Vírus e retrovírus

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos

The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes. The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work. The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays.

A transcriptase reversa como alvo terapêutico em doenças retrovirais

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Avaliação da presença dos elementos transponíveis P e GYPSY em ácaros parasitas e microhimenópteros parasitóides de Drosophila

Na tentativa de identificar possíveis vetores para transferência horizontal (fenômeno que vem sendo cada vez mais bem documentado) de elementos transponíveis entre espécies reprodutivamente isoladas de Drosophilidae, foi investigada a presença dos elementos transponíveis P e gypsy no genoma de quatro ácaros (parasitas ou potencialmente parasitas) e nove microhimenópteros parasitóides de Drosophila, através das técnicas de PCR e Southern blot. Estes organismos são parte integrante das guildas de invertebrados, cuja riqueza na Região Neotropical é particularmente expressiva. Em dois dos ácaros analisados (Proctolaelaps sp. e Macrocheles muscaedomesticae), reconhecidamente predadores de ovos de Drosophila, foram identificadas sequências com homologia a ambos os transposons, cuja forma de mobilização é diferente: gypsy é um retroelemento, com características de infectividade similares à dos retrovírus e P é um transposon de DNA, que usa uma transposase para mediar sua movimentação dentro e entre genomas. Embora seja ainda necessário isolar e clonar estas seqüências, de forma a permitir a sua comparação com os elementos P e gypsy de Drosophila, sugere-se a potencialidade destes ácaros como vetores de transferência horizontal. Dos genomas de oito entre os nove microhimenópteros (vespas) parasitóides de pupas de Drosophila estudados, foram amplificadas seqüências homólogas tanto com P, quanto com gypsy. Dada a compatibilidade ecológica e a íntima relação estabelecida entre essas vespas e Drosophila, a potencialidade desses organismos como vetores de transferência lateral entre taxa reprodutivamente isolados também é proposta.

Detection of hemoplasma and Bartonella species and co-infection with retroviruses in cats subjected to a spaying/neutering program in Jaboticabal, SP, Brazil

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Soroprevalência de HTLV/II, e fatores de risco, em gestantes do município de Botucatu atendidas em unidades básicas de saúde

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Algoritmo genético retroviral iterativo

Este trabalho tem como objetivo apresentar o desenvolvimento de uma metaheurística híbrida baseada no ciclo de vida viral, mais especificamente dos Retrovírus, que fazem parte do grupo dos seres que evoluem mais rápido na natureza. Este algoritmo é denominado Algoritmo Genético Retroviral Iterativo (AGRI) e para embasamento computacional são utilizados conceitos de Algoritmo Genético (AG) e biológico características de replicação e evolução retroviral, o que proporciona uma grande diversidade genética o que aumenta a probabilidade para encontrar a solução, fato este confirmado através de melhores resultados obtidos pelo AGRI em relação ao AG.

Carga proviral do HTLV-1 e HTLV-2: um método simples através da PCR quantitativa em tempo real

Os vírus linfotrópicos de células T humanas, quando integrados ao genoma da célula hospedeira, provírus, têm como marcador de replicação seu DNA proviral. A carga proviral parece ser um importante fator no desenvolvimento de patologias associadas a estes retrovírus. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia para quantificação absoluta da carga proviral dos HTLV-1 e HTLV-2 através da PCR em tempo real. Cinqüenta e três amostras de doadores de sangue com teste de ELISA reagente foram submetidas à metodologia, que utilizou o sistema TaqMan® para três seqüências alvo: HTLV-1, HTLV-2 e albumina. A quantificação proviral absoluta foi determinada através da proporção relativa entre o genoma do HTLV e o genoma da célula hospedeira, levando em consideração o número de leucócitos. O método apresentado é sensível (215 cópias/mL), prático e simples para quantificação proviral, além de eficiente e adequado para confirmação e discriminação da infecção pelos tipos virais.

Prevalência de anticorpos para HTLV em indivíduos atendidos em um centro de diagnóstico para Anti-HIV

As pesquisas relativas às infecções pelos vírus HTLV I e II têm crescido nos últimos anos, com o advento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, por também ser causada por um retrovírus. E, ainda, em caso de co-infecção, a AIDS tem maior precocidade em seu desenvolvimento com modificações, inclusive, dos parâmetros de acompanhamento e início de terapêutica antiretroviral. Devido a isto, foi feito um estudo com o objetivo de determinar a soroprevalência de Anti-HTLV I e II na comunidade que procura um Centro de Testagem de Anti-HIV. Foram obtidas amostras sangüíneas de 588 usuários da Unidade de Referência Especializada em Doenças Infecciosas e Parasitárias (URE-DIPE), além de 292 usuários do Instituto Evandro Chagas (IEC) e 295 doadores de sangue do Centro Hemoterápico do Pará (HEMOPA). Foram utilizados os métodos de ELISA em duplicata e Western Blot. Na URE-DIPE, o heterossexual foi a categoria de exposição predominante na procura de testagem Anti-HIV, em ambos os sexos, com 499 pessoas (84,9 %), entretanto, após análise dos resultados de Anti-HTLV, não houve diferença significante nas amostras soropositivas de indivíduos heterossexuais comparando com os homossexuais, demonstrando que a vulnerabilidade está presente independente da opção sexual. A soropositividade foi constatada em 7 usuários (1,2 %), com detecção exclusiva do Anti-HTLV I. A co-infecção HTLV/HIV ocorreu em 3 casos, correspondendo a 0,5 % do total estudado. No IEC, a soropositividade foi encontrada em 2 casos (0,7 %) de Anti-HTLV I e II. Comparando estes dois grupos (URE-DIPE e IEC), os resultados não foram discordantes, com p = 0.2345 e 0.4691, respectivamente. A faixa etária de maior atividade sexual foi a mais acometida. Não houve registro de soropositividade nos doadores de sangue do HEMOPA. Conclui-se que os resultados obtidos na URE-DIPE e Instituto Evandro Chagas não permitem definir que, na primeira, ocorrem mais casos de infecção pelo HTL V, além de não haver predomínio entre as categorias de exposição; portanto, a exposição sexual é o fator dominante. A faixa etária acometida favorece a transmissão vertical. A ausência de soropositividade nos doadores de sangue é compatível com a baixa prevalência deste grupo, de acordo com a literatura. Há necessidade de maior divulgação sobre o HTLV aos profissionais de saúde e população em geral para que medidas de prevenção e controle possam ser efetivadas.

Avaliação clínica de doadores de sangue portadores do vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV - I/II)

Os vírus linfotrópicos de células T humanas do tipo I e II (HTLV-I/II) são retrovírus que podem ser transmitidos por transfusão de sangue. Estes vírus estão associados com paraparesia espástica tropical (PET), leucemia/linfoma de células T do adulto (L/LTA) e outras doenças sistêmicas imunomediadas. O presente estudo teve como objetivo investigar sinais clínicos de patologias associadas a esses vírus para utilizar na triagem clinica de candidatos à doação de sangue. Usou procedimentos padronizados para avaliação clinica de 30 doadores de sangue soropositivos para HTLV-I/II confirmados pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) matriculados no ambulatório do Núcleo de Medicina Tropical da UFPA. Paralelamente, através de interrogatório clínico complementar, estudou grupo controle com 40 candidatos à doação de sangue escolhidos aleatoriamente, que tiveram resultados sorológicos negativos. Dos 30 pacientes examinados, verificou-se que 23 eram portadores de HTLV-I e 07 HTLV-II. Na avaliação clínica, 15 pacientes (50%) não referiram queixas, sendo que 12 pacientes com queixas exclusivamente neurológicas. Observou 05 pacientes com formigamentos; 05 com diminuição da força muscular; 04 com constipação intestinal; 02 com parestesia; 02 com nódulos subcutâneos; 01 com incontinência urinária; 01 com visão borrada; 01 com diminuição do libido. No grupo controle, 05 candidatos (12,5%) referiram queixas. Os resultados indicam que diminuição da força muscular e formigamento devem ser questionados na triagem clínica prévia à doação de sangue para reduzir risco de infecção transfusional.

Detection of HTLV-IIa in blood donors in an urban area of the Amazon Region of Brazil (Belém, PA)

Os vírus linfotrópicos de células T humanas tipo I (HTLV-I) e tipo II (HTLV-II) são membros de um grupo de retrovírus de mamíferos com propriedades biológicas similares que apresentam como uma das principais rotas de transmissão a transfusão sangüínea. O HTLV-I é endêmico em diferentes áreas geográficas e está associado a vários distúrbios clínicos. O HTLV-II é endêmico em vários grupos indígenas das Américas e em usuários de drogas intravenosas na América do Norte e do Sul, Europa e Sudeste da Ásia. Durante o ano de 1995, todos os doadores de sangue positivos para HTLV-I/II no Banco de Sangue do Estado (HEMOPA), foram direcionados a um médico e ao Laboratório de Virologia na Universidade Federal do Pará, para consulta, aconselhamento e confirmação do diagnóstico laboratorial. Trinta e cinco soros foram testados por um ensaio imunoenzimático e confirmados por um Western blot que discrimina as infecções por HTLV-I e HTLV-II. Amostras soropositivas para HTLV-II foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para as regiões genômicas env e pX e confirmaram ser do subtipo IIa. Esta é a primeira detecção, em Belém, da presença da infecção pelo HTLV-IIa em doadores de sangue. Estes resultados enfatizam que o HTLV-II está presente em áreas urbanas da região Amazônica e a necessidade de incluir testes de triagem capazes de detectar anticorpos para ambos os tipos de HTLV.

Epidemiological aspects of retrovirus (HTLV) infection among Indian populations in the Amazon Region of Brazil

O HTLV foi descrito inicialmente associado a uma leucemia no Japão e a uma doença neurológica presente no Caribe. Logo foi evidenciado que o HTLV-II era endêmico entre Ameríndios e, particularmente, entre Índios brasileiros. A Amazônia brasileira é a maior área endêmica para o vírus e dessa forma, permitiu que fossem realizados vários estudos relacionados com a sua biologia, a busca de doença, informações epidemiológicas que incluíram uma bem definida distribuição geográfica, a definição dos modos de transmissão e manutenção do vírus em comunidades pequenas, epidemiologicamente fechadas, assim como contribuições para o diagnóstico laboratorial da infecção. Um novo subtipo molecular, denominado HTLV-IIc, foi adicionalmente descrito baseando-se no sequenciamento genético do vírus e na análise filogenética. Esse subtipo está presente em outras áreas do país, indicando que o HTLV também funciona como um marcador precioso das migrações humanas nas Américas no passado e um provável marcador dos costumes das populações atuais. O outro retrovírus humano, o HIV, ainda não é prevalente nas comunidades indígenas, apesar de que elas podem ser facilmente alcançadas em virtude das inúmeras facilidades de transmissão para o vírus.

Doença neurológica pelo vírus linfotrópico de célula T humana - HTLV: achados clínico-funcionais e virológicos de pacientes do Núcleo de Medicina Tropical

Os vírus linfotrópicos de células T humano do tipo 1 e 2 (HTLV-1 e 2) são retrovírus que causam o Leucemia / Linfoma de células T do adulto (LLTA) e a Paraparesia Espástica Tropical ou Mielopatia associada ao HTLV-1(PET/MAH). Outras manifestações neurológicas também têm sido atribuídas ao vírus, tais como distúrbios sensoriais e reflexos hiperativos. A prevalência da infecção pelo HTLV-1 no Brasil é alta (0,8% a 1,8%); os HTLV 1 e 2 são endêmicos na região Amazônica. A infecção pelo HTLV e suas doenças associadas ainda são pouco conhecidas dos profissionais de saúde. Trata-se de um estudo descritivo transversal, tipo caso-controle com uma amostra de 76 pacientes portadores do HTLV-1/2 assistidos no Núcleo de Medicina Tropical, em Belém-Pará. Foram submetidos a avaliações clínico-funcional (OMDS), neurológica, laboratoriais (contagem de linfócitos T CD4+, quantificação da carga proviral) e exame de imagem de ressonância magnética (RNM). Os pacientes com HTLV-1com avaliação neurológica foram considerados casos (n=19) e os pacientes assintomáticos sem alteração neurológica foram os controles (n=40). O sexo feminino foi mais prevalente (66,1%), a média de idade foi de 50.7 anos. A distribuição média da contagem de linfócitos T CD4+ nos dois grupos esteve dentro da faixa da normalidade, a carga proviral mostrou-se mais elevada no grupo de casos, a pesquisa do anticorpo anti-HTLV-1 no LCR foi positiva em 93,3% dos casos. A avaliação neurológica revelou 16 (84.2%) pacientes com PET/MAH (p<0.0001). Em 73.7% (14) dos casos, a duração da doença ficou entre 4 a 9 anos. A pesquisa da força muscular em flexão e extensão dos joelhos mostrou que 63.2% dos casos apresentavam grau 3 e 68.4% grau 4, respectivamente (p<0.0001). Normorreflexia em MMSS, além de hiperreflexia no patelar e no Aquileu, em 78.9% e 73.7%, respectivamente. Sinal de Babinski bilateral foi visto em 73.7% dos casos e o sinal de Hoffman em 26.3%. Clônus bilateral esteve presente em 13 pacientes. Sensibilidade tátil alterada (31.6%), hipertonia de MMII (63.2%) e sintomas urinários foram observados em 89.5% dos casos. Das 17 RNM realizadas, 13 (76.47) tinham alteração de imagem em medula torácica. Não houve associações entre carga proviral, OMDS, duração da doença e RNM. A maioria dos casos de doença neurológica associada ao HTLV-1 era compatível com PET/MAH; a carga proviral elevada perece ser um marcador de desenvolvimento de doença.

Avaliação dos fatores de risco associados à transmissão do HTLV-1 e do HTLV-2, em doadores de sangue, na cidade de Belém do Pará

Com o objetivo de definir o perfil epidemiológico da infecção pelos Vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1 e HTLV-2), na população de doadores de sangue inaptos, da Fundação HEMOPA, na cidade de Belém do Pará, analisaram-se 113 fichas, em relação a fatores de risco associados à transmissão destes retrovírus, entre portadores e não portadores dos HTLV. Observou-se infecção em 76% (n=50) dos doadores inaptos pelo HTLV-1 e em 24% (n=16) pelo HTLV-2; 62% (n=70) dos portadores eram do sexo masculino e 38% (n=43) do sexo feminino, havendo uma maior tendência da infecção por indivíduos deste sexo (p=0,007). Os fatores de risco que exibiram resultados significativos foram: ter recebido transfusão sangüínea (p=0,0003), mais especificamente para HTLV-2 (p=0,02); ter sido amamentado por ama de leite (p=0,006), mais especificamente para HTLV-1 (p=0,04); ter sido submetido à cirurgia (p=0,01), discriminadamente para HTLV-1 (p=0,03) e HTLV-2 (p=0,04); compartilhar lâmina/barbeador (p=0,02), mais especificamente para HTLV-1 (p=0,02); não usar preservativo nas relações sexuais (p=0,0003), discriminadamente para HTLV-1 (p=0,001) e HTLV-2 (p=0,002). Apesar das diversas etapas existentes no processo de triagem de doadores de sangue, cujo objetivo é eliminar potenciais candidatos portadores de doenças transmissíveis pelo sangue, em especial as de curso crônico e assintomático, existem vieses que impossibilitam um processo isento de falhas. Palavras-chaves: HTLV; fatores de risco; doadores de sangue.

Lack of evidence for human infection with Xenotropic murine leukemia virus-related virus in the Brazilian Amazon basin

Introduction: This study confirmed the absence of natural infection with Xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) or XMRV-related disease in human populations of the Brazilian Amazon basin. We demonstrated that 803 individuals of both sexes, who were residents of Belem in the Brazilian State of Pará, were not infected with XMRV. Methods: Individuals were divided into 4 subgroups: healthy individuals, individuals infected with human immunodeficiency virus, type 1 (HIV-1), individuals infected with human T-lymphotrophic virus, types 1 or 2 (HTLV-1/2), and individuals with prostate cancer. XMRV infection was investigated by nested PCR to detect the viral gag gene and by quantitative PCR to detect pol. Results: There was no amplification of either gag or pol segments from XRMV in any of the samples examined. Conclusions: This study supports the conclusions of the studies that eventually led to the retraction of the original study reporting the association between XMRV and human diseases.