Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de Pseudomonas aeruginosa em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por P. aeruginosa. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, in vitro, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10⁷ Unidades Formadoras de Colônias de P. aeruginosa. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de P. aeruginosa.

Enterococcus faecium: caracterização molecular de amostras isoladas no período anterior e posterior a emergência da resistência à vancomicina no Estado do Rio de Janeiro

Nas últimas décadas, Enterococcus resistentes à vancomicina tem se destacado no cenário hospitalar em todo mundo. A emergência da resistência à vancomicina no Estado do Rio de Janeiro foi registrada em 2000, na espécie Enterococcus faecalis. Em seguida, Enterococcus faecium passou a ser prevalente. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética das amostras de E. faecium sensíveis (VSEfm) e resistentes (VREfm) à vancomicina, isoladas em diferentes instituições de saúde do Estado do Rio de Janeiro no período de 1993 a 2008. As amostras bacterianas foram avaliadas por metodologia de eletroforese em campo pulsado (PFGE), após restrição com Smal, análise do polimorfismo numérico de segmentos repetitivos (MLVA) e tipagem por sequenciamento de múltiplos loci (MLST); além da detecção de marcadores fenotípicos, como a resistência à ampicilina e à ciprofloxacina, e genotípicos, como determinantes genéticos de virulência, que estão vinculados a um complexo clonal globalmente disperso (CC17). A diversidade de Tn1546 (que alberga o conjunto gênico vanA) foi determinada por amplificação e restrição com ClaI. Um grupo clonal prevalente foi observado pela metodologia de PFGE e agrupou amostras isoladas, principalmente, no período de 2004 a 2006, estando disseminado por diversas instituições de saúde do Estado, indicando transmissão inter- e intra-hospitalar. A avaliação por MLVA identificou dois MTs prevalentes dentre as amostras VREfm: MT12 relacionado à maioria das amostras dos principais grupos clonais identificados por PFGE e, o MT159 que apresentou frequência aumentada no ano de 2008. A análise por MLST destacou o ST78 associado aos principais grupos clonais definidos por PFGE, bem como, ao MT12. Também foi observada correlação entre o ST412 associado ao grupo clonal formado por apenas amostras de 2008 e o MT159. Foi notório por MLST que as amostras VREfm do Estado do Rio de Janeiro, no período do estudo, estiveram relacionadas CC17, juntamente com algumas amostras VSEfm. Entretanto, os principais marcadores de resistência e de virulência, característicos de CC17, estiveram mais relacionados as amostras VREfm do que as VSEfm, como resistência à ampicilina e à ciprofloxacina; e a presença do gene esp e do alelo purK1. A identificação de VSEfm pertencentes ao CC17 sugerem que amostras já adaptadas ao ambiente hospitalar, podem ter adquirdo o determinante de resistência vanA, facilitando a emergência de amostras de VREfm. Adicionalmente, nossos dados sugerem uma modificação no cenário de amostras VREfm no Rio de Janeiro. Pois a dominância de um grupo clonal prevalente (PFGE- X; MT12; ST78) pode estar sendo substituída pela possível emergência de um novo grupo clonal, que foi característico de amostras mais recentes (PFGE-XV; MT159; ST412), apontando assim, para um novo curso na epidemiologia dos E. faecium no Estado. Um perfil de restrição prevalente de Tn1546 idêntico ao protótipo foi observado, apontando que a disseminação da resistência à vancomicina ocorreu por também por transferência horizontal. Entretanto, alterações do tipo deleção e presença de elementos de inserção com aproximadamente 2 kb foram observadas em um número reduzido das amostras. A incongruência no genótipo vanA, em relação ao fenótipo, foi observado para uma amostra. Considera-se fundamental o acompanhamento da disseminação de VREfm, particularmente diante da elevada frequência de amostras pertencentes a um complexo clonal que conjuga multirresistência com virulência, com elevado potencial de adaptabilidade e disseminação.

Achromobacter xylosoxidans na fibrose cística: infecção crônica e disseminação clonal

A mortalidade na Fibrose Cística (FC) é decorrente de infecções pulmonares causadas comumente por: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e espécies do Complexo Burkholderia cepacia (CBc). Mais recentemente, tem sido observada a emergência de BGN-NF raros, como Achromobacter xylosoxidans, porém, sua prevalência, potencial de transmissão e significado clínico são desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência de colonização crônica por A. xylosoxidans e avaliar a possibilidade de transmissão cruzada entre os pacientes acompanhados em dois centros de referência na cidade do Rio de Janeiro. Foram incluídos 39 pacientes com FC, com pelo menos uma cultura positiva para o gênero Achromobacter spp., em um total de 897 analisadas, do período de janeiro de 2003 a dezembro de 2008. A frequência de isolamento de Achromobacter spp. nas culturas analisadas foi de 14,5% (130 em 897 culturas). A maioria (n=122; 93,8%) foi identificada como A. xylosoxidans por testes fenotípicos e pelo sequenciamento do gene rrs que codifica o 16S rRNA. A análise do polimorfismo genético dos isolados de A. xylosoxidans pela técnica de PFGE, mostrou 22 grupos clonais. Destes, sete foram compartilhados entre pacientes distintos sugerindo transmissão cruzada. Apenas o clone G foi amplamente disseminado entre 56,4% dos pacientes estudados, sugerindo a possibilidade de um surto. Os 15 clones restantes constituíram-se em clones exclusivos por pacientes. Os cinco pacientes colonizados cronicamente por A. xylosoxidans mostraram a prevalência de clones únicos. Até o momento, este é o primeiro caso da ocorrência de surto por A. xylosoxidans em pacientes com Fibrose Cística. A. xylosoxidans é um microrganismo que vem se destacando em frequência e como um possível patógeno pulmonar nesses pacientes. Entretanto, até o momento os dados são insuficientes para avaliar a sua contribuição para a evolução da doença pulmonar. Estudos que busquem elucidar as características de A. xylosoxidans que o permitem colonizar persistentemente o pulmão dos pacientes com FC, bem como seu potencial de virulência, são necessários.

Análise dos aspectos biológicos e epidemiológicos de cepas de Escherichia coli associadas à infecção do trato urinário (ITU)

A invasão de bactérias no trato urinário caracteriza a infecção do sistema urinário. A Escherichia coli é o principal microrganismo associado a esta infecção devido a sua importância em causar ITU, recebeu a denominação de UPEC (Escherichia coli uropatogênica). No presente trabalho pesquisamos em 50 cepas de UPEC, inicialmente isolados de urina de pacientes ambulatoriais com infecções sintomática ou assintomática, a presença de 7 fatores de virulência, através das técnicas de PCR simples e multiplex para verificação dos genes que codificam adesinas P (pap) , fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), sideroforo (aerobactina- aer), toxinas fator necrotizante citotóxico (cnf) e alfa-hemolisinas (hly), proteína de membrana (traT); ilhas de patogenicidade (virulência) através do marcador PAI. O marcador pCVD432 de EAEC também foi pesquisado nestas amostras. O método difusão em disco foi o utilizado para a determinação dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Podemos observar duas faixas etárias de maior incidência de ITU entre as mulheres: 19 a 35 anos, e acima de 50 anos. Sessenta e oito por cento das amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, onde os genes traT (54%) e aer (34%) foram os mais prevalentes. A sequência pCVD432 foi detectado em 6 amostras. No entanto, no ensaio de adesão em células Hep-2, doze amostras não apresentaram aderência (NA 24%). Nas 38 cepas restantes, 24 (48%) apresentaram aderência agregativa (AA). Observamos aderência sem padrão típico (SPT) em 48% das amostras, tendo sido dividido em discreto (SPT-D 22%), moderado (SPT-M 18%) e intenso (SPT-I 8%). Notamos os seguintes perfis de resistência para os antimicrobianos testados: ampicilina (44%), gentamicina (8%), nitrofurantoína (2%), norfloxacino (18%) e sulfametozaxol-trimetoprima (34%).

Avaliação da eficácia de uma nova formulação de anfotericina B poliagregada em diferentes esquemas terapêuticos no tratamento da esporotricose experimental causada por Sporothrix brasiliensis

A esporotricose é uma micose subcutânea, crônica, causada por espécies termo-dimórficas do complexo Sporothrix schenckii. Esta micose apresenta diferentes manifestações clínicas sendo mais comum a forma linfocutânea. Casos graves causados por Sporothrix brasiliensis têm sido descritos recentemente, exigindo um tratamento prolongado com antifúngicos de alta toxicidade como a anfotericina B-desoxicolato ou suas versões menos tóxicas, mas de alto custo. Neste trabalho visamos testar in vitro e in vivo a eficácia de uma nova formulação intravenosa de anfotericina B poliagregada (P-AmB) e testar in vivo sua versão semi-sólida (AmB tópica), comparando-a com o itraconazol (ITC) e a anfotericina B-desoxicolato (D-AmB). Ensaios de susceptibilidade in vitro com S. brasiliensis mostraram que esta espécie é suscetível aos antifúngicos testados. Para os testes de eficácia in vivo foram estabelecidos um modelo de esporotricose disseminada e outro de esporotricose subcutânea, causados por S. brasiliensis. No modelo de esporotricose disseminada camundongos BALB/c foram inoculados intravenosamente com leveduras de S. brasiliensis e, 72 h pós-infecção, tratados sob diferentes regimes terapêuticos: i) uma monoterapia de ITC, D-AmB ou P-AmB; ii) uma combinação terapêutica entre D-AmB e ITC ou P-AmB e ITC; iii) um regime de pulso com D-AmB ou P-AmB. A sobrevivência (n= nove) e a carga fúngica em órgãos internos (n= três, no mínimo) foram avaliadas, sendo observado que o regime de pulso com D-AmB ou P-AmB foi o mais efetivo em prolongar a sobrevivência dos animais e reduzir a carga fúngica nos órgãos, seguido pela combinação terapêutica, porém o tratamento com D-AmB e ITC foi a combinação mais efetiva. A monoterapia com ITC e P-AmB e D-AmB foram menos eficazes, sendo corroborados pelas análises histopatológicas. Ensaios de toxicidade in vivo com as diferentes drogas revelaram que ITC e D-AmB induziram a uma toxicidade hepática e renal nos animais, respectivamente, mas P-AmB não induziu a nenhuma toxicidade. Nos ensaios de citoxicidade in vitro foi observado que ITC foi a menos citotóxica e hemolítica e a mais seletiva das drogas testadas, seguida por P-AmB, que foi menos citotóxica e mais seletiva que D-AmB. No modelo de esporotricose subcutânea camundongos da mesma linhagem foram inoculados por via subcutânea com conídios de S. schenckii e de S. brasiliensis (n=9/ grupo). Os animais infectados com S. brasiliensis apresentaram regressão das lesões primárias e disseminação. Usando o modelo de esporotricose subcutânea murina causada por S. brasiliensis testamos peliminarmente a formulação tópica de AmB poliagregada, que reduziu a extensão das lesões de animais infectados. Este é o primeiro trabalho a avaliar diferentes regimes de tratamento da esporotricose disseminada murina causada por S. brasiliensis utilizando ITC, D-AmB e uma nova formulação menos tóxica de anfotericina B poliagregada. O estudo revelou que o regime de pulso foi o mais eficaz para as formulações intravenosas de AmB. Nosso estudo também estabeleceu pioneiramente um modelo de esporotricose subcutânea induzido por S. brasiliensis, que se revelou uma ferramenta útil para comparar a virulência das espécies do complexo S. schenckii e para testar a eficácia de antifúngicos contra essas novas espécies.