Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Synthese von Sialyl-Lewis-X-Mimetika durch stereoselektive ortho-C-Glycosylierung von Phenolen

Ziel der Arbeit war es, Sialyl-LewisX-Mimetika auf Basis ortho-C-glycosylierter Phenole als Inhibitoren für die Selektin-Ligand-Wechselwirkungen zu synthetisieren. Dazu wurde zunächst die Stereoselektivität der ortho-C-Mannosylierung untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass bei der Umsetzung von Phenolen mit dem benzylgeschützten Mannosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf selektiv das β-C-Mannosid erhalten wurde. Gleichzeitig konnte anhand der NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass die in der Literatur beschriebenen α-C-Mannoside von Phenolen tatsächlich β-konfiguriert sind. Wenn Naphthole als Glycosylakzeptoren verwendet wurden, konnten durch Modifikation des Promotors auch die für die Synthese der Mimetika benötigten α-C-Mannoside erhalten werden, wobei ZnCl2 als Promotor die besten Ergebnisse lieferte. Allerdings zeigten die synthetisierten α-C-Mannoside und α-C-Galactoside eine Inversion des Pyranoseringes und lagen in der ungewöhnlichen 1C4-Konformation vor.rnAnschließend konnte auf diese Weise das durch Docking-Studien gefundene Mimetikum (2S)-3-Cyclohexyl-2-[7-hydroxy-8-(α-D-mannosyl)naphthalin-2-yloxy]propionsäure syntheti-siert werden. Es besaß jedoch in Zelladhäsionstests keine ausreichende Aktivität bei der Inhibierung der Selektin-Ligand-Wechselwirkung. Bei den ursprünglichen Dockingstudien war allerdings von der gewohnten 4C1-Konformation ausgegangen worden. Spätere NMR-Experimente und DFT-Berechnungen zeigten, dass das Mimetikum tatsächlich in der 1C4-Konformation vorlag und es deshalb nicht aktiv war. Die synthetisierten Stereo- und Regioisomere zeigten in Zelladhäsionstests ebenfalls keine Aktivität.rnVersuche, die α-1-C-Mannosylnaphthole zu den benötigten 1-C-2-O-Diglycosyl-naphthalinen umzusetzen waren nicht erfolgreich, da die phenolische OH-Gruppe sterisch zu sehr abgeschirmt war, um unter milden Reaktionsbedingungen glycosyliert zu werden, bzw. die α-1-C-Mannosylnaphthaline unter drastischeren Reaktionsbedingungen nicht stabil waren. Daher wurde 1-(2′,3′,4′,6′-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-2-naphthol mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf zum ersten synthetischen 1-C-2-O-Diglycosyl-phenol umgesetzt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen sollte das erhaltene 1-Galactosyl-2-O-mannosyl-naphthalin enzymatisch zum Sialyl-LewisX-Mimetikum verlängert werden. Es wurde vom Enzym jedoch nicht als Substrat erkannt. Versuche zur chemischen Anbindung des Säurebausteins stehen noch aus.rn

Modulare Synthese von Sialyl-Lewis X-Mimetika als Selektin-Liganden

Zelladhäsions- und Zellerkennungsphänomene spielen eine entscheidende Rolle im biologischen Geschehen: So findet die Kommunikation zwischen Zellen zu einem großen Teil zwischen membranständigen Adhäsionsmolekülen und ebenfalls membranständigen Liganden auf Nachbarzellen statt. Zu diesen Adhäsionsmolekülen gehören die Selektine, die von fundamentaler Bedeutung für die Bekämpfung von Entzündungskrankheiten und damit für die Funktionsweise unseres Immunsystems sind. Tritt eine Entzündung in unserem Körper auf, so sind Selektine an Adhäsionsprozessen beteiligt, die zur Auswanderung von Leukozyten aus dem Blutstrom in das entzündete Gewebe führen. Diese auswandernden Zellen enthalten eine Vielzahl von Wirkstoffen, die Krankheitserreger bekämpfen, aber auch körpereigenes Gewebe angreifen können. Viele Krankheitsbilder, die mit akut oder chronisch entzündlichen Prozessen einhergehen, hängen mit einer Dysregulation der Selektine zusammen. In diesen Fällen werden übermäßig Selektine exprimiert und es kommt zu einer lokal überschießenden Akkumulation von Leukozyten, die zu Schädigungen von gesundem Gewebe führen kann. rnZu diesen Krankheiten gehören z.B. die rheumatoide Arthritis, die myocardialen Ischämie, Psoriasis sowie Asthma und Allergien. Auch bei der Abstoßung von Transplantaten und Tumormetastasierung wurde eine Beteiligung der Selektine nachgewiesen. Eine Strategie gegen diese unerwünschten Effekte ist die selektive Inhibierung der Selektine, welche aufgrund der bedeutenden Rolle der Selektine in der Genese zahlreicher Krankheiten, von großem pharmazeutischen Interesse ist. rnIn der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung chemischer Synthesen von Verbindungen beschrieben, welche selektininhibierende Eigenschaften aufweisen sollen. Solche sog. Mimetika, die wie die natürlichen Liganden mit den Selektinen wechselwirken, sind nicht nur potenzielle Medikamente, sondern können auch durch veränderte Affinität zur Aufklärung von selektinvermittelten Zelladhäsionsprozessen dienen.rn

Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin

Kohlenhydrate dienen nicht nur der Ernährung oder der Stabilisierung von Zellwänden, sondern sie sind auch von essentieller Bedeutung für Zell-Zell-Wechselwirkungen im Organismus. Damit sind sie von besonderem Interesse für die Behandlung von Entzündungen sowie tumorösen Erkrankungen, die auf Wechselwirkungen zwischen bestimmten Kohlenhydraten und Rezeptoren, Selektine genannt, basieren. Die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin“ befasst sich mit der Synthese und der Modifizierung des natürlich vorkommenden Selektin-Liganden Sialyl-Lewisx und seinen potentiell mimetischen Strukturen auf Basis von Gemischen der an der Bindung beteiligten Kohlenhydrate sowie von sulfatierten Einheiten. Um im Organismus eine verstärkte Bindung an die zu adressierenden Rezeptoren und eine erhöhte Zirkulationsdauer zu erreichen, wurden die geeignet funktionalisierten Liganden mittels reaktiver Polymere auf Basis von Pentafluorphenyl-Reaktivestern im Rahmen einer polymeranalogen Umsetzung an ein definiertes Methacrylamid-Polymer gebunden.Um die biologische Wirksamkeit der synthetisierten Polymere zu überprüfen, wurden Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (SPR-Messungen) durchgeführt. Dabei zeigte sich bei den verschiedenen Selektinen eine unterschiedlich hohe Affinität der Sialyl-Lewis x sowie der mimetischen Polymere. Es konnten bei E-Selektin die geringsten, bei L-Selektin mittlere und bei P-Selektin die höchsten Affinitäten im unteren nanomolaren Bereich festgestellt werden.

Synthese C-glycosidischer und N-methylierter Glycosylaminosäuren für den Aufbau von Mimetika tumorassoziierter MUC1-Glycopeptidantigene unter Verwendung mikrostrukturierter Reaktoren

Zur Synthese hydrolysestabiler MUC1-Antitumorvakzine wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein Verfahren zur effizienten N Methylierung von Fmoc-Aminosäuren entwickelt. Die Synthese erfolgte in einer zweistufigen Umsetzung über Oxazolidinone unter Verwendung eines Tube-in-Tube-Durchflussreaktors mit einer semipermeablen Membran aus Teflon® AF 2400. In diesem Tube-in-Tube-Reaktor wurde in der ersten Stufe das Modellsubstrat Fmoc-Alanin bereits nach 2 h annähernd quantitativ in das entsprechende Oxazolidinon umgesetzt. In der zweiten Stufe wurde mit TFA erstmals eine Flüssigkeit durch eine solche Membran des Tube-in-Tube-Reaktors eingeleitet und lieferte innerhalb einer Stunde zahlreiche aliphatische, aromatische und funktionalisierte N-Methylaminosäuren in hohen Ausbeuten.rnDes Weiteren wurden erstmals sensible Glycosylaminosäuren, darunter auch TN Antigen-Strukturen, N-methyliert. Sie dienen als Bausteine für die Synthese von MUC1-Antitumorvakzinen. Neben Fmoc-N-Methyl-TN-Threonin konnten die Fmoc-geschützten N-Methyl-TN-Serin, N-Methyl-Sialyl-TN-Threonin sowie zwei N-Methyl-C Glycosylaminosäuren und in guten Ausbeuten erhalten werden. Anschließend wurde das N methylierte TN-Threonin gezielt in die tandem repeat-Sequenz des MUC1 in einer Festphasenpeptidsynthese eingebaut. Um einen direkten Vergleich bezüglich der N Methylierung im MUC1-Glycopeptide und dem darauf folgenden Einfluss auf die Tumorselektivität der resultierenden Vakzine erhalten zu können, wurde zudem ein Referenzpeptid aufgebaut. Zur Vollendung der Vakzinsynthese erfolgte die Konjugation beider Glycopeptidantigene an die jeweiligen BSA- und TTox-Proteine. rnEin alternativer Zugang zu hydrolysestabilen Glycopeptidbausteinen wurde im letzten Teil der Arbeit über die Synthese von α C Glycosylaminosäuren erarbeitet. Der entwickelte Syntheseweg basiert auf einer Ugi-Vier-Komponenten-Reaktion aus Aldehyd, Amin, Nitril und Carbonsäure. Als benötigte Aldehydkomponenten wurden ein einfaches Galactose- sowie ein Galactosamin-Derivat verwendet. Zum Aufbau des C-glycosidischen Grundgerüsts wurde eine Mikrowellen-unterstützte C-Allylierungsvariante im Durchfluss realisiert. Die Galactose- und Galactosaminaldehyde wurden danach mit chirale Glycosylaminen umgesetzt.

Charakterisierung funktioneller Domänen für GABA und Furosemid auf GABA A-Rezeptoren

ZUSAMMENFASSUNGDie schnelle inhibitorische Neurotransmission im Säugerhirn ist wesentlich GABA-erg vermittelt.Neben GABA binden u.a. Picrotoxinin und TBPS (tert-Butylbicyclophosphorothionat) am GABAA-Rezeptor. Die Bindung von [35S]TBPS wird durch alle am GABAA-Rezeptor bindenden Substanzen moduliert. Zur Untersuchung der GABAA-Rezeptor-Funktionen wurden TBPS-Bindungsstudien an rekombinant exprimierten Rezeptoren in vitro und nativen Rezeptoren in situ verwendet.Die alpha-Untereinheiten spielen bei der gehirnarealspezifischen Auswirkungen verschiedener GABA-Mimetika, der Charakterisierung subtypspezifischer Substanzen und der Ausprägung der GABA-Sensitivitäten eine große Rolle. Für die Detaillierung der höheren GABA-Sensitivität alpha6-enthaltender Rezeptoren wurden Chimären und Punktmutationen zwischen den Untereinheiten alpha1 und alpha6 hergestellt. Nach Austausch des Asparagins 188 in der alpha1-Untereinheit durch das alpha6-entsprechende Lysin zeigten Rezeptoren in Kombination mit den Untereinheiten beta3 und gamma2 eine erhöhte GABA-Sensitivität gegenüber dem Wildtyp. Dementsprechend wiesen alpha6-enthaltende Rezeptoren mit der umgekehrten Punktmutation L187N eine geringere GABA-Sensitivität auf. Furosemid wirkt ausschließlich auf alpha6beta2/3-enthaltende GABAA-Rezeptors GABA-agonistisch. [35S]TBPS-Bindungsstudien an chimären alpha1/alpha6-Rezeptoren weisen auf eine niedrigpotente Bindungsstelle für Furosemid im extrazellulären Sequenzabschnitt zwischen der Aoc I-Schnittstelle und der TM3-Region hin. Die Substanz 4 PIOL zeigte subtypspezifischen Charakter am GABAA-Rezeptor. In den [35S]TBPS-Autoradiographien und den Bindungsstudien an Membranen wirkte 4 PIOL auf alpha6-enthaltende Rezeptoren schwach GABA-mimetisch bzw. agonistisch, in den [35S]TBPS-Bindungsstudien an alpha6-enthaltenden rekombinanten Rezeptoren schwach negativ modulatorisch oder antagonistisch.

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Diglycosylierte Heterocyclen als potentielle Selektinliganden

In der vorliegenden Arbeit sollten diglycosylierte Heterozyklen als Grundbausteine zur Darstellung eines Mimetikums des Tetrasaccharids Sialyl LewisX verwendet werden. Dabei standen die pharmakokinetische Stabilität sowie der möglichst einfache Zugang zu den Strukturen im Vordergrund. Außerdem sollte die nachträgliche Anbindung an eine ESL-1 Partialsequenz zum Aufbau von Glycopeptiden und deren Verknüpfung zu dendrimeren Strukturen möglich sein. rnIn einem ersten Ansatz sollten C,N-diglycosylierte Isoindolone bzw. Isochinolone aufgebaut werden. Es konnte anhand mehrerer Beispiele gezeigt werden, dass die elektrophile Cyclisierung von o-Alkinylbenzamiden mit Iod nicht die wie in der Literatur beschriebenen Lactame liefert, sondern ein Angriff des Carbonylsauerstoffs zu den entsprechenden Isobenzofuran-1(3H)-iminen bzw. 1H-Isochromen-1-iminen führt. Die Lactame können jedoch durch Reaktion der o-Alkinylbenzamide mit Tetrabutylammoniumfluorid erhalten werden.rnDie zweite Route führte durch 1,3-dipolare Cycloaddition zu 1,4 disubstituierten 1,2,3-Triazolen. Hier gelang der Aufbau eines vollständig deblockierten, mit einem Azid funktionalisierten Trisaccharid Analogons, welches durch enzymatische Sialylierung zum Sialyl LewisX Mimetikum verlängert wurde. Diese Struktur konnte in einer weiteren 1,3-dipolaren Cycloaddition mit einer ebenfalls synthetisierten, leicht abgewandelten Partialsequenz des ESL-1 zu einem Glycokonjugat umgesetzt werden. Des Weiteren gelang der Aufbau zweier teilweise deblockierter Tetrasaccharid Mimetika, wiederum durch enzymatische Elongation.rnAußerdem wurden Versuche unternommen di C-Glycoside durch samariumvermittelte Kupplung zu synthetisieren.rn

Synthesen von C-glycosylierten Aminosäuren und Peptiden unter Einsatz speziell konstruierter Mikroreaktoren

Die chemische Synthese definierter Glycopeptidstrukturen bildet die Basis einiger vielversprechender Ansätze zur Therapie verschiedener Krankheiten. Die Entwicklung hochaffiner Selektininhibitoren könnte der Behandlung chronischer Entzündungen und zur Unterdrückung der Metastasierung von Tumoren dienen. Vollsynthetische Vakzine auf Basis glycosylierter MUC1-Partialstrukturen sollen das Immunsystem zur Bekämpfung von krankem Gewebe anregen und so perspektivisch eine Impfung gegen Krebs ermöglichen. Da die natürlich vorkommenden O-Glycoside in vivo eine begrenzte Stabilität besitzen, wurde eine Methode entwickelt, welche die modulare Herstellung von stabilen rnC-Glycosylaminosäuren als Mimetika der natürlichen Serin-, Threonin- und Tyrosin-Glycoside ermöglicht. Dazu wurden passend geschützte Kohlenhydrat-Lactone synthetisiert, die in einer mikrowellengestützten Petasis-Olefinierung unter Durchflussbedingungen in die entsprechenden exo-Glycale überführt wurden. Die Reaktionszeit konnte durch diese spezielle Reaktionsführung auf weniger als drei Minuten verringert werden, während konventionell mehrere Stunden benötigt werden. Die C-glycosidische Verknüpfung mit den entsprechenden Aminosäurebausteinen gelang durch eine Hydroborierungs-Suzuki-Kupplungs-Kaskade. Nach umfangreicher Optimierung der Reaktionsparameter ließ sich neben mehreren Monosacchariden auch ein exo-Glycal der Lactose erfolgreich in der Kupplung einsetzen. Nach verschiedenen Schutzgruppenmanipulationen wurden einige der synthetisierten Bausteine zur Synthese C-glycosylierter Partialstrukturen des Mucins MUC1 an der festen Phase herangezogen. In ELISA-Experimenten wurden die C-Glycosylpeptide von an Brustkrebsgewebe bindenden Antikörpern erkannt, die durch Vakzinierung mit ähnlichen Strukturen erhalten worden waren. Zur Synthese zweier Bausteine potenzieller Selektin-Inhibitoren wurde ein Mimetikum des in natürlichen Liganden vorkommenden Tetrasaccharides Sialyl-Lewisx synthetisiert. Bei diesem wurde die terminale Sialinsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die bei der gewählten Syntheseroute notwendige regioselektive Öffnung eines Benzylidenacetals wurde in einem Mikroreaktor durchgeführt, wodurch eine einfache Reaktionsoptimierung mit geringen Substanzmengen möglich war. Die Reaktionszeit liegt mit unter 4 Minuten deutlich unter den üblichen Werten von einer bis mehreren Stunden. In einer Block-Glycosylierung konnte das Pseudotetrasaccharid sowohl an einen C-Lactosyl-Tyrosin-, als auch an einen C-Lactosyl-Serin-Akzeptor angefügt und somit die Synthese der Zielverbindungen abgeschlossen werden. Diese Bausteine können in Zukunft als Bestandteile synthetischer Glycopeptide zum Einsatz kommen, welche Mimetika der natürlichen Selektin-Liganden darstellen sollen.rn