Expressão gênica e viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de córtex ovarianos cultivados in vitro de macaco-prego (Sapajus apella)

O objetivo desse trabalho foi analisar a ativação e o crescimento de folículos préantrais de Sapajus apella, submetidos a um sistema de cultivo in vitro em curto-prazo. Nesse sentido, dois experimentos foram realizados neste trabalho. Experimento I: exposição à fresco e à crioprotetores de biopsias de fragmentos do córtex ovariano. Ambos os fragmentos ovarianos foram submetidos à extração total de RNA e síntese de cDNA. Após a amplificação do cDNA por PCR em tempo-real (RT-PCR), os software GeNorm, bestkeeper e Normfinder foram usados para avaliar a estabilidade dos genes GAPDH (glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase), HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) e TBP (TATA-binding protein). Experimento II: o tecido do córtex ovariano de quatro fêmeas foi oletado e dividido em nove pedaços de 1 mm³. Um fragmento ovariano (grupo controle) foi imediatamente dividido em dois pedaços, os quais foram destinados para análise da viabilidade ou por RT-PCR. Os 8 fragmentos restantes foram individualmente cultivados in vitro em um meio constituído de TCM suplementado com 100 ng/mL EGF (T1), com adição de 10 μM de BME (T2), 100 ng/mL de BMP4 (T3), 25 IU de PMSG (T4), 10 μM de BME e 100 ng/mL de BMP4 (T5), 10 μM de BME, 25 IU de PMSG (T6), 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T7) ou 10 μM de BME, 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T8). Os resultados demonstraram que no tecido do córtex ovariano de S. apella, os genes HPRT1 e TBP foram os mais apropriados como genes de referência, podendo ser usados como parâmetro para normalizar dados em estudos futuros. Ao contrário, o GAPDH se apresentou como menos estável dos genes de referencia testados. Após o cultivo in vitro, todos os tratamentos alcançaram percentuais similares da viabilidade de folículos pré-antrais. O tecido ovariano cultivado na presença de GF+BME/BMP4/PMSG resultou no aumento da taxa de ativação e crescimento folicular, assim como no aumento da expressão de AMH, BMP15 e GDF9, genes conhecidos como indicadores específicos de desenvolvimento folicular. Dessa forma, o HPRT1 e TBP são os genes de referência mais estáveis, na exposição à crioprotetores, a fresco e no o cultivo de tecidos de córtex ovariano de S. apella. Os folículos pré-antrais são capazes de desenvolverem-se in vitro quando cultivados em meio suplementado com PMSG, BME e BMP4. A viabilidade folicular, entretanto, permaneceu independentemente do meio de cultivo in vitro e o uso de fatores de crescimento, como marcadores de desenvolvimento folicular, foi crucial para identificar o melhor meio de cultivo in vitro.

Ativação espermática e criopreservação do sêmen de macaco-prego (Cebus apella) em diluidores à base de água de coco in natura e TES-TRIS

A espécie Cebus apella (macaco-prego) é amplamente utilizada como modelo experimental na pesquisa biomédica. Entretanto, são escassos os estudos dedicados a avaliar o sêmen desses animais, que é composto por uma fração líquida e uma coagulada de difícil manipulação e alta concentração de espermatozóides imóveis. Portanto, objetivou-se I) avaliar o efeito de duas concentrações de cafeína (6 e 10 mM/mL) diluídas em TES-TRIS e água de coco in natura (ACIN) na ativação de espermatozóides de C. apella e II) testar um protocolo de criopreservação do sêmen comparando dois diluidores (TES-TRIS e ACIN) acrescidos de gema de ovo e glicerol. O sêmen de seis animais mantidos no Centro Nacional de Primatas foi coletado por eletroejaculação, diluído na fração-A de TES-TRIS ou ACIN, e incubado a 35°C até dissolução do coágulo seminal. O tempo de liquefação foi comparado. Posteriormente foi mensurado volume, concentração, morfologia espermática e percentual de espermatozóides vivos. No experimento I as amostras foram diluídas em TES-TRIS ou ACIN acrescidos de 6 e 10 mM de cafeína após o término da motilidade durante a liquefação e mantidas a 35°C. Motilidade e vigor foram avaliados por 5 h. Para o experimento II, após liquefação, o sêmen foi diluído na fração-B (fração-A + gema de ovo e glicerol) dos diluidores, envasado, resfriado a 4°C (2 h), em seguida a -60°C (20 min), antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido. O sêmen foi descongelado a 35°C (5 min). Os resultados foram expressos como média ± EP. O efeito dos diluidores foi comparado pelo teste t Student e ANOVA (p _ 0,05). O coágulo liquefez em 4,5 ± 1,7 e 2,8 ± 1,1 horas (p < 0,05) em TES-TRIS e ACIN respectivamente. O volume médio, concentração, percentual de espermatozóides normais e vivos antes de congelação foi respectivamente 0,6 ± 0,2 mL; 1.806 ± 367 x 106 espermatozóides/mL; 81,3 ± 2, e 40,1 ± 3,3 (TES-TRIS) e 30,9 ± 4 (ACIN). A duração da motilidade em TES-TRIS e ACIN foi, respectivamente, 5 ± 1,4 e 1 ± 0,5 h. A motilidade média nesse período foi 38 ± 10% (TES-TRIS) e 18 ± 9% (ACIN). Foi verificado aumento da motilidade após adição de cafeína apenas nas amostras diluídas em ACIN 6 mM (21 ± 9%) e ACIN 10 mM (22 ± 11) (p > 0,05). O percentual de espermatozóides vivos após descongelação foi 26,2% em TES-TRIS e 13,2% em ACIN (p < 0,05). Para a criopreservação de sêmen de C. apella TES-TRIS é mais indicado e pode, assim como ACIN + cafeína, ser empregado na inseminação artificial com sêmen a fresco diluído.

Expressão gênica e viabilidade de folículos ovarianos pré-antrais de Sapajus apella congelados e cultivados in vitro

O objetivo do presente estudo foi desenvolver um protocolo de congelação para a preservação de folículos pré-antrais de Sapajus apella (macaco-prego). Para este fim, fragmentos ovarianos foram expostos à diferentes soluções crioprotetoras, adicionadas ou não por antioxidantes (selênio e trolox), congelados e cultivados in vitro por 24/horas. Análises morfológicas, ultraestruturais, de viabilidade e estresse oxidativo foram desenvolvidas. A coleta do material foi realizada no Centro Nacional de primatas (CENP) e nove macacos-prego maduras e saudáveis foram usadas. Biopsias ovarianas de 1 mm³ foram coletadas por laparoscopia exploratória. Os folículos coletados foram classificados de acordo com sua fase de desenvolvimento em primordial, primário ou secundário. A viabilidade folicular foi observada através da utilização de marcadores fluorescentes (Iodeto de propídeo e Hoechst) qRT-PCR foi usado para avaliar a expressão de hormônios e fatores de crescimento. O TEAC foi usado para mensurar o estresse oxidativo no tecido. Os resultados mostraram que a solução congelação contendo trolox não afetou a morfologia folicular e expressão gênica. A criopreservação resultou em elevadas taxas de viabilidade folicular quando o trolox estava presente na solução, porém a expressão de genes codificando BMP4 e KL foi negativamente afetada. Nossos achados mostraram um efeito favorável da adição do trolox à solução de congelação. Entretanto, a viabilidade folicular e expressão gênica foram afetados após cultivo in vitro.

Ativação partenogenética de oócitos maturados in vitro de Cebus apella

O objetivo deste trabalho foi avaliar a maturação oocitária in vitro (MIV) na espécie C. apella, relacionando com a expansão das células do cumulus e promovendo a produção in vitro de embriões (PIVE), por meio da ativação partenogenética e fecundação in vitro (FIV). Os oócitos puncionados dos folículos antrais medindo 2-9 mm de diâmetro foram classificados em desnudos (OD), com poucas células do cumulus (PCC) e complexo cumulus-oophorus intacto (CCO intacto). A expansão das células do cumulus foi analisada nos tempos de 0, 36 e 40 h de MIV e classificada em cinco categorias de expansão. A competência meiótica nos oócitos foi verificada pela extrusão do 1º corpúsculo polar (CP) após 40 h de MIV. Os oócitos foram divididos em 3 grupos para PIVE: grupo controle (FIV), ativação partenogenética utilizando 5 μM de ionomicina em associação com 2 mM de 6-DMAP ou em associação com 50 μM de roscovitina. Para a FIV, os espermatozóides obtidos do coágulo seminal, foram diluídos em água de coco em pó (ACP-118®) e submetidos ao resfriamento para serem levados posteriormente ao cultivo in vitro com os oócitos. O aumento no tempo da MIV e a presença de várias células do cumulus associadas aos oócitos proporcionaram maior expansão das células do cumulus, pois somente os CCO intactos alcançaram a expansão total em 40 h de MIV (p < 0,005). A presença das células do cumulus nos oócitos (PCC e CCO intactos) maturados in vitro por 40 h promoveu a competência meiótica (metáfase II) significamente mais elevada que os OD (p < 0,005). Após 6 h de resfriamento em ACP-118® e separação pelo método do swin-up, os espermatozóides utilizados na FIV possuíam 80% de motilidade e vigor 4. O tratamento com ionomicina/roscovitina promoveu a extrusão do 2º CP e formação pronuclear e com ionomicina/6-DMAP formou pronúcleos, sem extrusão do 2º CP. O protocolo utilizando a ionomicina/6-DMAP e da FIV originou as primeiras divisões embrionárias, observada pela taxa de clivagem. Os resultados encontrados sugerem que em C. apella a presença e a expansão total das células do cumulus estão relacionadas com a competência oocitária. A utilização dos oócitos maturados in vitro e dos espermatozóides diluídos e resfriados em ACP-118® promoveu a PIVE por diferentes métodos nesta espécie.

Ecobiometria e Triplex Doppler para a avaliação da vitalidade fetal em Cebus apella

Os objetos do trabalho foram: 1) realizar a ecobiometria do concepto para acompanhar o crescimento fetal e determinar a idade gestacional em Cebus apella; 2) descrever o momento em que os órgãos do feto são observados; 3) realizar a sexagem fetal; 4) avaliar o fluxo sanguíneo das artérias uterinas (AU) e umbilical (Aum), mensurando os índices de resistividade (IR) e pulsatilidade (IP); 5) observar a presença ou ausência da incisura protodiastólica (IPD) e do componente diastólico nas ondas de fluxo sanguíneo das AU e Aum, respectivamente, durante a gestação em C. apella. Seis fêmeas adultas da espécie C. apella foram selecionadas e, posteriormente, condicionadas para os procedimentos de colpocitologia ou contenção química. Para o monitoramento do ciclo reprodutivo das fêmeas e crescimento folicular, foram realizados exames colpocitológicos e ultrassonografia (US), respectivamente, para a escolha do melhor dia da monta natural ou inseminação artificial. Vinte dias após a cópula ou inseminação, era realizado o diagnóstico da gestação por meio da US. O dia de cada exame em relação ao parto foi contado em retrospecto (nascimento = dia 0). Os exames ultrassonográficos foram feitos nos dias -133, -113, -83, -53, -21 e -1 antes do parto. A US bidimensional em modo B foi utilizada para mensurar o saco gestacional do dia - 133 até -113; os diâmetros biparietal, fronto-occiptal, circunferência da cabeça e circunferência abdominal do dia -113 a -1; e comprimento do fêmur do dia -53 até -23, mostrando o aumento desses parâmetros com o avanço da gestação. O coração e o estômago começaram a ser visualizados no dia -113 e, os demais órgãos e a sexagem no dia -83. O Triplex Doppler foi empregado para avaliar o fluxo sanguíneo durante o período gestacional, mostrando uma diminuição nos IR e IP das AU e Aum, do dia -133 a -1, bem como observar o desaparecimento da IPD (dia -1) e aparecimento do componente diastólico (dia -53) na onda de fluxo sanguíneo das AU e Aum, respectivamente. Entre os dias -113 a -1, a média da freqüência cardíaca fetal, obtida pelo Triplex Doppler, foi de 189 ± 2,43 bpm. O presente trabalho permitiu determinar a idade gestacional, avaliar o crescimento anatômico do feto, descrever o momento em que os órgãos são visualizados e realizar a sexagem em C. apella. Constatou-se, também, que o fluxo sanguíneo das AU e Aum são importantes parâmetros para avaliar a vitalidade fetal em C. apella.

Escola experimental de primatas: análise da coerência entre pressupostos e práticas empíricas

O desenvolvimento de modelos animais para o estudo de problemas no desenvolvimento cognitivo humano pressupõe como fator principal a existência de certa homologia de processos comportamentais entre os repertórios do modelo e dos humanos. A Escola Experimental de Primatas (EEP) tem utilizado o macaco-prego (Cebus ssp.) como um modelo animal para investigar a aquisição de repertórios relacionais generalizados em humanos. Este trabalho avaliou os estudos empíricos da EEP no sentido de verificar a coerência entre seus pressupostos teóricos e sua prática empírica, especialmente no que diz respeito à existência de homologias de processos comportamentais entre macacos-prego e seres humanos. Ao se analisar a 1) origem dos objetivos e dos procedimentos dos estudos (a maioria provém de estudos com animais); 2) se os resultados esperados foram alcançados ou não (de forma geral, resultados positivos em relação aos objetivos propostos); e 3) se nos estudos da EEP é discutida a questão do modelo animal e/ou a aplicabilidade dos procedimentos utilizados nos estudos para humanos (não é), verificou-se que não são apresentados dados empíricos que sustentem a homologia sugerida na proposta teórica norteadora da EEP. Esses resultados demonstram que a prática científica da EEP tem avançado enquanto pesquisa básica sobre a aprendizagem de repertórios relacionais generalizados para macacosprego, mas ainda sem evidências de transferência para o estudo desse fenômeno em humanos. Sugere-se que o caminho a seguir pode ser: 1) desenvolver estudos empíricos que validem a homologia de processos comportamentais entre alguns repertórios dos macacos-prego e humanos; e 2) dar início à aplicação dos achados da pesquisa básica da EEP no desenvolvimento de procedimentos para ensinar repertórios relacionais para pessoas com atraso no desenvolvimento cognitivo.

Divergent evolution and purifying selection of the H (FUT1) gene in New World monkeys (Primates, Platyrrhini)

In the present study, the coding region of the H gene was sequenced and analyzed in fourteen genera of New World primates (Alouatta, Aotus, Ateles, Brachyteles, Cacajao, Callicebus, Callithrix, Cebus, Chiropotes, Lagothrix, Leontopithecus, Pithecia, Saguinus, and Saimiri), in order to investigate the evolution of the gene. The analyses revealed that this coding region contains 1,101 nucleotides, with the exception of Brachyteles, the callitrichines (Callithrix, Leontopithecus, and Saguinus) and one species of Callicebus (moloch), in which one codon was deleted. In the primates studied, the high GC content (63%), the nonrandom distribution of codons and the low evolution rate of the gene (0.513 substitutions/site/MA in the order Primates) suggest the action of a purifying type of selective pressure, confirmed by the Z-test. Our analyses did not identify mutations equivalent to those responsible for the H-deficient phenotypes found in humans, nor any other alteration that might explain the lack of expression of the gene in the erythrocytes of Neotropical monkeys. The phylogenetic trees obtained for the H gene and the distance matrix data suggest the occurrence of divergent evolution in the primates.

Comparison of two computerized procedures for the assessment of color discrimination in Cebus apella

Color vision consists of the discrimination of objects based on their spectral composition. Among primates, the majority of Platyrrhini monkeys are estimated to have polymorphic and sex-linked dichromacy. The objective of this study was to compare the results produced by different equipment and software for the assessment of tri- and dichromatic conditions in one male and two female Cebus apella. Three experiments were programmed. In Experiment 1, verifying the trichromatic condition of one female subject and dichromatic condition of the remainder of the subjects was possible using an adapted version of the Cambridge Colour Test. Experiment 2 confirmed the results of Experiment 1 using a different array of stimuli of the same test. Experiment 3, which produced results similar to Experiment 2, consisted of a test developed for a standard computer system using stimuli with color properties similar to the ones used in the previous experiment. Favorable conditions for the assessment of color vision in Platyrrhini can be built with low-cost equipment and software. Once data have been gathered with additional subjects and new stimulus arrangements have been tested and confirmed, the procedure can be used for the evaluation of other Platyrrhini species for which behavioral color discrimination data are currently lacking.

Mechanical isolation of capuchin monkey (Cebus apella) preantral ovarian follicles

O presente trabalho objetivou adaptar um procedimento mecânico para o isolamento de folículos pré-antrais a partir de ovários de Cebus apella. Para isso, foi testado o efeito do intervalo de cortes seriados do tissue chopper sobre o número de folículos pré-antrais isolados a partir de ovários (n=6) de três fêmeas de C. apella, duas pré-púberes e uma adulta. Os ovários foram divididos em quatro partes iguais e fragmentados com auxílio de um tissue chopper, ajustado para a realização de secções seriadas a intervalos de 250, 500, 750 e 1000µm, respectivamente. Os folículos isolados foram contados em câmara de Neubauer e classificados em primordiais, primários e secundários. O número (média ± EP) de folículos pré-antrais isolados de 1/4 de ovário variou de 68.330+17.590, no intervalo de corte de 1.000µm, a 300.830+111.460, no intervalo de corte de 500µm, o de melhores resultados. O diâmetro médio dos folículos pré-antrais isolados variou de 11,6µm a 27, 8µm.

Comparação entre técnicas de aferição da temperatura corpórea em micos-estrela cativos (Callithrix penicillata) e sua relação com parâmetros hematológicos, peso corporal e umidade e temperatura do ambiente

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015.

Comparação entre técnicas de aferição da temperatura corpórea em micos-estrela cativos (Callithrix penicillata) e sua relação com parâmetros hematológicos, peso corporal e umidade e temperatura do ambiente

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015.

Influência da disponibilidade sazonal e da composição química de itens alimentares no consumo do macaco-prego

Pós-graduação em Biologia Animal - IBILCE

Ecologia, comportamento e associações poliespecíficas do macaco-de-cheiro (Saimiri sciureus), Amazônia Oriental

Saimiri sciureus é uma espécie de primata amplamente distribuída pela Bacia Amazônica. Contudo, há poucos estudos feitos em ambiente natural na Amazônia brasileira envolvendo aspectos ecológicos e/ou comportamentais da espécie e praticamente nenhum sobre suas associações com outras espécies. Neste trabalho foram estudados os padrões gerais da ecologia e do comportamento de dois grupos de S. sciureus e suas associações com outras espécies de primatas no Mosaico de Unidades de Conservação da Usina Hidrelétrica de Tucuruí. Os sítios de estudo foram a Ilha de Germoplasma (IG) e a Zona de Preservação da Vida Silvestre Base 4 (B4). Os dados foram coletados pelos métodos de varredura instantânea e ad libitum por seis meses entre março e outubro de 2009. A área de uso dos grupos correspondeu a aproximadamente 75 ha na B4 e 77,5 ha na IG. No uso do espaço vertical, houve preferência pelos estratos inferiores e médios. Além disso, houve um marcado padrão no uso dos estratos ao longo o dia, com maior frequência de uso dos estratos mais altos nas duas primeiras horas de atividades, dos estratos mais baixos das 10 às 14 horas e dos estratos intermediários no final do dia. Os comportamentos de forrageio (50% IG; 49% B4) e locomoção (29% ambos) foram mais frequentes que alimentação (12% IG; 15% B4), interação social (6% IG; 4% B4) e descanso (3% para ambos), concordando com outros estudos na Amazônia. A dieta foi predominantemente frugívora (75% B4, 71% IG), diferindo de uma série de estudos que caracterizaram todo o gênero como altamente insetívoro. As espécies vegetais mais importantes foram Attalea maripa no período chuvoso e Inga spp. no período seco, para ambos os grupos. A frequência de associação foi 100% do tempo (B4) e 49% (IG) com Cebus apella, 20% (B4) com Chiropotes satanas e 3% (IG) com Chiropotes utahicki. Houve encontro com Alouatta belzebul e Saguinus niger nos dois sítios, com Aotus azarae na B4 e Callicebus moloch na IG. O grupo da IG passou mais tempo em associação durante a estação chuvosa. O tempo em associação com C. satanas foi maior no período seco, sem diferença sazonal para C. utahicki e C. apella. Houve diferença entre S. sciureus, C. apella e C. satanas no uso do espaço vertical, no tipo de suporte e nos itens alimentares explorados. Os macacos-de-cheiro apresentaram nicho maior que os macacos-prego para uso de espaço vertical e itens alimentares, e os macacos-prego apresentaram nicho maior para tipo de suporte. A maior sobreposição de nichos nas três dimensões medidas foi entre C. apella e S. sciureus.

"Avaliação andrológica e criopreservação de sêmen de Ateles (macaco-aranha) mantidos em cativeiro"

A biotecnologia aplicada à reprodução é uma ferramenta também importante para conservação de espécies ameaçadas de extinção. Algumas espécies de primatas não-humanos neotropicais têm sido amplamente agredidas por ações antrópicas, ocasionando a inclusão de 26 espécies brasileiras na lista oficial de animais ameaçados de extinção do IBAMA. As espécies de primatas não humanos Ateles belzebuth e Ateles paniscus, participantes do gênero Ateles, popularmente chamados de macaco-aranha, encontram-se particularmente ameaçadas. Poucos estudos são realizados acerca do status populacional destas espécies e menos ainda sobre dados reprodutivos e reprodução assistida. O presente trabalho pretendeu avaliar as características andrológicas de exemplares de primatas não humanos do gênero Ateles em cativeiro e comparar a performance dos diluentes TES e CEBRAN II, este último à base de ringer lactato, como criopreservadores de sêmen destas espécies. O experimento foi realizado utilizando 06 exemplares machos de primatas não humanos do gênero Ateles (02 exemplares de Ateles marginatus e 04 exemplares de Ateles paniscus) mantidos sob as mesmas condições de cativeiro no Centro Nacional de Primatas (CENP-SVS/MS), em Ananindeua, Pará. Os animais utilizados foram submetidos a exame clínico-andrológico e biometria testicular, antes da colheita seminal realizada por eletroejaculação. Foram realizadas avaliações físicoquímicas e de patologias espermáticas, além de avaliação de motilidade e vigor no sêmen a fresco e pós-diluição com os diluentes TES e CEBRAN II. As alíquotas de sêmen diluídas com os dois diluentes, na proporção 2:1, foram envasadas em minitubos com capacidade para 0,25 ml e criopreservados em nitrogênio líquido. Após descongelação, as doses envasadas foram avaliadas em teste de termo-resistência (T.T.R.). As médias de volume e concentração espermáticas obtidas foram, respectivamente, 1,94 ml (± 0,83) e 3.020.000 sptz/ml (±275,97). O pH 8 foi observado em todas as amostras e todos os exemplares apresentaram coagulação seminal. O índice de patologias espermáticas encontrados foi alto (69,8% ± 9,05) indicando que pode haver influência da sazonalidade reprodutiva nas características seminais encontradas nos animais deste experimento. Os resultados de avaliação de motilidade e vigor do sêmen a fresco, diluído e no T.T.R. não puderam ser analisadas estatisticamente, pois somente o sêmen de 03 animais demonstrou espermatozóides viáveis pós-descongelação, com resultados que sugerem que o diluente TES apresenta melhor eficiência na preservação de sêmen de Ateles do que o diluente CEBRAN II.

Ultra-sonografia ginecológica em macaco-da-noite (Aotus azara infulatus) Aotidae - Primates

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)