIB2 exerce sobre FOXO evidencia o seu papel na resistência a quimioterapêuticos (como o clássico DTIC ou o inibidor BEZ235). Pesquisas antecedentes feitas pelo nosso grupo laboratorial demonstraram que o uso de inibidores de PI3K estabilizam os níveis proteicos de TRIB2 e que existe uma interação entre TRIB2 e AKT. Neste trabalho, procuramos perceber como TRIB2 é regulado dentro da célula e como interage com a via de sinalização PI3K/AKT. Durante a nossa investigação constatámos que os níveis proteicos de TRIB2 eram estabilizados na presença de inibidores de PI3K devido a um decréscimo da sua degradação proteossómica. Isto implica que a via de sinalização de PI3K está envolvida na modificação translacional de TRIB2 necessária para a sua degradação. Os mecanismos envolvidos nesta degradação e os seus participantes permanecem desconhecidos. No entanto, estes resultados conseguem demonstrar como TRIB2 influencia a resistência a drogas, como verificado nos casos de Melanoma. Também observámos que a interação entre AKT e TRIB2 é feita através do domínio de ligação a COP1 existente na zona C-terminal de TRIB2. Verificámos que esta interação implica um decréscimo na expressão de genes envolvidos em apoptose e em paragem do ciclo celular como FasLG e p27, respetivamente. Estes resultados evidenciam que a interação entre AKT e TRIB2 está relacionada com a regulação negativa de FOXO. Como confirmação, avaliámos os níveis proteicos de p27 e BIM, genes regulados por os fatores FOXO. Estes resultados implicam que TRIB2 funciona como uma proteína scaffold ou adaptadora, que permite a ativação de AKT no resíduo Serina 473. Em conjunto, estes resultados demonstram como a regulação de TRIB2 e a sua interação com AKT auxiliam as células tumorais a adquirirem resistência a quimioterapêuticos, não só no tratamento de Melanoma mas em outras patologias oncológicas onde a via de sinalização de PI3K/AKT esteja alterada.