Vicilina de sementes da leguminosa selvagem Anadenanthera macrocarpa (AmV): purificação, caracterização, efeito deletério e mecanismo de ação para bruquídeo callosobruchus maculatus

Grains and legume seeds are foods that form the basis of the diets of many cultures around the world, winch contritbute to the daily nutrient requirements of humans. Vicilins (7S globulin) are storage proteins found in legume seeds, and may have an additional function constitutive defense of the embryo against pests and pathogens. In this work the vicilin from Anadenanthera macrocarpa - AmV (red-angico), was purified and partially characterized, its effect on development and larval survival and adult emergence of Callosobruchus maculatus was evaluated by determination of LD50, WD50 and ED50 in system bioassay. Purification of vicilin was initiated by the chitin affinity chromatography and then gel filtration (Superdex 75 Tricorn 10x300 mm) FPLC system followed by reverse phase chromatography (C8 phenomenex) on HPLC system. Bioassays WD50 and LD50 for larvae were 0.32% and 0.33% (w:w) respectively, since the ED50 for adults was 0.096%. The probable mechanism of action was evaluated by testing digestibility of AmV in vitro, and observed for the involvement of two fragments vicilins immunoreactive against polyclonal Anti-vicilin from Erythrina velutina (Anti-EvV) about of 22 and 13 kDa chitin binding. The AmV in its native form has been recognized by the anti-EvV, indicating that there is a conserved region in the vicilin and is probably corresponding to the chitin binding domains. These results point to a new vicilin chitin binding that can subsequently be used as a possible biopesticide protein source, in order to control insect pest C. maculatus and confirm literature findings that demonstrate vicilin in the presence of different kinds of ligands to conserved regions chitin not yet characterized

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Sementes de leguminosas são alimentos que compõem a base das dietas de diversas culturas ao redor do mundo, tendo uma importante contribuição nas necessidades diárias de nutrientes dos seres humanos. As globulinas 7S (vicilinas) são proteínas de reserva encontradas em sementes de leguminosas, e podem apresentar uma função adicional de defesa constitutiva do embrião contra pragas e patógenos. Neste trabalho uma vicilina de Anadenanthera macrocarpa - AmV (Angico-vermelho), foi purificada e parcialmente caracterizada. Seu efeito sobre o desenvolvimento, sobrevivência larval e emergência dos adultos de Callosobruchus maculatus foram avaliados pela determinação das LD50, WD50 e ED50 em sistema de bioensaio. A purificação da vicilina foi iniciada por cromatografia de afinidade à quitina e posteriormente em cromatografia de gel filtração Superdex 75 Tricorn 10x300 mm no sistema de FPLC, seguida por cromatografia de fase reversa C8 phenomenex em sistema HPLC. Por SDS-PAGE, AmV dissociou-se em quatro subunidades principais com aproximadamente 73, 70, 43 e 41 kDa, e quando submetida à eletroforese a 12% em condições nativas apresentou uma banda única de característica eletroforética ácida. Nos bioensaios, a WD50 e a LD50 para as larvas foram de 0,32% e 0,33% (p:p) respectivamente, já para os adultos a ED50 foi de 0,096%. O provável mecanismo de ação foi avaliado por ensaios de digestibilidade da AmV in vitro, sendo observado o envolvimento de dois fragmentos de vicilinas imunorreativos contra anticorpo policlonal Anti-vicilinas de Erythrina velutina (Anti- EvV), de aproximadamente 22 e 13 kDa ligantes à quitina. A AmV na sua forma nativa foi reconhecida pelo anticorpo anti-EvV, indicando que existe uma provavel região conservada nas vicilinas, que pode corresponder à domínios de ligação à quitina. Estes resultados apontam para uma nova vicilina que pode vir a ser utilizada como um possível bioinseticida de origem proteica, de maneira a controlar o inseto praga C. maculatus, bem como corroborar com achados da literatura que demonstram em vicilinas de diferentes espécies a existência de regiões conservadas ligantes à quitina ainda não caracterizados