Differential expression of THOC1 and ALY mRNP biogenesis/export factors in human cancers

One key step in gene expression is the biogenesis of mRNA ribonucleoparticle complexes (mRNPs). Formation of the mRNP requires the participation of a number of conserved factors such as the THO complex. THO interacts physically and functionally with the Sub2/UAP56 RNA-dependent ATPase, and the Yra1/REF1/ALY RNA-binding protein linking transcription, mRNA export and genome integrity. Given the link between genome instability and cancer, we have performed a comparative analysis of the expression patterns of THOC1, a THO complex subunit, and ALY in tumor samples.

Translationskontrolle in der Spermatogenese von Drosophila: Charakterisierung eines regulatorischen mRNP-Komplexes

Während der Spermatogenese von Drosophila werden viele mRNAs zwar vor der Meiose transkribiert, dann aber durch Komplexbildung mit Proteinen stillgelegt und erst am Ende der Spermienentwicklung durch Veränderung desselben für die Translation freigegeben. Ein Beispiel hierfür ist die Mst87F mRNA. Während das cis-agierende Sequenzelement in der RNA seit langem bekannt ist, gestaltete sich die Suche nach den trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen schwierig. In meiner Diplomarbeit (Stinski, 2007) waren mithilfe von präparativen Shift-Experimenten (Auftrennung von RNP-Komplexen im elektrischen Feld) zwei vielversprechende Kandidaten identifiziert worden, die Proteine Exuperantia (Exu) und Purity of Essence (Poe). Ziel der vorliegenden Dissertation war zum einen die Aufklärung der Funktion dieser Kandidatenproteine und zum anderen die Identifizierung weiterer Kandidaten, die an der Komplexbildung und damit an der Regulation beteiligt sind. Dabei war die Hoffnung, sowohl Proteine zu finden, die die Repression vermitteln, als auch solche, die am Ende die Aktivierung ermöglichen. Durch eine Affinitätsreinigung, in der Mst87F-RNA mit einem ms2-Tag versehen über das MS2-Maltose binding protein an eine Amylose-Matrix gebunden und schließlich die Komplexe mit Maltose wieder eluiert wurden, ließen sich erneut das Exu-Protein und drei neue Kandidaten identifizieren: CG3213, CG12470 und CG1898. Das Protein Exu hat eindeutig eine Funktion bei der Translationskontrolle: seine Abwesenheit führt zum Abbau der kontrollierten mRNAs. Die Inkubation mit exu-defizientem Protein-Extrakt (aus Hoden) unterstützt keine RNP-Komplexbildung und aufgereinigtes Exu-His Fusionsprotein kann auch nicht direkt an die Mst87F mRNA binden. Ein exu-defizienter Proteinextrakt lässt sich aber durch die Zugabe von rekombinantem Exu-His komplettieren und es entsteht wieder ein starker mRNP-Komplex. Dies beweist, dass das Experiment im Prinzip korrekt verläuft und dass Exu für die Komplexbildung entscheidend ist. Darüber hinaus konnten durch eine Co-Immunpräzipitation mit dem Exu-GFP Fusionsprotein sowohl interagierende Proteine als auch in die RNP-Komplexe einbezogene mRNAs nachgewiesen werden. Vielversprechende Kandidatenproteine stammen von den Genen CG3213, dfmr1 und CG12470. Die durch cDNA-Synthese in den Komplexen nachgewiesenen mRNAs sind in aller Regel solche, die der Translationskontrolle unterworfen sind. Damit ist gezeigt, dass Exu Teil eines großen Proteinkomplexes ist oder zumindest mit ihm assoziiert ist, der auf viele translationskontrollierte Transkripte Einfluss nimmt. Die Mst87F mRNA wird zum Zeitpunkt der Translationsaktivierung sekundär polyadenyliert, das heißt ihre Länge wird größer und heterogen. In einer Mutante für das Kandidatengen poe wurde diese sekundäre Polyadenylierung plötzlich nicht mehr beobachtet und die RNA blieb auch bei Translationsaktivierung so groß wie in den frühen Stadien. So ergab sich die Möglichkeit, endlich zu prüfen, ob die sekundäre Polyadenylierung für die Translationsaktivierung von essentieller Bedeutung ist. Eine Serie von Fusionskonstrukten mit funktionstüchtigem TCE verhielten sich alle gleich. Die sekundäre Polyadenylierung fand nicht statt, aber das Transkript des Fusionsgens wurde zum richtigen Zeitpunkt translatiert. Somit ist dieser Prozess zumindest nicht generell für eine Translation zu diesem späten Zeitpunkt in der Spermiogenese notwendig. Ein quantitativer Effekt kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnten mit antisense Konstrukten mutante Phänotypen erzeugt werden. Solche Männchen waren ausnahmslos steril, was die Wichtigkeit des Proteins Poe für den Prozess der Spermienreifung belegt. Die Defekte zeigen sich spät während der Individualisierung, was mit der vermuteten Funktion übereinstimmen würde. Das Kandidatenprotein dFMR1 bindet allein an die Mst87F RNA und trägt zur Stärke des beobachtbaren Komplexes bei. Die Komplexbildung zeigt Salzabhängigkeit, wie sie für dFMR1 in anderen Zusammenhängen dokumentiert wurde. Dies unterstützt die obige Aussage und suggeriert, dass dFMR1 die Basis für den Komplexaufbau bildet. Das CPEB-homologe Kandidatenprotein Orb2 bindet ebenfalls allein an die Mst87F mRNA, hat aber keinen Einfluss auf die Repression oder die sekundäre Polyadenylierung. Eine Beteiligung an der Regulation wäre demnach eindeutig unterschiedlich zu der in anderen Fällen dokumentierten Rolle. Die Expression der Kandidatengene CG1898, CG3213 und CG12470 ist konform mit einer unterschiedlichen Beteiligung an der Translationskontrolle. Das erste Protein ist nur in prämeiotischen Stadien, das zweite durchgängig und das dritte nur in postmeiotischen Stadien nachzuweisen, was einer Funktion bei der Stillegung, während der gesamten inaktiven Phase bzw. bei der Aktivierung entsprechen könnte. Die verschiedenen Experimente identifizieren in mehreren Fällen die gleichen Kandidatenproteine und untermauern damit deren Bedeutung. Sie lassen vielfach konkrete Schlüsse auf die Art der Interaktionen zu, welche in einem Schema zusammengefasst werden.

mRNA binding protein mrnp 41 localizes to both nucleus and cytoplasm

We have identified and molecularly characterized a human protein with a Mr of 40,880 Da. After UV irradiation of HeLa cells, this protein was cross-linked to poly(A)-containing mRNA and was therefore designated mrnp 41 (for mRNA binding protein of 41 kDa). Cell fractionation and immunoblotting showed mrnp 41 in both the cytoplasm and the nucleus and particularly in the nuclear envelope. Immunofluorescence microscopy localized mrnp 41 to distinct foci in the nucleoplasm, to the nuclear rim, and to meshwork-like structures throughout the cytoplasm. The cytoplasmic meshwork staining was disrupted by prior treatment of cells with the actin filament- or microtubule-disrupting drugs cytochalasin or nocodazole, respectively, suggesting association of mrnp 41 with the cytoskeleton. Double immunofluorescence with antibodies against mrnp 41 and the cytoplasmic poly(A) binding protein showed colocalization to the cytoplasmic meshwork. Immunogold electronmicroscopy confirmed mrnp 41’s cytoplasmic and nucleoplasmic localization and revealed a striking labeling of nuclear pore complexes. Together these data suggest that mrnp 41 may function in nuclear export of mRNPs and/or in cytoplasmic transport on, or attachment to, the cytoskeleton. Consistent with a role of mrnp 41 in nuclear export are previous reports that mutations in homologs of mrnp 41 in Schizosaccharomyces pombe, designated Rae1p, or in Saccharomyces cerevisiae, designated Gle2p, result in mRNA accumulation in the nucleus although it is presently not known whether these homologs are mRNA binding proteins as well.

Perinuclear Mlp proteins down-regulate gene expression in response to a defect in mRNA export

Résumé Une caractéristique des cellules eucaryotes est le confinement du matériel génétique (ADN/DNA) dans le noyau. Pour décoder cette information, un ARN messager (mRNA) est d'abord transcrit sous forme d'un ARN prémessager (pré-mRNA). Ce-dernier doit subir plusieurs étapes de maturation pour aboutir à une particule ribonucléoprotéique (mRNP) qui sera exportée vers le cytoplasme et traduite en protéine. La protéine de levure Mex67p et son homologue humain TAP sont des récepteurs d'export médiant la translocation du mRNP au travers des complexes du pore nucléaire (NPC). Mex67p/TAP ne se lient pas directement au mRNA, mais nécessitent la présence de protéines adaptatrices, telles que Yra1p et son homologue humain REF1. Afin d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans l'export des mRNPs ou de nouvelles fonctions pour Yra1p, nous avons effectué un crible génétique avec un mutant thermosensible de Yra1p, GFP-yra 1 -8. Ce mutant présente un défaut d'export des mRNAs et une diminution des niveaux de transcrits du gène rapporteur LacZ ainsi que de certains transcrits endogènes. Nous avons trouvé que la perte de Mlp2p, ou d'une protéine hautement similaire, Mlp1p, restaure la croissance du mutant GFP-yra1-8 à température restrictive. Mlp1p et Mlp2p sont des protéines nucléaires, dont l'homologue humain est TPR. Les Mlp (myosin¬like proteins) ainsi que TPR forment des structures filamenteuses ancrées aux NPC. Bien que la fonction des Mlp ne soit pas clairement définie, un rôle dans la biogenèse et la surveillance des mRNPs a été récemment proposé. Notre étude montre que la perte des Mlp, non seulement restaure la croissance de GFP-yra1-8, mais augmente aussi les niveaux des transcrits LacZ et facilite leur apparition dans le cytoplasme. Des expériences d'immunoprécipitations de la chromatine révèlent que Mlp2p diminue le taux de synthèse du transcrit LacZ dans GFP-yra1-8. Des analyses du transcriptome montrent que Mlp2p réduit aussi les niveaux d'une population de transcrits endogènes dans le mutant. Finalement, des localisations in situ suggèrent que la transcription du rapporteur LacZ a lieu à la périphérie du noyau, à proximité des Mlp. Ainsi, les protéines Mlp pourraient préférentiellement diminuer la transcription de gènes exprimés à la périphérie nucléaire. Nous montrons aussi que Yra1p interagit génétiquement avec Nab2p une protéine liée au mRNA et impliquée dans son export, mais non avec d'autres protéines également impliquées dans l'export des mRNAs. Les résultats obtenus soutiennent un modèle où les protéines Yra1p et Nab2p sont nécessaires à l'arrimage des mRNPs sur la plate-forme des Mlp. Si ces signaux manquent ou sont défectueux, les mRNPs ne peuvent pas poursuivre leur trajet vers le canal central du NPC. Ce bloc induirait par la suite une diminution de la transcription d'une population de gènes potentiellement localisée à la périphérie nucléaire. Dans son ensemble, cette étude suggère que les protéines Mlp établissent un lien entre la transcription de certains mRNAs et leur export au travers du pore nucléaire. Summary A hallmark of the eukaryotic cell is the packaging of DNA in the nucleus. To decode the genetic information, a messenger RNA (mRNA) is first synthesized as a pre-mRNA molecule, which undergoes different maturation steps resulting in an mRNP (messenger RNA ribonucleoprotein), which can be actively transported to the cytoplasm and translated into a protein. Yeast Mex67p and its human homologue TAP are export receptors mediating mRNP translocation through the nuclear pore complex (NPC). The recruitment of Mex67p/TAP to mRNA is mediated by mRNA export adaptors of the evolutionarily conserved REF (RNA and Export Factor binding) family: yeast Yra1p and human REF1. To uncover new functions of Yra1p or new factors implicated in mRNA export, we performed a genetic screen with a themiosensitive (ts) yra1 mutant, GFP-yra1-8. This mutant exhibits mRNA export defects and a decrease in the levels of LacZ reporter and certain endogenous transcripts. We found that the loss of Mlp2p, or the related Mlp1p protein, substantially rescues the growth defect of the GFP-yra1 -8 mutant. Mlp1p and M1p2p are large non-essential proteins, homologous to human TPR, proposed to form intra-nuclear filamentous structures anchored at the NPC. Their role is not clearly defined, but they have been implicated in mRNP biogenesis and surveillance. Our study shows that loss of Mlp proteins not only restores growth of GFP-yra1-8, but also rescues LacZ mRNA levels and increases their appearance in the cytoplasm. Chromatin immunoprecipitation and pulse chase experiments indicate that Mlp2p down-regulates LacZ mRNA synthesis in GFP-yra1-8. DNA micro- array analyses reveal that Mlp2p also reduces the levels of a subset of cellular transcripts in the yra1 mutant strain. In situ localizations suggest that LacZ transcription occurs at the nuclear periphery, in close proximity to Mlp proteins. Thus, Mlp proteins may preferentially down-regulate genes expressed at the nuclear periphery. Finally, we show that Yra1p genetically interacts with the shuttling mRNA-binding protein Nab2p and that loss of Mlp proteins rescues the growth defect of yra1 and nab2, but not other mRNA export mutants. The data support a model in which Nab2p and Yra1p are required for rnRNP docking to the Mlp platform. Lack of these signals prevents mRNPs from crossing the Mlp gate. This block may then negatively feed-back on the transcription of a subset of genes, potentially located at the nuclear envelope. Overall, this study suggests that perinuclear Mlp proteins establish a link between mRNA transcription and export.

Nuova Pianta di Roma : Data in Luce da Giambattista Nolli l’Anno MDCCXLVIII

Tämä yksityiskohtainen Rooman kaupungin kartta on kuuluisa kaupunkihistorian ja -suunnittelun klassikko. Kartan tekijä Nolli (ca. 1692-1756) aloitti työnsä 1736 ja työskenteli 12 vuotta tutkien ja mitaten tarkasti kaupungin rakennukset, tontit, ja rakenteet. Lopputuloksensa syntyi Nuova pianta di Roma, usein vain Pianta grandeksi kutsuttu. Nolli määrittelee kaupungin paikat sen mukaan, ovatko ne julkisia tai puolijulkisia. Kaupungin vanhat ja modernit monumentit, kirkot, teatterit, puutarhat, torit, kadut ja pasaasit, joihin yleisöllä on pääsy, kuvataan valkoisella, yksityiset tilat on sävytetty tumman harmaiksi. Julkisiin rakennuksiin liittyvät arkkitehtuurisuunnitelmat on liitetty niiden oheen. Mukana on myös antiikin arkeologisten tilojen suunnitelmia, kuten Diokletianuksen kylpylät ja Colosseum, joiden kohdalla restauroidut osat on merkitty valkoisella. Kartta siis dokumentoi Rooman kulttuurisen ja taiteellisen tilan 1700-luvulla, aikana jolloin Rooma oli eurooppalaisen intelligentsian Grand Tourien määränpää.

Junan matkustajainformaatiojärjestelmän ohjaaminen

Matkustajat pitävät junissa annettavaa informaatiota entistä tärkeämpänä. Tähän haasteeseen pyritään vastaamaan rutiinikuulutusten, kuten asemille tulokuulutusten, automatisoinnilla. Kuulutukset soitetaan ääneen ja esitetään tekstinä näytöillä. Tällöin annettava informaatio on selkeää ja tasalaatuista myös vieraalla kielellä. Junan tiedot, kuten määränpää ja vaunun myyntinumero, esitetään junan ulkoseinällä ovien vierellä junaan nousevia matkustajia varten. Tässä diplomityössä luodaan yleiskatsaus junaväylään liittyviin standardeihin, TCN-standardiin ja UIC-556-määrelehteen. Yleiskatsauksen lisäksi käsitellään tarkemmin matkustajainformaatiojärjestelmään liittyvät osat. Tutustumme myös UIC-176-määrelehteen, joka käsittelee matkustajainformaatiojärjestelmän näyttöjä. Luomme yleiskatsauksen EKE-Elektroniikka Oy:n kehittämään modulaariseen junanhallintajärjestelmään. Työssä suunnitellaan asiakkaan ja standardien vaatimusten pohjalta matkustajainformaatiojärjestelmä, joka on integroitu junanhallintajärjestelmään. Tekstitiedon välittämiseen vaunusta toiseen käytetään WTB-junaväylää. Siinä kommunikoidaan UIC-556-määrelehden mukaisesti, joka mahdollistaa eurooppalaisen yhteensopivuuden. Työn tuloksena on määritelty järjestelmän fyysinen rakenne, ohjelmistorakenne, vaadittavat tietokannat, tiedon syöttäminen järjestelmälle ja junaväylässä käytettävät telegrammit. Erityishaasteena on ratkaistu tilanne, jossa juna jakautuu matkan varrella useampaan suuntaan.

Parodia kirjallisuudentutkimuksesta. Mika Waltarin Neljä päivänlaskua metafiktiivisenä romaanina

Tutkielman tarkoituksena on tutkia Mika Waltarin romaanin Neljä päivänlaskua (1949) lajityypin hahmottumista kertojahahmojen luotettavuuden kautta. Neljä päivänlaskua on aikaisemmissa tutkimuksissa tulkittu Waltarin omaelämäkerrallisena päiväkirjaromaanina ja tätä tulkintaa tukevat romaanin lukuisat paratekstit ja Neljän päivänlaskun Waltarin elämään viittaava kertomus. Tutkielman tavoitteena on osoittaa, että romaani pitää sisällään aineksia paljon monipuolisempaan tarkasteluun. Motiivina on haastaa suomalainen kirjallisuushistoria ja aiemmat Waltari-tutkimukset osoittamalla, että Neljä päivänlaskua on jo aikakaudelleen poikkeuksellinen suomalainen romaani ja se on maamme ensimmäisiä postmodernistisia ja metafiktiivisiä romaaneja. Neljässä päivänlaskussa on kaksi erilaista kertojahahmoa, joista jälkimmäinen erottuu siten, että hänen kerrontatapansa on lähes pelkästään loppuviitteiden merkitsemistä. Ensimmäinen kertojahahmo kertoo fantastisia aineksia sisältävän kertomuksen kokemistaan kummallisuuksista ja kirjoittamisesta. Jälkimmäinen kertoja kommentoi tätä kerrontaa korostetun epäpätevästi ja epätieteellisesti. Yhdessä kertojahahmot tuottavat varsin metafiktiivisen romaanikokonaisuuden. Kun Neljää päivänlaskua pidetään yleisesti Sinuhe egyptiläisen työpäiväkirjana, niin tutkielmani osoittaa, että näiden romaanien välillä on vahva yhteys, mutta se ei perustu niiden tekijä Waltariin. Romaanien todellisuudet limittyvät toisiinsa, ne käyvät dialogia keskenään ja toistavat samantapaista kertomusta, joissa fakta ja fiktio sekoittuvat erottamattomasti. Neljän päivänlaskun ja Sinuhe egyptiläisen yhteyttä voi luonnehtia postmodernistiseksi. Keskeisiä teoreettisia käsitteitä ovat metafiktio ja postmodernismi. Tutkielmassa keskeisiä teoreetikkoja ovat Mika Hallila, Sari Salin ja Dorrit Cohn, sekä väittelykumppaneita ovat lukuisat Waltari-tutkijat, kuten Markku Envall ja Panu Rajala. Lajityypin ja kertojahahmojen luotettavuuden analysointi tuo tutkielmaan monia elementtejä, jotka tukevat teoreettista viitekehystä. Kun romaanin lajityyppi hahmottuu postmodernismin kautta, tutkimuskysymykseen vastaaminen yllättää: sillä ei ole väliä, pitääkö Neljän päivänlaskun kertojia luotettavina. Matka tähän toteamukseen osoittautui tärkeäksi, ei määränpää.

Caractérisation des complexes ribonucléoprotéiques de Staufen1 et Staufen2

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.

Dissection du processus d’export des ARNm nucléaires par des approches de molécules uniques chez Saccharomyces cerevisae

Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm.

Isolation and functional characterization of Hrp65-binding proteins in Chironomus tentans

It is well-established that the organization of nuclear components influences gene expression processes, yet little is known about the mechanisms that contribute to the spatial co-ordination of nuclear activities. The salivary gland cells of Chironomus tentans provide a suitable model system for studying gene expression in situ, as they allow for direct visualization of the synthesis, processing and export of a specific protein-coding transcript, the Balbiani ring (BR) pre-mRNA, in a nuclear environment in which chromatin and non-chromatin structures can easily be distinguished. The RNAbinding protein Hrp65 has been identified in this model system as a protein associated with non-chromatin nucleoplasmic fibers, referred to as connecting fibers (CFs). The CFs associate with BR RNP particles in the nucleoplasm, suggesting that Hrp65 is involved in mRNA biogenesis at the post-transcriptional level. However, the function of Hrp65 is not known, nor is the function or the composition of CFs. In the work described in this thesis, we have identified by yeast two-hybrid screening and characterized different proteins that bind to Hrp65. These proteins include a novel hnRNP protein in C. tentans named Hrp59, various isoforms of Hrp65, the splicing- and mRNA export factor HEL/UAP56, and a RING-domain protein of unknown function. Immuno-electron microscopy experiments showed that Hrp59 and HEL are present in CFs, and in larger structures in the nucleoplasm of C. tentans salivary gland cells. Hrp59 is a C. tentans homologue of human hnRNP M, and it associates cotranscriptionally with a subset of pre-mRNAs, including its own transcript, in a manner that does not depend quantitatively on the amount of synthesized RNA. Hrp59 accompanies the BR pre-mRNA from the gene to the nuclear envelope, and is released from the BR mRNA at the nuclear pore complex. We have identified the preferred RNA targets of Hrp59 in Drosophila cells, and we have shown that Hrp59 binds preferentially to exonic splicing enhancer sequences. Hrp65 self-associates through an evolutionarily conserved domain that can also mediate heterodimerization of Hrp65 homologues. Different isoforms of Hrp65 interact with each other in all possible combinations, and Hrp65 can oligomerize into complexes of at least six molecules. The interaction between different Hrp65 isoforms is crucial for their intracellular localization, and we have discovered a mechanism by which Hrp65-2 is imported into the nucleus through binding to Hrp65-1. Hrp65 binds to HEL/UAP56 in C. tentans cells. We have analyzed the distribution of the two proteins on polytene chromosomes and in the nucleoplasm of salivary gland cells, and our results suggest that Hrp65 and HEL become associated during posttranscriptional gene expression events. HEL binds to the BR pre-mRNP cotranscriptionally, and incorporation of HEL into the pre-mRNP does not depend on the location of introns along the BR pre-mRNA. HEL accompanies the BR mRNP to the nuclear pore and is released from the BR mRNP during translocation into the cytoplasm.

Mammalian pre-mRNA 3' end processing factor CF I m 68 functions in mRNA export

Export of mRNA from the nucleus is linked to proper processing and packaging into ribonucleoprotein complexes. Although several observations indicate a coupling between mRNA 3' end formation and export, it is not known how these two processes are mechanistically connected. Here, we show that a subunit of the mammalian pre-mRNA 3' end processing complex, CF I(m)68, stimulates mRNA export. CF I(m)68 shuttles between the nucleus and the cytoplasm in a transcription-dependent manner and interacts with the mRNA export receptor NXF1/TAP. Consistent with the idea that CF I(m)68 may act as a novel adaptor for NXF1/TAP, we show that CF I(m)68 promotes the export of a reporter mRNA as well as of endogenous mRNAs, whereas silencing by RNAi results in the accumulation of mRNAs in the nucleus. Moreover, CF I(m)68 associates with 80S ribosomes but not polysomes, suggesting that it is part of the mRNP that is remodeled in the cytoplasm during the initial stages of translation. These results reveal a novel function for the pre-mRNA 3' end processing factor CF I(m)68 in mRNA export.

Stress-induced targeting of molecular chaperones in the yeast Saccharomyces cerevisiae

The eukaryotic stress response is an essential mechanism that helps protect cells from a variety of environmental stresses. Cell death can result if cells are not able to properly adapt and protect themselves against adverse stress conditions. Failure to properly deal with stress has implications in human diseases including neurodegenerative disorders and distinct cancers, emphasizing the importance of understanding the eukaryotic stress response in detail. As part of this response, expression of a battery of heat shock proteins (HSP) is induced, which act as molecular chaperones to assist in the repair or triage of unfolded proteins. The 90-kDa HSP (Hsp90) operates in the context of a multi-chaperone complex to promote the maturation of nuclear and cytoplasmic clients. I have discovered that Hsp90 and the co-chaperone Sba1 accumulate in the nucleus of quiescent Saccharomyces cerevisiae cells in a karyopherin-dependent manner. I isolated nuclear accumulation- defective HSP82 mutant alleles to probe the nature of this targeting event and identified a mutant with a single amino acid substitution (I578F) sufficient to prevent nuclear accumulation of Hsp90 in quiescent cells. Diploid hsp82-I578F cells exhibited pronounced defects in spore wall construction and maturation, resulting in catastrophic sporulation. The mislocalization and sporulation phenotypes were shared by another previously identified HSP82 mutant allele, further linking localization to Hsp90 functional status. Pharmacological inhibition of Hsp90 with macbecin in sporulating diploid cells also blocked spore formation, underscoring the importance of this chaperone in this developmental program. The yeast molecular chaperone Hsp104 is a member of the Hsp100 superfamily of AAA+ ATPases. Unlike the Hsp90 family of chaperones, Hsp104 is not restricted to a specific set of client proteins, but rather assists in reactivating stress-denatured proteins by solubilizing protein aggregates. I have discovered that Hsp104, along with the Hsp70 chaperone, Ssa1, and the sHSP Hsp26 accumulate into RNA processing bodies (P- bodies) and stress granules, sites of mRNA metabolism. I found that Hsp104 recruits both Ssa1 and Hsp26 to P-bodies and that these three chaperones are required for stress granule formation. These findings suggest a possible role for chaperones in mRNA metabolism by aiding in the assembly, disassembly or conversion of these enigmatic mRNP complexes. Taken together, the work presented in this dissertation serves to better understand the eukaryotic stress response by illustrating the importance of subcellular-chaperone localization in key biological processes.