Expressão gênica e viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de córtex ovarianos cultivados in vitro de macaco-prego (Sapajus apella)

O objetivo desse trabalho foi analisar a ativação e o crescimento de folículos préantrais de Sapajus apella, submetidos a um sistema de cultivo in vitro em curto-prazo. Nesse sentido, dois experimentos foram realizados neste trabalho. Experimento I: exposição à fresco e à crioprotetores de biopsias de fragmentos do córtex ovariano. Ambos os fragmentos ovarianos foram submetidos à extração total de RNA e síntese de cDNA. Após a amplificação do cDNA por PCR em tempo-real (RT-PCR), os software GeNorm, bestkeeper e Normfinder foram usados para avaliar a estabilidade dos genes GAPDH (glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase), HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) e TBP (TATA-binding protein). Experimento II: o tecido do córtex ovariano de quatro fêmeas foi oletado e dividido em nove pedaços de 1 mm³. Um fragmento ovariano (grupo controle) foi imediatamente dividido em dois pedaços, os quais foram destinados para análise da viabilidade ou por RT-PCR. Os 8 fragmentos restantes foram individualmente cultivados in vitro em um meio constituído de TCM suplementado com 100 ng/mL EGF (T1), com adição de 10 μM de BME (T2), 100 ng/mL de BMP4 (T3), 25 IU de PMSG (T4), 10 μM de BME e 100 ng/mL de BMP4 (T5), 10 μM de BME, 25 IU de PMSG (T6), 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T7) ou 10 μM de BME, 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T8). Os resultados demonstraram que no tecido do córtex ovariano de S. apella, os genes HPRT1 e TBP foram os mais apropriados como genes de referência, podendo ser usados como parâmetro para normalizar dados em estudos futuros. Ao contrário, o GAPDH se apresentou como menos estável dos genes de referencia testados. Após o cultivo in vitro, todos os tratamentos alcançaram percentuais similares da viabilidade de folículos pré-antrais. O tecido ovariano cultivado na presença de GF+BME/BMP4/PMSG resultou no aumento da taxa de ativação e crescimento folicular, assim como no aumento da expressão de AMH, BMP15 e GDF9, genes conhecidos como indicadores específicos de desenvolvimento folicular. Dessa forma, o HPRT1 e TBP são os genes de referência mais estáveis, na exposição à crioprotetores, a fresco e no o cultivo de tecidos de córtex ovariano de S. apella. Os folículos pré-antrais são capazes de desenvolverem-se in vitro quando cultivados em meio suplementado com PMSG, BME e BMP4. A viabilidade folicular, entretanto, permaneceu independentemente do meio de cultivo in vitro e o uso de fatores de crescimento, como marcadores de desenvolvimento folicular, foi crucial para identificar o melhor meio de cultivo in vitro.

ABSTRACT: The aim of the present study was to investigate the stability of three reference genes in the ovarian tissue of capuchin monkeys (Sapajus apella) and to develop a short-term in vitro culture system for the activation and growth of preantral follicles from capuchin monkeys. To this end two experiment were conducted as follow. Experiment I: Fresh and cryoprotectant exposed ovarian biopsies were used. Both fresh and exposed ovarian tissues were subjected to total RNA extraction and synthesis of cDNA. After amplification of cDNA by real-time PCR, the GeNorm, Bestkeeper and Normfinder software were used to evaluate the stability of glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) and TATA-binding protein (TBP). Experiment II: Ovarian tissue from four healthy mature females were collected and divided into nine ovarian cortical pieces of 1 mm³. One ovarian fragment (control) was immediately divided in two pieces, which were subjected to viability analysis or qRT-PCR. The remaining 8 fragments were individually cultured in vitro in a medium consisting of TCM supplemented with 100 ng/mL EGF (T1), either or not added with 10 μM BME (T2), 100 ng/mL BMP4 (T3), 25 IU PMSG (T4), 10 μM BME and 100 ng/mL BMP4 (T5), 10 μM BME, 25 IU PMSG (T6), 100 ng/mL BMP4, 25 IU PMSG (T7) or 10 μM BME, 100 ng/mL BMP4, 25 IU PMSG (T8). Results demonstrated that, in the ovarian tissue from capuchin monkeys, HPRT1 and TBP were the most suitable reference genes and thus could be used as parameters to normalize data in future studies. In contrast, GAPDH appeared as the least stable gene among the tested reference genes. After in vitro culture, all treatments resulted in similar percentages of viable preantral follicles. Ovarian tissue cultured in the presence of EGF + BME/BMP4/PMSG resulted in an increased rate of follicular activation and growth, as well as in the up regulation of AMH, BMP15 and GDF9, specific markers of follicular development. In conclusion, HPRT1 and TBP are the most stable reference genes in fresh and cryoprotectant exposed ovarian tissue from capuchin monkeys. Preantral follicles are able to develop in vitro when cultured in a medium supplemented with PMSG, BME and BMP4. Follicular viability, however, was maintained independently on the culture medium. The use of growth factors as markers of follicular development was crucial to identify the best culture medium.