Diagnóstico Molecular na era da sequenciação de 3ª geração e da PCR digital

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Isolamento viral e diagnóstico molecular de herpevírus canino

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Diferentes técnicas de diagnóstico empregadas na estimativa de prevalência populacional de infecção por Cryptosporidium felis em gatos domiciliados no município de Araçatuba, São Paulo

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Diferentes métodos de diagnóstico molecular na diferenciação das espécies de Sarcocystis spp

The Sarcocystis genus includes obligatory two-host life cycle protozoan parasites. It is the most numerous of the six genera of the Sarcocystidae family. The infection caused by parasites of this genus is a zoonotic and cosmopolitan disease known as sarcosistosis or sarcosporidiosis. The sarcositosis though frequently asymptomatic in its definitive hosts can be fatal in its intermediate hosts. The usual diagnoses of sarcosistosis takes place through a histological demonstration of schizonts in blood vessels and organs, and the presence of cysts in muscle tissue by necropsy or biopsy, this second method still more common and based on morphological features of the sarcocyst. However, these methods can be inadequate to a precise identification of the infector species once that, besides the genus being of numerous species, these often present similar morphological features. Another factor that makes the diagnostic more difficult is the non specificity of some Sacocystis species to their hosts. Consequently, molecular diagnostic methods have been used in order to identify the infector species and the parasite specific biological cycles, demonstrating also new species and coevolutive aspects between parasite and host. Among the most employed molecular techniques the Polimerase Chain Reaction (PCR), the nested-PCR and the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) stands out

Diagnóstico molecular da alteração mutagênica nt 230 (del4) no gene MDR1 em cães

P-glycoprotein is an adenosine triphosphate (ATP)-driven drug efflux carrier responsible for transport of xenobiotics and multiple classes of drugs, many usually use in veterinary medicine. Encoded by MDR1 gene, also referred to as ABCB1, located on chromosome 14, is expressed in many tissues with secretory or excretory functions, such as liver, kidney and intestine, where it limits drug absorption from the gut and promotes drug excretion into the bile and urine of their substrates. In 2001, a 4 base pair gene deletion mutation in the canine MDR1 gene was identified as MDR1-1▲, ABCB1-1▲, MDR1 MDR1 nt 230 (del4) and associated with an non-functional Pglycoprotein. The clinical correlation is the (hyper) sensitivity of certain dogs breeds, mostly collies, to a few classes of drugs such as anticancer drugs (doxorubicin, vincristine, vinblastine), immunosuppressants (cyclosporine), antiparasitic drugs (ivermectin, moxidectin), steroids hormones (aldosterone, cortisol, dexamethasone), antimicrobial agents (tetracycline, doxycycline, levofloxacin, ketoconazole, itraconazole), analgesics (morphine, methadone), antidiarrheals (loperamide), antiepileptic agents (phenothiazine), cardiac drugs (digoxin, diltiazem, verapamil, talinolol) and others. Dogs with homozygous MDR1 nt 230 (del4) MDR1 mutations (MDR1 - / -) have a higher predisposition to intoxication with substrates of P-gp than heterozygous (MDR1 + / -) and these are more likely than dogs homozygous nonmutant (MDR1 +/ +). After the identification of nt230 (del4) mutation, several molecular techniques have been developed for identification of mutant animals as a diagnostic method. The importance of molecular diagnosis is, after the identification of mutant animals, establish treatment protocols safe, exclude this animals from reproduction (genetic selection program) and investigating the history of adverse drugs reactions... (Complete abstract click electronic access below)

Desarrollo del diagnóstico molecular de virus exantemáticos: epidemiología molecular del virus del sarampión en España

Programa de doctorado: Microbiología y parasitología.

Diagnóstico molecular por PCR-RFLP e gene LYS2 para identificação de Fusarium decemcellulare.

Fusarium decemcellulare é encontrado como agente causal de doenças com diferentes sintomas em diversas espécies de plantas em regiões tropicais e subtropicais. Em guaranazeiro, espécie nativa da Amazônia de importância econômica e social, a doença denominada de complexo superbrotamento é atualmente um dos principais problemas da cultura. Técnicas moleculares são cada vez mais requeridas para identificação rápida e segura de patógenos como complemento as técnicas convencionais. O objetivo do trabalho foi desenvolver métodos moleculares por PCR e PCR-RFLP para rápida identificação de F. decemcellulare.

Diagnóstico molecular para o nematóide Rotylenchulus reniformis.

2008

El desarrollo de la inteligencia emocional a través de la educación emocional : algunas técnicas de diagnóstico e intervención en el aula.

Conocer y analizar el desarrollo de la inteligencia emocional, principalmente en la escuela. Veinticuatro alumnos de tercero de la E.S.O. del Instituto 'Mateo Hernández' (Salamanca), de los cuales, diecisiete fueron chicas (una con necesidades educativas especiales) y siete fueron chicos (dos con necesidades educativas especiales, y un repetidor). Todos pertenecían a familias de nivel socioeconómico medio-bajo. Este trabajo es de carácter teórico-práctico, y está estructurado en dos grandes bloques. El primero de ellos hace referencia a la fundamentación teórica del desarrollo de la inteligencia emocional, necesaria para, a la postre, abordar adecuadamente el bloque experimental o práctico. En este primer bloque se estudia y profundiza en el diagnostico y la intervención en educación (concepto y objeto del diagnóstico pedagógico; principales componentes, técnicas e instrumentos de diagnóstico; el diagnóstico y la educación emocional; la intervención y modelos de intervención -la intervención por programas, modelo de consulta colaborativa, la educación emocional como tema transversal-), en el campo de las emociones desde el punto de vista de la psicología cognitiva (concepto de emoción; principales teorías de la emoción; componentes de la emoción; funciones de la emoción; los fenómenos afectivos; las emociones básicas y complejas; la clasificación de las emociones -una propuesta de clasificación-), en la inteligencia emocional (concepto y evolución de la inteligencia emocional; componentes de la inteligencia emocional -conocimiento de las propias emociones, capacidad de controlar las emociones, capacidad de automotivarse, reconocimiento de las emociones ajenas, el control de las relaciones-; la persona emocionalmente inteligente -características de la persona emocionalmente inteligente, la competencia emocional-), y, por último, en la educación emocional (concepto de la educación emocional y justificación de la misma; objetivos y contenidos de la educación emocional; el currículum de la educación emocional; la evaluación de la educación emocional; desarrollo afectivo-emocional en la educación infantil, primaria y secundaria obligatoria; el papel del profesor en la educación emocional escolar; la educación emocional en la familia, como responsabilidad compartida con la familia). El segundo bloque es la aplicación práctica de la teoría, concretamente en el instituto 'Mateo Hernández' (Salamanca), donde se describe la muestra del estudio, los programas de intervención puestos en práctica (programa de autoestima y autoconcepto, y programa de empatía), las técnicas e instrumentos de diagnóstico empleados, que han sido adaptados a la realidad particular objeto de estudio (escalas de observación y cuestionarios de autoestima), y, finalmente se presentan los resultados de la fase experimental. Se observa una transición lenta pero muy positiva hacia la reflexión de las propias emociones y la forma en que estas se manifiestan. El respeto y la escucha activa de los compañeros fue deficitaria. Los alumnos presentaron dificultades para expresar únicamente los aspectos positivos de los compañeros. Los alumnos demostraron ser conscientes de sus rasgos positivos, aunque demostraron, al mismo tiempo, su incapacidad para expresarlo. Los alumnos demostraron tener una buena capacidad para ponerse en el lugar del 'otro', mediante actividades de role-playing. Los alumnos, aún habiendo trabajado el tema de los prejuicios, mostraron ser víctima de los mismos. Los alumnos solo se sienten dignas de aprecio en algunas ocasiones. La mitad de la muestra quiere ser otra persona, porque no se encuentran a gusto consigo mismo. Suelen evitar la autocrítica. La mayoría están satisfechos con el trabajo realizado en la escuela, aunque no están de acuerdo con las calificaciones obtenidas, deberían ser mejores. Mayoritariamente se sienten aceptados en el grupo de amigos, y consideran que tienen buenos amigos y suficientes, además, se sienten satisfechos con su forma de ser. Se consideran, mayoritariamente, personas importantes en sus familias y se sienten bien en sus familias, pero consideran que sus padres serían más felices si ellos fueran de otra manera.. La escasa amplitud de los programas ha sido evidente, por tanto, sería conveniente la ampliación de estos programas. No se puede desdeñar el valor preventivo de este tipo de programas, ya que refuerzan la personalidad de los alumnos. La evaluación de los programas es muy compleja, por el grado de subjetividad y por la imposibilidad de reconocer los resultados a corto plazo. Tuvieron gran aceptación entre los alumnos la realización de estos programas.

Identificação de alvos na terapia anti-cancerígena utilizando técnicas de modelação molecular

Miguel Fernandes

Diagnóstico molecular da talassemia ALFA+ (DELEÇÃO -3.7) em indivíduos com microcitose e/ou hipocromia

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Diagnóstico molecular da talassemia ALFA em indivíduos com microcitose e/ou hipocromia

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Vírus da leucemia felina: análise da classificação da infecção, das técnicas de diagnóstico e da eficácia da vacinação com o emprego de técnicas sensíveis de detecção viral

O Vírus da leucemia felina (FeLV) pertence à família Retroviridae, gênero Gammaretrovirus. Diferentemente de outras retroviroses, uma parcela dos gatos jovens e adultos exposta ao FeLV não apresenta antigenemia/viremia, de acordo com as técnicas convencionais de detecção viral, como isolamento em cultivo celular, imunofluorescência direta e ELISA. O emprego de técnicas de maior sensibilidade para detecção e quantificação viral, como o PCR quantitativo, permitiu a identificação de animais positivos para a presença de DNA proviral e RNA na ausência de antigenemia/viremia e, com isso, um refinamento da análise das diferentes evoluções da infecção. Assim, reclassificou-se a patogenia do FeLV em 4 categorias: infecção abortiva, regressiva, latente e progressiva. Foi possível também detectar DNA proviral e RNA em animais considerados imunes ao FeLV após vacinação. Diante disso, os objetivos desta revisão de literatura foram demonstrar as implicações da utilização de técnicas sensíveis de detecção viral na interpretação e classificação da infecção do FeLV e rever as técnicas de detecção do vírus para fins de diagnóstico. Além disso, apresentar os resultados referentes à eficácia da vacinação contra o FeLV com a utilização dessas técnicas.

Pesquisa de mutação do gene predito da lectina ligante de manose em cães: comparação entre dois alvos para diagnóstico molecular de leishmaniose visceral canina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)