Proteínas de reserva do trigo: gluteninas.

2009

Relación específica de las proteínas de reserva en el maíz (Zea mays) y sus parientes silvestres

p.255-263

Apomixia em citros: expressão diferencial de mRNA e proteínas em plântulas e embriões zigóticos e apomíticos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Cultivares de Pisum Sativum L. : caracterización e identificación por electroforesis de proteínas seminales totales

Se realizó el estudio electroforético de proteínas seminales totales de 13 cultivares de arveja (Pisum sativum L.) en geles de poliacrilamida con Sodio Dodecil Sulfato. Se logró fraccionar 53 bandas proteicas, de las cuales 36 mostraron diferencias en sus movilidades. De esta manera se obtuvieron modelos electroforéticos diferentes para cada cultivar y mediante análisis de conglomerados (método UPGMA) se obtuvo un dendrograma que mostró la distinción entre cultivares en dicho carácter, permitiendo expresar las diferencias entre ellos.

Regulação coordenada da mobilização de lipídios e proteínas por hormônios, fontes de carbono e nitrogênio durante o crescimento pós-germinativo em Girassol

The mobilization of food reserves in storage tissues and allocation of their hydrolysis products in the growing axis are critical processes for the establishment of seedlings after germination. Therefore, it is crucial for mobilization of reserves to be synchronized with the growing axis, so that photosynthetic activity can be started before depletion of reserves. For this, integrative approaches involving different reserves, different hydrolysis products and interaction between storage and growing axis tissues, either through hormones or metabolites with signaling role, can contribute greatly to the elucidation of the regulation mechanisms for reserve mobilization. In this study, was hypothesized that hormones and metabolites have different actions on reserve mobilization, and there must be a crossed effect of sugars on the mobilization of proteins and amino acids on lipids and starch mobilization in sunflower seedlings. This study was conducted with seeds of sunflower (Helianthus annuus L.) hybrid Helio 253 using in vitro culture system. Seeds were germinated on Germitest® paper and grown on agar-water 4 g/L without addition of nutrients during 9 days after imbibition (DAI) for growth curve. To verify the effect of metabolites and hormones, seedlings were transferred in the 2nd DAI to agar-water 4 g/L supplemented with increasing concentrations of sucrose or L-glutamine, abscisic acid, gibberellic acid or indolebutyric acid. The results of this study confirm that the mobilization of lipids and storage proteins occurs in a coordinated manner during post-germination growth in sunflower, corroborating the hypothesis that the application of external carbon (sucrose) and nitrogen (L-glutamine) sources can delay the mobilization of these reserves in a crossed way. Moreover, considering the changes in the patterns of reserve mobilization and partition of their products in seedlings treated with different growth regulators, it is evident that the effects of metabolites and hormones must involve, at least in part, distinct mechanisms of action

El estrés térmico post - floración y sus efectos sobre el peso y la calidad de los granos en maíces de diferente destino de producción

En maíz, los golpes de calor (días con temperaturas menor a 35 grados C) ocurridos tempranamente durante el período post-floración pueden afectar negativamente el peso individual de los granos, a traves de limitaciones del crecimiento del cultivo. El conocimiento que existe respecto a las bases eco-fisiológicas de la respuesta de la calidad de los granos a la incidencia de este estres durante el llenado efectivo es prácticamente nulo. El objetivo de este trabajo fue analizar en condiciones a campo el impacto de los golpes de calor durante las etapas tempranas y tardías del llenado efectivo sobre el peso, la calidad general y específica de la industria de los granos en híbridos de maíz de diferente destino de producción (colorado duro o flint, pisingallo y semi-dentad). Los golpes de calor, especialmente aquellos ocurridos durante las etapas tempranas del llenado, redujeron el crecimiento de los cultivos por caídas de la eficiencia en el uso de la radiacion interceptada. Esto produjo un desbalance entre la disponibilidad de asimilados y el requerimiento de estos por parte de los granos que se tradujo en una interrupción prematura del llenado. Consecuentemente, se obtuvieron granos mas livianos con concentraciones mas bajas de aceite y mas altas de proteína. Estas respuestas fueron acompanadas de alteraciones en la composición específica de las proteínas de reserva, incrementándose la abundancia relativa de glutelinas, y ƒÀ- y ƒÁ- zeinas, en detrimento de aquella de ƒ¿-zeinas. Asimismo, los golpes de calor provocaron efectos negativos sobre los diversos parámetros de calidad industrial de los granos, asociados principalmente a disminuciones en la abundancia relativa de ƒ¿-zeínas. Para la mayoría de los rasgos mencionados, los híbridos semi-dentados tuvieron una respuesta mas pronunciada al estrés que los híbridos colorado duro y pisingallo, aparentando ser sensibles a temperaturas del aire incluso inferiores a 35 grados C.

El estrés térmico post - floración y sus efectos sobre el peso y la calidad de los granos en maíces de diferente destino de producción

En maíz, los golpes de calor (días con temperaturas menor a 35 grados C) ocurridos tempranamente durante el período post-floración pueden afectar negativamente el peso individual de los granos, a traves de limitaciones del crecimiento del cultivo. El conocimiento que existe respecto a las bases eco-fisiológicas de la respuesta de la calidad de los granos a la incidencia de este estres durante el llenado efectivo es prácticamente nulo. El objetivo de este trabajo fue analizar en condiciones a campo el impacto de los golpes de calor durante las etapas tempranas y tardías del llenado efectivo sobre el peso, la calidad general y específica de la industria de los granos en híbridos de maíz de diferente destino de producción (colorado duro o flint, pisingallo y semi-dentad). Los golpes de calor, especialmente aquellos ocurridos durante las etapas tempranas del llenado, redujeron el crecimiento de los cultivos por caídas de la eficiencia en el uso de la radiacion interceptada. Esto produjo un desbalance entre la disponibilidad de asimilados y el requerimiento de estos por parte de los granos que se tradujo en una interrupción prematura del llenado. Consecuentemente, se obtuvieron granos mas livianos con concentraciones mas bajas de aceite y mas altas de proteína. Estas respuestas fueron acompanadas de alteraciones en la composición específica de las proteínas de reserva, incrementándose la abundancia relativa de glutelinas, y ƒÀ- y ƒÁ- zeinas, en detrimento de aquella de ƒ¿-zeinas. Asimismo, los golpes de calor provocaron efectos negativos sobre los diversos parámetros de calidad industrial de los granos, asociados principalmente a disminuciones en la abundancia relativa de ƒ¿-zeínas. Para la mayoría de los rasgos mencionados, los híbridos semi-dentados tuvieron una respuesta mas pronunciada al estrés que los híbridos colorado duro y pisingallo, aparentando ser sensibles a temperaturas del aire incluso inferiores a 35 grados C.

Regulação da mobilização de lipídios e proteinas por hormônios, fontes de carbono e nitrogênio durante o crescimento pos-germinativo em girassol

The mobilization of food reserves in storage tissues and allocation of their hydrolysis products in the growing axis are critical processes for the establishment of seedlings after germination. Therefore, it is crucial for mobilization of reserves to be synchronized with the growing axis, so that photosynthetic activity can be started before depletion of reserves. For this, integrative approaches involving different reserves, different hydrolysis products and interaction between storage and growing axis tissues, either through hormones or metabolites with signaling role, can contribute greatly to the elucidation of the regulation mechanisms for reserve mobilization. In this study, was hypothesized that hormones and metabolites have different actions on reserve mobilization, and there must be a crossed effect of sugars on the mobilization of proteins and amino acids on lipids and starch mobilization in sunflower seedlings. This study was conducted with seeds of sunflower (Helianthus annuus L.) hybrid Helio 253 using in vitro culture system. Seeds were germinated on Germitest® paper and grown on agar-water 4 g/L without addition of nutrients during 9 days after imbibition (DAI) for growth curve. To verify the effect of metabolites and hormones, seedlings were transferred in the 2nd DAI to agar-water 4 g/L supplemented with increasing concentrations of sucrose or L-glutamine, abscisic acid, gibberellic acid or indolebutyric acid. The results of this study confirm that the mobilization of lipids and storage proteins occurs in a coordinated manner during post-germination growth in sunflower, corroborating the hypothesis that the application of external carbon (sucrose) and nitrogen (L-glutamine) sources can delay the mobilization of these reserves in a crossed way. Moreover, considering the changes in the patterns of reserve mobilization and partition of their products in seedlings treated with different growth regulators, it is evident that the effects of metabolites and hormones must involve, at least in part, distinct mechanisms of action

Vicilina de sementes da leguminosa selvagem Anadenanthera macrocarpa (AmV): purificação, caracterização, efeito deletério e mecanismo de ação para bruquídeo callosobruchus maculatus

Grains and legume seeds are foods that form the basis of the diets of many cultures around the world, winch contritbute to the daily nutrient requirements of humans. Vicilins (7S globulin) are storage proteins found in legume seeds, and may have an additional function constitutive defense of the embryo against pests and pathogens. In this work the vicilin from Anadenanthera macrocarpa - AmV (red-angico), was purified and partially characterized, its effect on development and larval survival and adult emergence of Callosobruchus maculatus was evaluated by determination of LD50, WD50 and ED50 in system bioassay. Purification of vicilin was initiated by the chitin affinity chromatography and then gel filtration (Superdex 75 Tricorn 10x300 mm) FPLC system followed by reverse phase chromatography (C8 phenomenex) on HPLC system. Bioassays WD50 and LD50 for larvae were 0.32% and 0.33% (w:w) respectively, since the ED50 for adults was 0.096%. The probable mechanism of action was evaluated by testing digestibility of AmV in vitro, and observed for the involvement of two fragments vicilins immunoreactive against polyclonal Anti-vicilin from Erythrina velutina (Anti-EvV) about of 22 and 13 kDa chitin binding. The AmV in its native form has been recognized by the anti-EvV, indicating that there is a conserved region in the vicilin and is probably corresponding to the chitin binding domains. These results point to a new vicilin chitin binding that can subsequently be used as a possible biopesticide protein source, in order to control insect pest C. maculatus and confirm literature findings that demonstrate vicilin in the presence of different kinds of ligands to conserved regions chitin not yet characterized

Armazenamento, tolerância à dessecação e o potencial fisiológico de sementes de híbridos de milho e seus recíprocos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Uso de marcadores morfológicos, bioquímicos y moleculares SRAP para diferenciar variedades de Cynara cardunculus L. (Asteraceae)

Dentro del complejo primario de Cynara cardunculus L. se encuentran diversas variedades botánicas: var. scolymus (alcaucil), var. altilis (cardo cultivado) y var. sylvestris (cardo silvestre). A lo largo de la historia del mejoramiento, la caracterización de los materiales ha evolucionado desde el uso de caracteres morfológicos hasta los modernos análisis moleculares, pasando por los marcadores bioquímicos. El objetivo del presente trabajo fue comparar la utilidad de los marcadores morfológicos, bioquímicos y moleculares para la caracterización de materiales pertenecientes a tres variedades botánicas de Cynara cardunculus. Tres cultivares de la var. scolymus, dos de la var. altilis y dos de la var. sylvestris fueron caracterizadas por variables morfovegetativas, proteínas de reserva y por marcadores moleculares a través de la técnica SRAP. Estas metodologías permitieron discriminar dos grupos: uno incluyendo las variedades de cardo cultivado y silvestre, y el otro, las variedades del alcaucil. Los datos moleculares y morfológicos permitieron además diferenciar los cultivares evaluados de la var. scolymus. Se concluye que los marcadores analizados son útiles para la caracterización intravarietal e intervarietal en programas de mejoramiento.

Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

Factores transcripcionales de la clase DOF en Brachypodium distachyon: caracterización molecular de BdDOF24 durante la germinación de las semillas

La semilla es el órgano que garantiza la propagación y continuidad evolutiva de las plantas espermatofitas y constituye un elemento indispensable en la alimentación humana y animal. La semilla de cereales acumula en el endospermo durante la maduración, mayoritariamente, almidón y proteínas de reserva. Estas reservas son hidrolizadas en la germinación por hidrolasas sintetizadas en la aleurona en respuesta a giberelinas (GA), siendo la principal fuente de energía hasta que la plántula emergente es fotosintéticamente activa. Ambas fases del desarrollo de la semilla, están reguladas por una red de factores de transcripción (TF) que unen motivos conservados en cis- en los promotores de sus genes diana. Los TFs son proteínas que han desempeñado un papel central en la evolución y en el proceso de domesticación, siendo uno de los principales mecanismos de regulación génica; en torno al 7% de los genes de plantas codifican TFs. Atendiendo al motivo de unión a DNA, éstos, se han clasificado en familias. La familia DOF (DNA binding with One Finger) participa en procesos vitales exclusivos de plantas superiores y sus ancestros cercanos (algas, musgos y helechos). En las semillas de las Triticeae (subfamilia Pooideae), se han identificado varias proteínas DOF que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. Brachypodium distachyon es la primera especie de la subfamilia Pooideae cuyo genoma (272 Mbp) ha sido secuenciado. Su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, y la posibilidad de ser transformado por Agrobacterium tumefaciens (plásmido Ti), hacen que sea el sistema modelo para el estudio de cereales de la tribu Triticeae con gran importancia agronómica mundial, como son el trigo y la cebada. En este trabajo, se han identificado 27 genes Dof en el genoma de B. distachyon y se han establecido las relaciones evolutivas entre estos genes Dof y los de cebada (subfamilia Pooideae) y de arroz (subfamilia Oryzoideae), construyendo un árbol filogenético en base al alineamiento múltiple del dominio DOF. La cebada contiene 26 genes Dof y en arroz se han anotado 30. El análisis filogenético establece cuatro grupos de genes ortólogos (MCOGs: Major Clusters of Orthologous Genes), que están validados por motivos conservados adicionales, además del dominio DOF, entre las secuencias de las proteínas de un mismo MCOG. El estudio global de expresión en diferentes órganos establece un grupo de nueve genes BdDof expresados abundantemente y/o preferencialmente en semillas. El estudio detallado de expresión de estos genes durante la maduración y germinación muestra que BdDof24, ortólogo putativo a BPBF-HvDOF24 de cebada, es el gen más abundante en las semillas en germinación de B. distachyon. La regulación transcripcional de los genes que codifican hidrolasas en la aleurona de las semillas de cereales durante la post‐germinación ha puesto de manifiesto la existencia en sus promotores de un motivo tripartito en cis- conservado GARC (GA-Responsive Complex), que unen TFs de la clase MYB-R2R3, DOF y MYBR1-SHAQKYF. En esta tesis, se ha caracterizado el gen BdCathB de Brachypodium que codifica una proteasa tipo catepsina B y es ortólogo a los genes Al21 de trigo y HvCathB de cebada, así como los TFs responsables de su regulación transcripcional BdDOF24 y BdGAMYB (ortólogo a HvGAMYB). El análisis in silico del promotor BdCathB ha identificado un motivo GARC conservado, en posición y secuencia, con sus ortólogos en trigo y cebada. La expresión de BdCathB se induce durante la germinación, así como la de los genes BdDof24 y BdGamyb. Además, los TFs BdDOF24 y BdGAMYB interaccionan en el sistema de dos híbridos de levadura e in planta en experimentos de complementación bimolecular fluorescente. En capas de aleurona de cebada, BdGAMYB activa el promotor BdCathB, mientras que BdDOF24 lo reprime; este resultado es similar al obtenido con los TFs ortólogos de cebada BPBF-HvDOF24 y HvGAMYB. Sin embargo, cuando las células de aleurona se transforman simultáneamente con los dos TFs, BdDOF24 tiene un efecto aditivo sobre la trans-activación mediada por BdGAMYB, mientras que su ortólogo BPBF-HvDOF24 produce el efecto contrario, revirtiendo el efecto de HvGAMYB sobre el promotor BdCathB. Las diferencias entre las secuencias deducidas de las proteínas BdDOF24 y BPBF-HvDOF24 podrían explicar las funciones opuestas que desempeñan en su interacción con GAMYB. Resultados preliminares con líneas de inserción de T-DNA y de sobre-expresión estable de BdGamyb, apoyan los resultados obtenidos en expresión transitoria. Además las líneas homocigotas knock-out para el gen BdGamyb presentan alteraciones en anteras y polen y no producen semillas viables. ABSTRACT The seed is the plant organ of the spermatophytes responsible for the dispersion and survival in the course of evolution. In addition, it constitutes one of the most importan elements of human food and animal feed. The main reserves accumulated in the endosperm of cereal seeds through the maturation phase of development are starch and proteins. Its degradation by hydrolases synthetized in aleurone cells in response to GA upon germination provides energy, carbon and nitrogen to the emerging seedling before it acquires complete photosynthetic capacity. Both phases of seed development are controlled by a network of transcription factors (TFs) that interact with specific cis- elements in the promoters of their target genes. TFs are proteins that have played a central role during evolution and domestication, being one of the most important regulatory mechanisms of gene expression. Around 7% of genes in plant genomes encode TFs. Based on the DNA binding motif, TFs are classified into families. The DOF (DNA binding with One Finger) family is involved in specific processes of plants and its ancestors (algae, mosses and ferns). Several DOF proteins have been described to play important roles in the regulation of genes in seeds of the Triticeae tribe (Pooideae subfamily). Brachypodium distachyon is the first member of the Pooideae subfamily to be sequenced. Its small size and compact structured genome (272 Mbp), the short life cycle, small plant size and the possibility of being transformed with Agrobacterium tumefaciens (Ti-plasmid) make Brachypodium the model system for comparative studies within cereals of the Triticeae tribe that have big economic value such as wheat and barley. In this study, 27 Dof genes have been identified in the genome of B. distachyon and the evolutionary relationships among these Dof genes and those frome barley (Pooideae subfamily) and those from rice (Oryzoideae subfamily) have been established by building a phylogenetic tree based on the multiple alignment of the DOF DNA binding domains. The barley genome (Hordeum vulgare) contains 26 Dof genes and in rice (Oryza sativa) 30 genes have been annotated. The phylogenetic analysis establishes four Major Clusters of Orthologous Genes (MCOGs) that are supported by additional conserved motives out of the DOF domain, between proteins of the same MCOG. The global expression study of BdDof genes in different organs and tissues classifies BdDof genes into two groups; nine of the 27 BdDof genes are abundantly or preferentially expressed in seeds. A more detailed expression analysis of these genes during seed maturation and germination shows that BdDof24, orholog to barley BPBF-HvDof24, is the most abundantly expressed gene in germinating seeds. Transcriptional regulation studies of genes that encode hydrolases in aleurone cells during post-germination of cereal seeds, have identified in their promoters a tripartite conserved cis- motif GARC (GA-Responsive Complex) that binds TFs of the MYB-R2R3, DOF and MYBR1-SHAQKYF families. In this thesis, the characterization of the BdCathB gene, encoding a Cathepsin B-like protease and that is ortholog to the wheat Al21 and the barley HvCathB genes, has been done and its transcriptional regulation by the TFs BdDOF24 and BdGAMYB (ortholog to HvGAMYB) studied. The in silico analysis of the BdCathB promoter sequence has identified a GARC motif. BdCathB expression is induced upon germination, as well as, those of BdDof24 and BdGamyb genes. Moreover, BdDOF24 and BdGAMYB interact in yeast (Yeast 2 Hybrid System, Y2HS) and in planta (Bimolecular Fluorecence Complementation, BiFC). In transient assays in aleurone cells, BdGAMYB activates the BdCathB promoter, whereas BdDOF24 is a transcriptional repressor, this result is similar to that obtained with the barley orthologous genes BPBF-HvDOF24 and HvGAMYB. However, when aleurone cells are simultaneously transformed with both TFs, BdDOF24 has an additive effect to the trans-activation mediated by BdGAMYB, while its ortholog BPBF-HvDOF24 produces an opposite effect by reducing the HvGAMYB activation of the BdCathB promoter. The differences among the deduced protein sequences between BdDOF24 and BPBF-HvDOF24 could explain their opposite functions in the interaction with GAMYB protein. Preliminary results of T-DNA insertion (K.O.) and stable over-expression lines of BdGamyb support the data obtained in transient expression assays. In addition, the BdGamyb homozygous T-DNA insertion (K.O.) lines have anther and pollen alterations and they do not produce viable seeds.

Construção de bibliotecas de cDNAs subtraídos a partir das sementes de Mamona submetidas à estresse hídrico e análise in silico de transcritos potencialmente expressos sob condições de estresse: Metalotioneina, proteína reprimida por auxina de 12.5 kDa e Glutelina tipo-A3

Estresses ambientais abióticos são fatores que causam respostas ao nível molecular, fisiológico e morfológico em plantas, dependendo também de sua intensidade e duração. É visto que algumas espécies apresentam tolerância a condições estressantes e ao mesmo tempo são fontes naturais de matéria prima para indústria. Nesse contexto encontra-se a mamona (Ricinus comunnis L.), principal fonte de óleo de rícino valorizado por suas aplicações farmacêuticas e principalmente industriais, vem sendo usada como cultura em regiões onde a disponibilidade de água é reduzida, usada como fonte de renda para agricultura da região nordeste brasileira. Visto que pouco se sabe sobre as respostas moleculares que levam essa planta a tolerar regiões secas e como as sementes, principais foco de interesse, respondem a essa escassez, nesse trabalho foram construídas duas bibliotecas de cDNAs, onde a partir de uma abordagem subtrativa, continham RNAs diferencialmente expressos em sementes de plantas mamona submetidas ao estresse hídrico durante 5 dias (biblioteca L7), e a outra RNAs diferencialmente expressos em sementes controle (biblioteca L5). A biblioteca L7 apresentou a maior variedade de transcritos com um total de 182. A maior parte das funções estabelecidas pelo sistema Gene Ontology - GO, foram direcionadas aos “Processos Metabólicos” (526), em segundo “Respostas a estímulos” (57), o terceiro termo mais abundante foram referentes a “Desenvolvimento”(26). Já na biblioteca L5, foram encontrados 91 transcritos, com maior parte de suas funções referentes a “Processos Metabólicos”(413), em segundo “Respostas a estímulos” (8) e em terceiro Regulação (6). Alguns dos transcritos da biblioteca L7 foram escolhidos para análise por repetirem-se mais de 3x e não aparecerem na biblioteca L5, o que indica uma possível regulação positiva sobre estresse. As análises sobre Metalotioneína (4x), mostraram que a sequência de proteica apresentava os domínios conservados que a caracterizava como tipo II, onde são encontrados dois domínios funcionais ricos em cisteína com posições altamente conservadas, desempenhando a função de ligar-se a metais pesados, correlacionadas assim como a atividade de eliminação EROs e defesa contra o estresse oxidativo, além de apresentar homologia com a sequência de Bruguiera gymnorhiza, uma planta de mangue adaptada a ambientes salinos. Analisamos também os transcritos da referente a proteína AUXIN-REPRESSED 12.5 KDA (3x), apontada como sendo reprimida pelo hormônio auxina e associada ao processo de dormência da semente, é descrito em uma família gênica onde vários membros pertencem as vias de resposta ao estresse. Por último, analisamos a proteína GLUTELIN TYPE-A 3 (5x), uma importante proteína de armazenamento com caráter hidrofílico, possivelmente direcionada para o vacúolo. Em nosso trabalho foi possível observar um aumento de transcritos em relação a subtração controle, possivelmente reflexo do aumento do metabolismo da semente, tanto para resposta defensiva ao estresse hídrico quanto para o amadurecimento rápido da semente onde foram observados transcritos referentes a resposta oxidativa, controle hormonal, proteínas de reserva e produção de óleo.