Poli-fosforilação de um componente estrutural do esporo de Bacillus subtilis

A superfície dos esporos bacterianos é constituída por uma estrutura multi-proteica, denominada manto, com funções de proteção e de interação com o meio circundante. CotB é um componente abundante do manto do esporo de Bacillus subtilis. Durante a formação do manto, a proteína CotB, de 46 kDa (CotB-46), sofre uma modificação pós-traducional, que a converte numa espécie com uma mobilidade eletroforética de 66 kDa (CotB-66). Outras duas proteínas do manto, CotH e CotG, são necessárias para a formação de CotB-66. CotH é uma proteína morfogenética essencial para a montagem do manto, e um homólogo estrutural de cinases Ser/Thr de tipo eucariota. CotB, por seu lado, possui quatro repetições de uma sequência rica em serinas/lisinas/argininas na sua metade Cterminal, enquanto que a metade N-terminal contém dois domínios Sm-like, associados normalmente a interações RNA-RNA e RNA-proteína. A super-expressão de cotB em E. coli resulta numa proteína de 46 kDa, mas a co-expressão de cotB com cotG e cotH leva à produção de uma forma de CotB de 66kDa. Na ausência de CotG ou de CotH ou na presença de uma forma inativa de CotH, com a substituição D228Q no seu centro ativo putativo, não se verifica a formação de CotB-66. CotH sofre auto-fosforilação e é insensível ao inibidor de largo espectro staurosporina. Além disso, mostramos que CotB-46 é fosforilado diretamente por CotH in vitro. Descobrimos que a substituição D228Q resulta em alterações na composição, estrutura e propriedades do manto que se aproximam daquelas causadas por uma mutação de eliminação do gene. Mostramos que a modificação de CotB in vivo é dependente de CotG e da atividade de cinase de CotH. Sugerimos que durante a formação do manto de B. subtilis CotH fosforila CotB na sua metade C-terminal, usando CotG como co-fator.

Isolamento e caracterização de uma proteína tóxica produzida por um isolado açoriano de Bacillus weihenstephanensis

Dissertação de Mestrado, Biotecnologia em Controlo Biológico, 27 de Junho de 2013, Universidade dos Açores.

Novos circuitos regulatórios de controlo espacio-temporal do desenvolvimento em bacillus subtilis

RESUMO: A esporulação em Bacillus subtilis é controlada por uma cascata de factores sigma da polimerase do RNA. F e E controlam os estágios precoces do desenvolvimento no pré-esporo e na célula mãe, respectivamente. Numa fase intermédia da diferenciação, quando a célula mãe acaba por envolver o pré-esporo, F é substituído por G e E é substituído por K. Vários mecanismos asseguram que a actividade dos diferentes factores sigma seja confinada a uma janela temporal precisa na célula adequada. Neste estudo, investigámos a função de um factor anti-G, designado por CsfB. Mostramos que para além da sua função de inibição da actividade do factor G em células pré-divisionais, CsfB é também necessário na célula mãe num estágio tardio do desenvolvimento. Mostramos que a expressão de csfB é activada na célula mãe a partir de um promotor dependente de K. Contudo, demonstramos que CsfB interage directamente com E e não com K, e que CsfB é suficiente para inibir a actividade transcricional dependente de E em células vegetativas de B. subtilis. Propomos que CsfB contribui para reduzir o período dependente de E, na linha de expressão genética da célula mãe, desse modo reduzindo a sobreposição entre os regulões E e K e aumentado a fidelidade do processo de desenvolvimento. Uma segunda proteína, YabK, partilha semelhança estrutural com CsfB. YabK é produzida no pré-esporo sob o comando de F, e é necessária para a esporulação. YabK contribui para a transição F/G no programa genético do pré-esporo, porque uma mutação que torna F sensível a CsfB ultrapassa parcialmente a função de YabK na esporulação. No entanto, YabK e CsfB funcionam por mecanismos diferentes, uma vez que YabK não liga directamente a F.---------ABSTRACT: Gene expression during spore development in Bacillus subtilis is governed by a cascade of RNA polymerase sigma factors. F and E control the early stages of development in the forespore and in the mother cell, respectively. At an intermediate stage in the differentiation process, when the larger mother cell finishes engulfment of the smaller forespore, F is replaced by G and E is replaced by K. Several mechanisms ensure the proper timing of activation of the cell type-specific sigma factors. Here, we have investigated the funtion of an anti-sigma G factor, called CsfB. We show here that in addition to its role in inhibiting G in pre-divisional cells, CsfB is also required in the mother cell at a late stage in development. We show that the expression of csfB is activated in the mother cell from a K-specific promoter. However, we demonstrate that CsfB binds directly to E but not to K in a yeast two-hybrid assay, and that CsfB is sufficient to inhibit E-dependent transcriptional activity in vegetative cells of B. subtilis. We posit that CsfB contributes to shutting off the early, E-controlled period in the mother cell line of gene expression, thus reducing the overlap between deployment of the E and K regulons and increasing the fidelity of the developmental process. A second protein, YabK, shares structural similarity with CsfB. YabK is produced in the forespore under F control, and is required for efficient sporulation. YabK contributes to the transition from the F- to the G-dependent period of gene expression, because a mutation that renders F sensitive to CsfB partially bypasses the need for YabK. Yet, YabK and CsfB must function in the control of sigma factor activity by different mechanisms because YabK does not bind directly to F.

Caraterização geotécnica na análise da estabilidade de taludes naturais - o caso de São Martinho do Porto

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Geológica (Geotecnia)

Exploring the relationship between toxin and spore production in the human enteric pathogen Clostridium difficile

RESUMO: Clostridium difficile é presentemente a principal causa de doença gastrointestinal associada à utilização de antibióticos em adultos. C. difficile é uma bactéria Gram-positiva, obrigatoriamente anaeróbica, capaz de formar endósporos. Tem-se verificado um aumento dos casos de doença associada a C. difficile com sintomas mais severos, elevadas taxas de morbilidade, mortalidade e recorrência, em parte, devido à emergência de estirpes mais virulentas, mas também devido à má gestão do uso de antibióticos. C. difficile produz duas toxinas, TcdA e TcdB, que são os principais fatores de virulência e responsáveis pelos sintomas da doença. Estas são codificadas a partir do Locus de Patogenicidade (PaLoc) que codifica ainda para um regulador positivo, TcdR, uma holina, TcdE, e um regulador negativo, TcdC. Os esporos resistentes ao oxigénio são essenciais para a transmissão do organismo e recorrência da doença. A expressão dos genes do PaLoc ocorre em células vegetativas, no final da fase de crescimento exponencial, e em células em esporulação. Neste trabalho construímos dois mutantes de eliminação em fase dos genes tcdR e tcdE. Mostrámos que a auto-regulação do gene tcdR não é significativa. No entanto, tcdR é sempre necessário para a expressão dos genes presentes no PaLoc. Trabalho anterior mostrou que, com a exceção de tcdC, os demais genes do PaLoc são expressos no pré-esporo. Mostrámos aqui que TcdA é detectada à superfície do esporo maduro e que a eliminação do tcdE não influencia a acumulação de TcdA no meio de cultura ou em associação às células ou ao esporo. Estas observações têm consequências para o nosso entendimento do processo infecioso: sugeremque o esporo possa ser também um veículo para a entrega da toxina nos estágios iniciais da infecção, que TcdA possa ser libertada durante a germinação do esporo, e que o esporo possa utilizar o mesmo receptor reconhecido por TcdA para a ligação à mucosa do cólon.---------------------------ABSTRACT: Clostridium difficile is currently the major cause of antibiotic-associated gastrointestinal diseases in adults. This is a Gram-positive bacterium, endospore-forming and an obligate anaerobe that colonizes the gastrointestinal tract. Recent years have seen a rise in C. difficile associated disease (CDAD) cases, associated with more severe disease symptoms, higher rates of morbidity, mortality and recurrence, which were mostly caused due to the emergence of “hypervirulent” strains but also due to changing patterns of antibiotics use. C. difficile produces two potent toxins, TcdA and TcdB, which are the main virulence factors and the responsible for the disease symptoms. These are codified from a Pathogenicity Locus (PaLoc), composed also by the positive regulator, TcdR, the holin-like protein, TcdE, and a negative regulator, TcdC. Besides the toxins, the oxygen-resistant spores are also essential for transmission of the organism through diarrhea; moreover, spores can accumulate in the environment or in the host, which will cause disease recurrence. The expression of the PaLoc genes occurs in vegetative cells, at the end of the exponential growth phase, and in sporulating cells. In this work, we constructed two in-frame deletion mutants of tcdR and tcdE. We showed that the positive auto regulation of tcdR is not significant. However, tcdR is always necessary for the expression of the PaLoc genes. A previous work showed that, except tcdC, all the PaLoc genes are expressed in the forespore. Here, we detected TcdA at the spore surface. Furthermore, we showed that the in-frame deletion of tcdE does not affect the accumulation of TcdA in the culture medium or in association with cells or spores. This data was important for us to conclude about the infeccious process: it suggests that the spore may be the vehicle for the delivery of TcdA in early stages of infection, that TcdA may be released during spores germination and that this spore may use the same receptor recognized by TcdA to bind to the colonic mucosa.

Ultraestrutura de Protozoários parasitas de Peixes da região Amazônica

Neste trabalho descrevemos alguns detalhes ultraestruturais de novas espécies de protoparasitas do phylum Myxozoa (Henneguya adherens, Η. malabarica, Η. striolata, Η. testicularis, Tetrauronema desaequalis and Myxobolus braziliensis), recentemente encontrados e descritos em peixes da bacia amazônica. São descritos os aspectos ultraestruturais do ciclo de vida dos parasitas, incluindo o esporo, vetor biológico responsável pela transmissão do parasita. Por outro lado, é analizada a ação do parasita no hospedeiro e referidos efeitos nefastos da ação parasitária.

Estudo paleoetnobotânico do povoado da Idade do Ferro do Crastoeiro (Noroeste de Portugal)

Dissertação de mestrado em Arqueologia

A new species of Neosilba (Diptera, Lonchaeidae) from Brazil

A new species of Neosilba McAlpine, 1962, N. pradoi sp. nov., is described and illustrated. This new species was found in the south of Brazil (Rio Grande do Sul and Santa Catarina), in the southeast (State of São Paulo) and center west (State of Mato Grosso do Sul). It has been reared from fruits of guava (Psidium guajava, Myrtaceae), "araçá" (Psidium cattleyanum, Myrtaceae), "guabiroba" (Campomanesia xanthocarpa, Myrtaceae), Surinam cherry (Malpighia emarginata, Malpighiaceae), cherry (Prunus avium, Rosaceae), orange (Citrus sinensis, Rutaceae), "ingá" (Inga laurina, Fabaceae), "esporão-de-galo" (Celtis iguanae, Ulmaceae) and passion fruit (Passiflora edulis, Passifloraceae).

Mutante espontâneo de Bacillus licheniformis bloqueado no estágio I da esporogênese, possuidor de metabolismo respiratório aumentado

Um mutante espontâneo de Bacillus licheniformis, derivado da amostra esporogênica 2390, foi estudado com vistas ao reconhecimento do estágio da evolução para esporo em que o mesmo se encontrava bloqueado. Eletronmicrografias sugeriram que as células desse mutante, colhidas durante a fase estacionária da curva de crescimento, não ultrapassaram o estágio I da esporogênese (i.e., permaneceram com o nucleóide disposto como filamento axial), enquanto a produção de antibiótico (bacitracina) e a atividade proteolítica foram francamente detectadas. A linhagem mutante, designada Spolp-72, nas condições experimentais empregadas não biossintetizou esporos por estarvação em solução de sais inorgãnicos, mas evidenciou uma frequência de esporulação menor que 10*-7, após crescimento vegetativo em meio de cultura favorável á esporogênese. A amostra Spolp-72 externa um crescimento vegetativo inicial restringido, quando comparada com a amostra 2390, enquanto que, inversamente, sua atividade respiratória é significativamente mais elevada. Este último comportamento foi confirmado no presente trabalho, contrastando, nesse particular, com outros tipos de mutantes de esporulação já descritos, os quais se encontram bloqueados nos primeiros estágios da via esporogenética.

Novas ocorrências e descrição da fêmea de Mysteria darwini (Lameere) (Coleoptera, Vesperidae, Anoplodermatinae)

A fêmea de Mysteria darwini é descrita e novos registros da espécie no sul do Brasil são fornecidos. A fêmea tem antenas curtas, olhos pequenos, as asas são mais curtas do que as do macho e o esporão tibial posterior é reduzido.

Notas sobre o tipo de Trigona limao Smith (Hymenoptera, Apidae, Lestrimelitta)

O nome limao tem sido usado para espécies distintas do gênero Lestrimelitta. O material-tipo de Smith depositado no The Natural History Museum (Londres) foi examinado. A operária de L. limao é descrita e o lectótipo para Trigona limao Smith, 1863 é designado. Esta espécie encontra-se restrita aos cerrados da porção central do Brasil, de São Paulo ao Maranhão. Distingue-se de outras espécies pelos seguintes caracteres diagnósticos: vértice com pouquíssimas cerdas eretas, muito finas e curtas, restritas à região interocelar; bordo anterior do mesoscuto com cerdas eretas castanhas nas laterais; laterais do mesepisterno com cerdas eretas esparsas e restritas à porção ventral e curvatura entre porções lateral e ventral, tornando-se mais longas próximo à base da coxa média; contorno da abertura do espiráculo propodeal, aproximadamente 2,5 x mais longo do que largo; flancos do propódeo coberto por pilosidade decumbente esbranquiçada, fina e ramificada; esporão mesotibial muito reduzido; tergo metassomal 1 com cerdas enegrecidas nas porções laterais.

Revisão taxonômica das espécies brasileiras de abelhas do gênero Lestrimelitta Friese (Hymenoptera, Apidae, Meliponina)

Revisão taxonômica das espécies de abelhas do gênero Lestrimelitta Friese (Hymenoptera, Apidae, Meliponina) que ocorrem no Brasil. Com base em caracteres morfológicos, como aqueles relacionados com a pilosidade, o formato do espiráculo propodeal, as distâncias interorbitais e o comprimento do esporão mesotibial, são reconhecidas catorze espécies, seis das quais novas para a Ciência: L. ciliata. sp. nov., L. maracaia sp. nov., L. similis sp. nov., L. spinosa sp. nov., L sulina. sp. nov. e L. tropica sp. nov. São designados lectótipos para Trigona (Lestrimelitta) limao var. rufipes Friese, 1903 e Trigona (Lestrimelitta) limao var. rufa Friese, 1903. O macho de L. limao (Smith, 1863) é descrito pela primeira vez. É apresentada também uma diagnose das seguintes espécies: L. ehrhardti Friese, 1931; L. glaberrima Oliveira & Marchi, 2005; L. glabrata Camargo & Moure, 1989; L. monodonta Camargo & Moure, 1989; e L. nana Melo, 2003. São apresentados chaves de identificação para operárias e machos, ilustrações e mapas de ocorrência.

Polinização de Vochysia lucida C. Presl (Vochysiaceae) em uma área de restinga na Bahia

As espécies de Vochysia são neotropicais e apresentam flores que podem ser visitadas por abelhas, beija-flores e borboletas. Este estudo teve como objetivo a análise das interações entre as flores de Vochysia lucida e seus visitantes florais, em uma área de restinga no Estado da Bahia, Brasil. V. lucida é uma espécie arbórea e apresenta inflorescências do tipo racemo, com cerca de 100 a 170 flores. As flores são zigomorfas, amarelas e foram consideradas melitófilas. O néctar floral é produzido e estocado em esporão, localizado no cálice. O pico de floração de V. lucida ocorreu em novembro e dezembro. Durante o estudo as flores abriam às 6:00 h, quando o estigma já estava receptivo. Na abertura da flor a antera já não estava mais presente e os grãos de pólen estavam depositados na parede do estilete, ocorrendo apresentação secundária de pólen. As pétalas caíam no final da tarde, por volta das 17:00 h. Os beija-flores embora freqüentes nas flores de V. lucida foram considerados visitantes oportunistas. Entre os visitantes florais registrados, as abelhas de grande porte foram consideradas os polinizadores mais eficientes, especialmente Xylocopa frontalis, por ter morfologia e comportamento adequados para contatar as estruturas reprodutivas da flor, durante as coletas de néctar, e por sua elevada freqüência de visita.

Capacidade infectiva de fungos micorrízicos arbusculares em áreas reflorestadas após mineração de bauxita no Pará

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade infectiva das espécies de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e relacionála com o número mais provável (NMP) de propágulos infectivos e número de esporos extraídos diretamente do campo. Amostras de solo foram coletadas em áreas degradadas pela mineração de bauxita com cobertura de 2, 6, 12 e 16 anos após revegetação e em uma área de floresta primária, em Porto Trombetas, PA. Os esporos de FMA foram extraídos e identificados taxonomicamente por suas características morfológicas. A maioria das espécies apresentou comportamento diferente nas áreas em estudo. Glomus macrocarpum foi a que apresentou infectividade mais rápida e alto potencial infectivo, nos solos das cinco áreas estudadas. Esta espécie também apresentou alto NMP de propágulos e alto número de esporos em todas as áreas estudadas. A capacidade infectiva das espécies não está relacionada com a densidade de propágulos. As espécies de FMA possuem diferentes graus de tolerância às condições de solo e se comportaram de maneira diferente de acordo com a idade da revegetação.