Diagnóstico Molecular na era da sequenciação de 3ª geração e da PCR digital

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

O campo científico do diagnóstico molecular vive atualmente tempos áureos de desenvolvimento. A busca de tecnologias revolucionárias capazes de fornecer informação de um modo rápido, preciso e a baixo custo, nunca foi tão intensa. A descoberta do DNA e a necessidade urgente do seu estudo, impulsionaram o desenvolvimento de novas técnicas de análise, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a sequenciação. Desde então, estes procedimentos não pararam de evoluir, constituindo hoje um pilar essencial para a investigação e prática clínica. A PCR, uma técnica de biologia molecular capaz de amplificar sequencias especificas de moléculas de DNA, é atualmente um método indispensável e rotineiro na investigação médica e cientifica. Desde a primeira técnica de PCR à PCR digital, investigadores em todo o mundo procuraram desenvolver ferramentas cada vez mais poderosas e eficazes, capazes de serem utilizadas em todos os campos científicos. A demanda por um método que permitisse desvendar a informação codificada no genoma humano impulsionou a evolução das técnicas de sequenciação. A sequenciação pelo método dideoxy, desenvolvido por Sanger, foi a base para a atual sequenciação de terceira geração. O aparecimento destas novas técnicas proporcionou uma inexorável evolução tecnológica marcada por um elevado rendimento num curto espaço de tempo. Análises genómicas que anteriormente eram luxos inalcançáveis, tornaram-se progressivamente mais acessíveis pela diminuição significativa do custo por análise. No futuro próximo, os diagnósticos moleculares continuarão a desempenhar um papel critico na qualidade da saúde da população mundial. Inúmeras técnicas de testes moleculares permitem a deteção e caracterização das mais variadas doenças, assim como a monitorização da sua terapêutica. É importante perceber como cada uma destas técnicas funciona e qual a mais indicada para cada tipo de laboratório. Neste trabalho, procuramos oferecer ao leitor uma visão alargada das vantagens, limitações e aplicações associadas a cada tecnologia atualmente disponível. These are exciting times for scientists in the field of molecular diagnostics. The demand for revolutionary technologies that deliver a fast, inexpensive and accurate genomic information has never been greater. This journey began with the discovery of DNA. The urge to study this vital molecule led to the development of new and revolutionizing techniques, such as the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing. Since then, these procedures never stopped evolving and nowadays provide vital information for clinical practice. The PCR is a scientific technique in molecular biology that is able to amplify a single piece of a particular DNA sequence. It is now a common and often indispensable method used in medical and biological research labs for a variety of applications. Between the first PCR and the digital PCR available nowadays, researchers sought to develop more effective and powerful tools to be used in all scientific fields. The quest to find a method able to unveil the information behind the human genome pushed the DNA sequencing tools to the next level. The dideoxy terminator sequencing developed by Sanger was the workhorse to develop what we currently call the 3rd generation sequencing. The arrival of these new next generation techniques caused an enormous technological shift marked by dramatic throughput increases, in a less time consuming process. Genomic analysis that were, for most, unreachable luxuries just a few years ago, are being increasingly democratized at a rapid pace due to striking decreases in the cost of each run. In the upcoming years, molecular diagnostics will continue to be of critical importance to worldwide public health. There are innumerous techniques available for molecularbased tests for detection and characterization of disease, as well as monitoring of drug response. It is important to understand how each of these techniques work and which one would be more suitable in each particular laboratory. In this paper we seek to give the reader a good grasp of the advantages and limitations associated to the technological machinery available today.