Isolamento e caracterização de uma proteína tóxica produzida por um isolado açoriano de Bacillus weihenstephanensis

Dissertação de Mestrado, Biotecnologia em Controlo Biológico, 27 de Junho de 2013, Universidade dos Açores.

Neste trabalho, estudaram-se os isolados S122D, S150E e S168A do banco de Bacillus spp do grupo de entomoparasitologia do Centro de Investigação de Recursos Naturais da Universidade dos Açores, nos quais se tinha previamente verificado a presença de inclusões, mas que não amplificavam genes cry: S122D, S150E e S168A. A análise dos genes 16S destes isolados apresentou uma grande homologia com isolados do grupo B.cereus. A observação detalhada deste gene revelou a presença de uma assinatura psicotrófica em todos os isolados, com uma timina e uma adenina numa posição característica da espécie Bacillus weihenstephanensis. Através da análise filogenética do gene aroE, confirmou-se que os isolados S122D, S150E e S168A pertencem à espécie B. weihenstephanensis. Testou-se a toxicidade destes isolados em Ephestia kuehniella e selecionou-se o isolado S122D que registou maior mortalidade, apresentando um LD50 próximo dos 100mg de proteína bruta, para isolamento da toxina. Este isolado contém uma inclusão associada ao esporo, apresentando uma forma trapezóide quando separado do esporo, diferente da estrutura bipiramidal dos Bacillus thuringiensis. Após a lavagem das inclusões com triton X-100 e separação dos esporos dos cristais verificou-se uma drástica redução da toxicidade dos mesmos. A maior toxicidade em E. kuehniella foi detetada na fase solúvel em triton X-100, resultante da lavagem das inclusões. A toxina presente nesta fração solúvel em triton X-100 foi fracionada e purificada através de uma sequência de cromatografias num sistema FPLC. A purificação da fração tóxica foi acompanhada de ensaios de toxicidade em E. Kuehniella, apresentando a fração semi-pura uma toxicidade de 40% em 15 µg de proteína. Numa fase seguinte à purificação, foi obtida uma única banda de 63 kDa em SDS-PAGE em condições não desnaturantes e uma banda de 42 kDa quando corrida em condições desnaturantes. Esta toxina foi identificada por espetrometria de massa como sendo uma proteína homóloga a uma Phosphate-binding protein (com um número de acesso de NCBI gi|152032648) a qual designámos Bw-PDB (Bacillus weihenstephanensis- Phosphate-binding protein) A Phosphate-binding protein é, pela primeira vez, descrita em B. weihenstephanensis e identificada como sendo tóxica em Lepidópteros. Esta proteína constitui um promissor novo biopesticida.

ABSTRACT: In this paper, three strains were selected from the bank of Bacillus spp from the group of entomoparasitology of the Centre of Investigation of Natural Resources of the University of the Azores, in which the presence of inclusions had previously been verified, but that didn’t amplified cry genes: S122D, S150E and S168A. The analysis of the 16S genes from these strains showed a high homology with the Cereus group strains. A careful look over this gene indicates the presence of a psycothrophic signature in all the strains, with timine and adenine motifs in a characteristic position of the Bacillus weihenstephanensis species. Throughout the phylogenetical analysis of aroE gene, it was confirmed that the S122D, S150E and S168A strains belong to the B. Weihenstephanensis species. The toxicity of these strains was tested in Ephestia kuehniella and the strain S122D, which manifested a higher mortality, was selected, showing a LD50 near the 100 mg of total protein, in order to isolate the toxin. This strain contains an inclusion associated to the spore, with a trapezoid form, different from the bipirimidal structure of the Bacillus thuringiensis, when separated from the spore. The higher toxicity in E. Kuehniella was noticed in the soluble fase on triton X-100, after the crystal (with the spore) washing. After this washing and after isolating the spores and the crystal, a low toxicity of the spores was detected. The toxin contained in this soluble fraction in triton X-100 was fractionated and purified through a sequence of chromotographies in a FPLC system. The purification of the toxic fraction was followed by toxicity tests in E. Kuehniella. The semi-pure fraction demonstrated a toxicity of 40% in 15 µg of protein. Following the purification, a unique band of 63 kDa in SDS-PAGE was obtained in non-desnaturating conditions and a band of 42kDA in desnaturating conditions. This toxin was identified by mass spectroscopy as a homologous protein to a Phosphate-binding protein (with an access number of NCBI gi|152032648) with an assurance of 1280 (limit of 84, P < 0.05) and a coverage sequence of 64%, without knowing the organism that produces it. For the first time, this Phosphate-binding protein is described in B. Weihenstephanensis and identified as being toxic in Leptidoptera. It constitutes a promising new biopesticide.